一種農藥殘留降解復合菌及生產方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于農藥殘留降解的復合菌菌劑及其生產方法，屬于環(huán)境微生物技術應用領域，復合菌由如下菌種組成：枯草芽孢桿菌30-40%、地衣芽孢桿菌30-40%、放線菌10-20%、反硝化細菌10-20%、光合細菌10-20%，具體產品中各微生物組合總數(shù)為100%.產品性狀為液體或固體；所述的農藥殘留降解復合菌的制備方法，包括一級種子液的制備，二級種子液發(fā)酵，生產液發(fā)酵，單獨發(fā)酵完成后將發(fā)酵液裝入貯液罐步驟；所使用的微生物以異養(yǎng)菌為主，能夠產生生物活性酶。
【專利說明】一種農藥殘留降解復合菌及生產方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于應用生物【技術領域】，涉及一種農藥殘留降解的微生物復合菌及其生產方法。
【背景技術】
[0002]農藥是農業(yè)環(huán)境的主要有機污染物全國每年使用的農藥量達50萬-60萬t，使用農藥的土地面積在2.8億hm2以上，農田平均施用農藥13.9 kg/hm2。直接進入土壤的農藥，大部分可被土壤吸附，殘留于土壤中的農藥，由于生物和非生物的作用，形成具有不同穩(wěn)定性的中間產物或最終產物無機物。噴施于作物體上的農藥，除部分被植物吸收或逸入大氣外，約有1/2左右散落于農田，又與直接施用于田間的農藥構成農田土壤中農藥的基本來源。農作物從土壤中吸收農藥，在植物根、莖、葉、果實和種子中積累，通過食物、飼料危害人體和牲畜的健康。截止2011年底，全國受污染的耕地約有1000萬hm2，有機污染物污染農田達3600萬hm2，主要農產品的農藥殘留超標率高達16%-20%;這些農藥殘留廣泛分布于土壤、水體、大氣及農產品中，難以利用大規(guī)模的工程措施消除污染。實際上，在自然界主要依靠微生物緩慢地進行降解，這是依靠自然力量、不產生二次污染的理想途徑。但自然環(huán)境復雜，單位面積內菌種的含量低，農藥生物降解的效率低和時間漫長，因此，加強農藥的生物降解研究、解決農藥對環(huán)境及食物的污染問題，是人類當前迫切需要解決的課題之一。
[0003]
本發(fā)明的目的是提供一種含多種微生物細菌的農藥殘留降解復合菌。
[0004]微生物降解農藥的過程就是通過微生物各種代謝途徑把有機農藥完全礦化或降解成無毒的其他成分，人工構建單位面積“工程菌”的種類和細菌含量，為微生物細菌降解農藥提供必要的條件。
[0005]微生物細菌降解農藥的本質是酶促反應，化合物通過一定的方式進入細菌體內，然后在各種酶的作用下，經過一系列的生理生化反應，最終將農藥完全降解或分解成分子量較小的無毒或毒性較小的化合物的過程。經過試驗表明，如莠去津作為假單胞菌ADP菌株的唯一碳源，有3種酶參與了降解莠去津的前幾步反應。第一種酶是A tzA，催化莠去津水解脫氯的反應，得到無毒的羥基莠去津，此酶是莠去津生物降解的關鍵酶；第二種酶是AtzB，催化羥基莠去津脫氯氨基反應，產生N—異丙基氰尿酰胺；第三種酶是A tzC，催化N —異丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和異丙胺。最終莠去津被降解為C02和NH3。微生物所產生的酶系，有的是組成酶系，如門多薩假單胞菌DR — 8對甲單脒農藥的降解代謝，產生的酶主要分布于細胞壁和細胞膜 組分；有的是誘導酶系，由于降解酶往往比產生該類酶的微生物菌體更能忍受異
常環(huán)境條件，酶的降解效率遠高于微生物本身，特別是對低濃度的農藥，利用降解酶作
為凈
化農藥污染的有效手段?，F(xiàn)在試驗已經證明，編碼合成這些酶系的基因多數(shù)在質粒上，如2，4 一 D農藥的生物降解，即由質粒攜帶的基因所控制。通過質粒上的基因與染色體上的基因的共同作用，在微生物體內把農藥降解。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供上述農藥殘留降解微生物復合菌的生產方法。
