專利名稱：塵螨過敏原Derf8和Derf20及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種塵螨過敏原Der f 8和Der f 20及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:過敏性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎等)是臨床上的常見病、多發(fā)病，世界各國(guó)過敏性疾病的總發(fā)病率高達(dá)10-30%，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題，目前我國(guó)現(xiàn)有哮喘患者2000多萬(wàn)，過敏性鼻炎患者5000多萬(wàn)，并且其發(fā)病率和死亡率仍呈上升趨勢(shì)，近二十年來(lái)發(fā)病率幾乎翻了一倍。在引起過敏性疾病的眾多吸入性過敏原中，塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的最重要因素。自從Voorhorst和Spieksma (1964)首次證實(shí)塵螨及代謝產(chǎn)物是屋塵中的主要過敏原以來(lái)，世界各國(guó)(歐美國(guó)家、日本、中國(guó)等)變態(tài)反應(yīng)學(xué)工作者通過大量調(diào)查也一致證實(shí)塵螨是世界性的主要變應(yīng)原。塵螨在過敏性疾病患者特異性免疫診斷中陽(yáng)性率約70-80%。自從Noon和Freeman( 1911)首次應(yīng)用梯牧草花粉變應(yīng)原浸液(allergenextract)用于治療花粉癥以來(lái)，脫敏治療至今已有90多年的歷史。隨著對(duì)變態(tài)反應(yīng)疾病發(fā)病機(jī)制的深入研究以及免疫治療機(jī)制的進(jìn)一步了解，WHO (1997)建議將變應(yīng)原浸液改稱為變應(yīng)原疫苗(allergen vaccine)，并且在《WHO有關(guān)免疫治療的指導(dǎo)文件》(1998)指出:
(I)鼓勵(lì)應(yīng)用和發(fā)展標(biāo)準(zhǔn)化的變應(yīng)原疫苗；(2)成功的免疫治療取決于高質(zhì)量的變應(yīng)原疫苗。因此，研制出新一代高效變應(yīng)原疫苗仍是國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。由于塵螨系醫(yī)學(xué)節(jié)肢動(dòng)物，結(jié)構(gòu)和成份復(fù)雜，盡管目前人們?cè)趬m螨數(shù)百種蛋白中已初步鑒定出16種過敏原成份，研究顯示塵螨含有的過敏原多大30余種。就某一個(gè)塵螨過敏病人而言，他可能僅對(duì)塵螨中的一類或數(shù)類過敏原蛋白產(chǎn)生過敏反應(yīng)。而目前在臨床上用于塵螨過敏 患者診斷和脫敏治療的仍然為塵螨粗浸液，其中含有大量對(duì)患者非特異的過敏原及其它雜質(zhì)，這嚴(yán)重阻礙了塵螨過敏原試劑標(biāo)準(zhǔn)化的制定及其在臨床上的使用。所以進(jìn)一步探明塵螨過敏原的確切組分，將會(huì)為塵螨過敏患者帶來(lái)個(gè)體化的脫敏治療
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種塵螨過敏原Der f 8和Der f 20及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:Der f 8是我們首次從塵螨勻漿中鑒定得到的一種新的過敏原蛋白，它屬于一類谷胱甘妝轉(zhuǎn)移酶家族(Glutathione S-transferase),分子量約32 kDa。Der f 8由197個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1):MLAYAGVDYVDKRYNIGPNFDRSEWLNEKFNLGLDFPNLPYYMD⑶VKITQSMAILRYLA 60RKYNMDGTNEQERLRISMAEQQTHDMFMAMVRICYDPNMENLRVDYLKTLPDSLKLMEKF I20LANHDYIAGSKISYADFYLYEYLCRMKVMVPEVYGQFENLKKFVERIESLPRIAEYIKKQ 180KPTTFNASLAKffNGSYA197塵螨過敏原Der f 8基因克隆步驟包括:塵螨總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法擴(kuò)增編碼基因?；驕y(cè)序結(jié)果表明塵螨過敏
原Derf 8的編碼基因(GenBank accession KC305499)由595個(gè)核苷酸組成，該基因的5’端至3’端序列為(核苷酸序列為SEQ ID NO:3):atgttggcat atgccggtgt tgattatgtt gataaacgtt ataatattgg tccgaatttt Igatcgttcag aatggttgaa tgaaaaattc aatttgggtt tagatttccc aaatttgcca 61tattacatgg atggtgatgt taaaattacc caatcgatgg ccattcttcg ttatttggcc 121cgtaaatata acatggatgg tactaatgaa caggaacgtt tacgaatttc aatggctgaa 181caacaaacac atgatatgtt tatggccatg gtccgtattt gttatgatcc aaatatggaa 241aacttacgag ttgattattt gaa aacattg cccgattcat tgaaattgat ggaaaaattt 301ttagctaatc atgattatat tgccggttca aaaatttctt atgcagattt ttatttgtat 361gaatatttgt gccgtatgaa agtcatggta ccagaagtat atggacaatt tgaaaatttg 421aaaaaatttg ttgaacgcat tgaatcattg ccacgtattg ccgaatacat taagaaacaa 481aaaccaacaa cattcaatgc atcattggct aaatggaatg gttcttatgc ctaa595Der f 20 屬于一類精氨酸激酶(Arginine kinase)，分子量約 40 kDa。Der f 20由356個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如下(SEQ ID N0:2):MVDQATLSKLEAGFQKLQNAQDCHSLLKKYLTRDVLDQLKTKKTDMGATLLDVIQSGVEN 60LDSGVGIYAPDAQSYKTFAALFDPIIDDYHKGFKPTDKHPQTDFGNIEHFVNVDPKNEYV 120ISTRVRCGRSLKGYPFNPMLTEAQYKEMETKVKGQLATFEGELKGTYYPLLGMDKATQQK 180LIDDHFLFKE⑶RFLQAANACRYWPVGRGIFHNDKKTFLMWVNEEDHLRIISMQKGGDLK 240EVFGRLVKAVKHIEQKIPFSRDDRLGYLTFCPTNLGTTIRASVHIKLPKLAADRKKLEEV 300AARYNLQVRGTAGEHTESVGGIYDISNKRRMGLTEYQAVKEMQDGIIELIKMEKSL356塵螨過敏原Dei* f 20基因克隆步驟包括:塵螨總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法擴(kuò)增編碼基因?；驕y(cè)序結(jié)果表明塵螨過敏原Derf 20的編碼基因(GenBank accession EU106619.1)由1071個(gè)核苷酸組成，該基因的5’端至3’端序列為(核苷酸序列為SEQ ID N0:4):atggtcgatc aagctaccct gagtaaattg gaagccggtt tccaaaaatt acagaatgct 60caagattgtc attcattgtt gaaaaagtat ttgactcgcg atgtgttaga tcaactcaag 120acgaaaaaga ccgacatggg cgcaacatta ttggatgtta tccaatctgg cgtggaaaac 180ctggacagtg gtgttggtat ctatgctcct gatgctcaat catacaaaac atttgctgca 240ttgttcgatc caatcattga tgattaccat aaaggcttca aaccgaccga taaacatccg 300caaactgatt tcggcaatat cgaacacttt gtcaatgttg atcctaaaaa cgaatacgtc 360atttctactc gtgttcgatg tggccgttcg ttgaaaggct atccattcaa ccctatgttg 420acagaggctc aatacaaaga aatggaaacc aaagtgaaag gacaattggc cacattcgaa 480ggcgaattga aaggcaccta ttacccattg ttgggaatgg ataaagctac tcaacagaaa 540ttgatcgacg atcatttctt gttcaaggaa ggtgatcgat tcttgcaagc tgccaatgca 600tgtcgttact ggcctgttgg tcgtggtatc ttccacaatg acaaaaaaac attcttgatg 660tgggtaaacg aagaagatca tttgcgtatc atttccatgc aaaaaggtgg cgatctaaaa 720gaggtctttg gacgtttggt caaggctgtc aagcacattg aacaaaagat tccattctct 780cgtgatgacc gtctcggtta tttgacattc tgtccaacca atcttggcac aaccatccgt 840
gcttcggttc atatcaaact tccgaaattg gccgctgacc gtaagaagtt ggaagaagtg 900gctgctcgtt acaatcttca agtgcgtggc actgcaggtg aacataccga aagtgtgggt 960ggtatctatg atattagtaa caaacgacga atgggtctca ccgaatacca agctgttaal020gaaatgcaag atggcatcat tgaattgatt aaaatggaaa aatcattgta a1071通過常規(guī)的雙向電泳及雙向Western blot方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Der f 8和Der f 20具有較強(qiáng)的過敏原性，在制備治療塵螨過敏性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于:提供塵螨過敏原Der f 8和Der f 20及其基因，塵螨過敏原Der f 8和Der f 20能作為制備治療塵螨過敏性疾病藥物的應(yīng)用。


:圖1.是塵螨勻漿過分子篩S印hadex_G75的峰型圖。圖2 為塵螨勻漿 S印hadex_G75 II 峰的 Westernblot，其中:點(diǎn) I Der f 20，點(diǎn) 2和 3 為 Der f 8。圖3-A至圖3-E是ES1-Q-TOF質(zhì)譜圖。其中:圖3-A至圖3-B為Der f 8的質(zhì)譜圖；圖3-C至圖3-E為Der f 20的質(zhì)譜圖