[0007]本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的:
一種農藥殘留降解復合菌，該復合菌各組分微生物在微生物總質量中的質量百分比為:枯草芽孢菌30~40%，地衣芽孢桿菌30~40%，放線菌10~20%，反硝化細菌10~20%，光合細菌10~20%。具體產品中所述個微生物組分之和為100%。
[0008]上述的一種農藥殘留降解復合菌，每克或沒ml該微生物復合菌中菌含量不低于
6.0X IO8CFU,蛋白酶活性不低于300U，淀粉酶海量不低于200U.上述的一種農藥殘留降解復合菌的制備方法，該方法是將各組分微生物分別培養(yǎng)再按一定比例混合制成微生物復合菌
所述的農藥殘留降解復合菌的制備方法，包括下述步驟:
a.一級種子液的制備:分別將活化的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產堿桿菌菌種接種到無菌的Ph7.0~7.5的營養(yǎng)肉湯中，放線菌接種在滅菌的淀粉液體培養(yǎng)基中，30 ~37
0C，150~200rpm，過夜培養(yǎng)；光合細菌在光合細菌液體培養(yǎng)基中，30~37°C，光照培養(yǎng)4~7
天，光照強度1000~2000LX，獲得各菌種的一級種子液；
b.二級種子液發(fā)酵:分別將步驟a所培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產堿桿菌、放線菌一級種子液按發(fā)酵罐體積10~15%的接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)基同步驟a所用，30~37°C，150~200rpm，通入經0.45 μ m濾膜過濾的過濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積0.5-1倍/min,壓力在0.1~IMPa,發(fā)酵12~18小時；
c.生產液發(fā)酵:分別將二級種子液打入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基同步a所用，接種量為發(fā)酵罐體積的8-12%，30~37°C，150~200rpm，通入經0.45 μ m濾膜過濾的過濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積0.8-1倍/min，壓力在0.5~1.0MPa,發(fā)酵24~36小時；光合細菌直接將一級種子液接種到透明的裝有光合細菌液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐體積的8~12%，30~37°C，光照培養(yǎng)4-7天，光照強度1000-2000LX ；
d.單獨發(fā)酵完成后將發(fā)酵液裝入貯液罐，按照各組分微生物在微生物總質量的質量百分比取枯草芽孢桿菌30%~40%，地衣芽孢桿菌30%~40%，放線菌10~20%，反硝化細菌10~20%，光合細菌10~20%混合制成液體微生物復合菌劑；
所述的一種農藥殘留降解復合菌的制備方法，步驟d中液體微生物復合菌劑的菌含量 不低于6.0X108CFU/ml，蛋白酶活性不低于300U/ml，淀粉酶海量不低于200U/ml。
[0009]本發(fā)明有益效果:
采用本發(fā)明獲得農藥殘留降解復合菌有以下優(yōu)點:
I)所使用的微生物能夠產生生物活性酶
通過現(xiàn)代微生物分離技術、分子生物學技術和酶工程技術篩選能過產生蛋白酶、淀粉
酶 的菌株作為農藥殘留降解微生物復合菌的目的菌，這些菌能夠產生大量的蛋白酶、淀粉酶.蛋白酶的含量不低于300U/g或者300U/ml，淀粉酶不低于200U/g或者200U/ml.這些酶能夠有效的對農藥產生酶促反應2)所使用的微生物以異養(yǎng)菌為主
不同的微生物繁殖方式和吸取營養(yǎng)的途徑不同，就直接導致它們的繁殖速度不同，差異十分巨大，所選微生物為異養(yǎng)菌，因此進入環(huán)境后，只要營養(yǎng)充足就能快速繁殖，通過人工投放以后能迅速形成優(yōu)勢菌群。
[0010]3)所使用的微生物還能產生抗生素樣物質
所選用的微 生物如芽孢桿菌、放線菌能產生抗生素樣物質，對致病菌有抑制作用，從而減少其它致病菌在土壤.農作物.水體和空氣中的繁殖數(shù)量
4)所選用的微生物為多種微生物的混合體，它們具有較強的針對性和組合能力，在載體中不互相排斥，在環(huán)境中相互協(xié)調，效果明顯提高。使用時不需要復雜的工程.工藝，對作物和土壤噴霧方式施用，使用方便
本發(fā)明所選用的菌株特性及功能如下:
I)枯草芽孢桿菌:能產生蛋白酶、淀粉酶以及枯草桿菌素。
[0011]2)地衣芽孢桿:細菌的繁殖充分的利用土壤和空氣中的氮.磷.氨氮.硫化氫等營養(yǎng)物質，耐高溫，同時能產生蛋白酶、桿菌肽等。
[0012]3)放線菌:充分的利用糞便.污水和空氣中的氮.磷.氨氮.硫化氫等作為自身繁殖的營養(yǎng)物質，同時能夠生長抗生素類物質，抑制其它致病菌的生長繁殖，但對其它五種菌不會產生抑制作用
4)反硝化產堿桿菌:通過實驗表明，該菌種對六六六農藥有降解作用，而六六六農藥的自然降解需要三十年時間，而通過人工在單位面積制造工程菌，提高單位面積菌種的含量，就會加速農藥的降解
5)光合細菌:能利用糞便尿液中的氨氮.硫化氫等作為自身繁殖的營養(yǎng)物質，從而有效降解糞便.尿液和空氣中的氨氮、硫化氫等惡臭氣體
6)所選菌種屬于農業(yè)部318公告范圍，對人.畜，農作物和環(huán)境沒有傷害，沒有二次污
染
7)以上菌種均可以市購或從各保藏單位獲得 復合菌的【具體實施方式】
一。施用時間:
1.在施用農藥一周后，復合菌按照1:5的比例稀釋，然后用噴霧器對作物和土壤進行均勻噴霧。每畝復合菌用量在五公斤
2.在農作物收獲后，土地整理后，對土壤進行噴灑，畝用三公斤復合菌
3.在冬季溫度低于10度或夏天室外氣溫達到40度時，不能施用菌種
4.全年施用復合菌畝用8公斤，在農藥殘留較重的區(qū)域可以加大用量 實施案例:
1.實施地點:四川省都江堰市
2.用戶情況介紹:都江堰市獼猴桃種植戶
作為都江堰市特色優(yōu)勢產業(yè)之一，獼猴桃產業(yè)也成為了農戶增收致富的一個重要途徑。目前，都江堰市共有獼猴桃種植面積約12萬畝，掛果面積近7萬畝，2011年產量達2.65萬噸，產值超過2億元。全市已有10家專業(yè)從事獼猴桃生產和銷售的企業(yè)，12家獼猴桃專合組織，并建設了獼猴桃氣調保鮮庫近I萬噸，一般性冷藏庫約5000噸，有效增加了獼猴桃產業(yè)附加值，延長了產業(yè)鏈條。成功入選2008“奧運推薦果品”，遠銷日本、韓國、美國、歐盟等十多個國家和地區(qū)。都江堰也發(fā)展成為了全國最大的海沃特獼猴桃生產出口基地
為了保護都江堰獼猴桃品牌形象，都江堰市還制定并實施了《都江堰獼猴桃品牌保護工作方案》，即統(tǒng)一生產管理技術和標準；已有四個專業(yè)合作社進行了有機食品認證。
[0013]3.實驗經過:
通過市科技局科技計劃立項，2011年開始，獼猴桃協(xié)會組織三個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的部分種植戶農藥殘留降解實驗，通過市土肥站的每次使用后監(jiān)測，通過使用復合菌以后，在使用農藥后的七天使用后，在經過五天左右(視天氣情況)，在作物表面基本上檢測不到藥物殘留。特別是在獼猴桃采摘前一個月，復合菌按照1:10的比例稀釋，對獼猴桃果子噴霧，完全降解了獼猴桃表面因空氣污染造成的藥物殘留，并對預防細菌性病變有很好的防止效果。
[0014]通過以上實驗證明復合菌在農藥殘留降解方面技術的可靠性。
【權利要求】
1.一種農藥殘留降解復合菌，其特征在于該復合菌各組微生物在微生物總質量中的質量百分比為:枯草芽孢桿菌30%~40%，地衣芽孢桿菌30%~40%，放線菌10%~20%，反硝化細菌10%~20%，光合細菌10%~20%。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種農藥殘留降解復合菌，其特征在于每克或每ml該微生物復合菌中菌含量不低于8.0X 108CFU,蛋白酶活性不低于300U，淀粉酶含量不低于150U。
3.如權利要求1或2所述的農藥殘留降解復合菌的制備方法，其特征在于該方法是將各組微生物分別培養(yǎng)再按一定比例混合制成微生物復合菌。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種農藥殘留降解復合菌的制備方法，其特征在于它包含下述步驟:
a.一級種子液的制備:分別將活化的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產堿桿菌菌種接種到無菌的PH7.0-7.5的營養(yǎng)肉湯中，放線菌接種在滅菌的淀粉液體培養(yǎng)基中，3(T37°C，150-200rpm，過夜培養(yǎng)；光合細菌在光合細菌液體培養(yǎng)基中，30-37°C，光照培養(yǎng)4-7天，光照強度1000-2000LX ;獲得各菌種的一級種子液；
b.二級種子液發(fā)酵:分別將步驟a所培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產堿桿菌、放線菌一級種子液按發(fā)酵罐體積10-15%的接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)基同步驟a所用，30^370C，150-200rpm，通入經0.45 μ m濾膜過濾的過濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積的0.5-1倍min，壓力0.1~1MPa，發(fā)酵12~18小時；
c.生產液發(fā)酵:分別將二級種子液打入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基同步驟所用，接種量為發(fā)酵罐體積的8-12%，30^37 0C，150-200rpm，通入經0.45 μ m濾膜過濾的過濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積的0.8-1倍min，壓力0.5~1.0MPa,發(fā)酵24~36小時；光合細菌直接將一級種子液接種到透明的裝有光合細菌液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐體積的8-12%，30~37°C，光照培養(yǎng)4-7天，光照強度1000-2000LX ； d.單獨發(fā)酵完成后將發(fā)酵液裝入貯液獾，按照各組分微生物在微生物總質量中質量百分比取枯草芽孢桿菌30~40%，地衣芽孢桿菌30~40%，放線菌10~20%，反硝化細菌10~20%，光合細菌10-20%混合制成液微生物復合菌； 或者將單獨發(fā)酵的發(fā)酵液通過離心或者加載體吸附，形成固體，按照各組分微生物在微生物總質量中的質量百分比取枯草芽孢桿菌30-40%，地衣芽孢桿菌30-40%，放線菌10~20%，反硝化細菌10~20%，光合細菌10~20%混合制成固體微生物復合菌。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種農藥殘留降解復合菌的制備方法，，其特征在于步驟d中液體微生物復合菌的菌含量不低于6.0X IO8CFU / ml，淀粉酶含量不低于200U / ml ;固體微生物復合菌的菌含量不低于6.0X IO8CFU / g，蛋白酶活性不低于300U / g，蛋白酶含量不低于200 U/ml。
【文檔編號】C12N1/20GK103966113SQ201310033585
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月29日 優(yōu)先權日:2013年1月29日
【發(fā)明者】李朝均 申請人:都江堰惠農生物技術有限責任公司