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例一:塵螨過敏原的鑒定及其氨基酸序列測(cè)定一、塵螨的飼養(yǎng)和收集及塵螨勻漿的制備將純品系的粉塵螨至于25 1:相對(duì)濕度75%的條件下采用磨成粉末狀的鼠糧進(jìn)行批量飼養(yǎng)。由于塵螨具有避光的生活特性，可用白熾燈光照法將塵螨從飼料中分離出來(lái)。對(duì)于分離的塵螨可加入適量的20mM pH 7.8 Tris-HCL進(jìn)行充分研磨，然后在轉(zhuǎn)速12000 Xg離心30 min獲取上清。二、塵螨勻漿的分離純化和雙向電泳及其Western blot檢測(cè)以上述收集的上清液為原料，上樣于預(yù)先用20mM pH7.8 Tris-HCL緩沖液平衡好的分子篩凝膠層析SephadeX-G75，用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫。流速為0.3ml/min，用自動(dòng)收集器每IOmin收集一管,檢測(cè)每管在280nm和215nm處的吸收值,制作吸收值變化的峰型圖如圖1所示。然后將每峰收集凍干濃縮用于下一步的分離純化或雙向電泳及其Westernblot檢測(cè)。雙向電泳及其Western blot具體步驟如下:A.樣品處理:采用GE公司的2D clean-up對(duì)來(lái)自分子篩各峰的樣品進(jìn)行脫鹽濃縮等處理，主要過程如下:1:將含有約60 μ g 100 μ I的樣品至于1.5 ml的微型離心管中，加入300 μ I沉淀劑振蕩攪勻，冰浴15 min。2:以最大轉(zhuǎn)速(12000Xg)離心5 min，盡量取凈上清。加入40 μ I共沉淀劑，冰浴5 min。再次相同轉(zhuǎn)速離心5 min，用移液槍將上清移去，加入25 μ I加入I ml洗滌緩沖液(在-20 1:至少預(yù)冷I小時(shí))和5 μ I洗滌添加劑，振蕩直至沉淀完全散開。將管在-20°C下孵育至少30 min,每10 min振蕩20至30 S。3:以轉(zhuǎn)速 12 000 X g 離心 5 min。4:小心將上清移去，此時(shí)可見白色沉淀，將沉淀簡(jiǎn)單風(fēng)干。
5:加入150 μ I水化液再溶解沉淀，以備第一向等電聚焦電泳(IEF)使用。B.等電聚焦(IEF):將含有約60 μ g樣品100 μ I水化液上樣于7 cm長(zhǎng)Immobiline DryStrip非線性膠條,在Ettan IPGphor III等電聚焦系統(tǒng)上聚焦,等電聚焦條件為20 °C，每條膠的電流為50 μ A，總聚焦伏小時(shí)約為6 kVh。將等電聚焦好的膠條分別用含有二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺的平衡液各洗15 min，將平衡好的膠條橫放在以配好的濃度為12%的SDS-PAGE膠面上，并用瓊脂糖封好，準(zhǔn)備第二向電泳。C.第二向電泳:對(duì)于膠寬度只有7 cm的膠塊可用SE260進(jìn)行跑膠。在20 mA/膠的條件下一個(gè)半小時(shí)即可。實(shí)施例二:塵螨過敏原的基因克隆一、塵螨總RNA提取A.稱取約80 mg的活塵螨,加入已預(yù)冷的I mL Trizol提取液(美國(guó)Invitrogen公司)，并加入液氮充分勻漿。B.加入Trizol 1/5體積的氯仿，劇烈混勻約15秒，室溫放置5分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘,取上清。C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4 V，12000 rpm離心10分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為地鱉蟲消化道中腸總RNA。 二、塵螨mRNA的純化塵螨mRNA 分離純化米用美國(guó) PR0MEGA 公司的 PolyATtract mRNA IsolationSystems試劑盒。A.取塵螨總 RNA 500 μ g 溶于 500 μ L DEPC 水中，65 °C水浴 10 min，加人 3UL的Oligo(dT)探針和13 uL 20XSSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。B.磁珠(SA-PMP)的洗滌:將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5X SSC 300 μ L，至磁力架吸附30秒，最后加100 μ L 0.5X SSC懸浮，稱為B液。C.將A液加入B液中，室溫放置10 min，至磁力架吸附30秒，棄上清，用Ο- X SSC洗滌4次，最后棄上清，加100 μ L DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30 S，將上清移至新的試管，再加入150 UL DEPC水重懸，至磁力架吸附30 S，移上清至上述試管，即為純化的地鱉蟲消化道中腸mRNA。D.加入1/10體積的pH5.2,3 M的乙酸鈉溶液，等體積異丙醇，于_70°C放置30分鐘，4°C，12000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀溶解于10 μ L DEPC水中。三、塵螨cDNA文庫(kù)構(gòu)建米用CL0NTECH公司 Creator SMART cDNA Library Construction Kit 構(gòu)建塵螨cDNA文庫(kù)。A.cDNA 第一鏈合成于無(wú)菌PCR管加入2μI 塵螨mRNA、l μ I SMART IV引物、I μ I CDS 111/3’ PCR引物、I μ I RNA-free水，使總體積達(dá)到5 μ I ,混勻并短暫離心。1.72°C 保溫 2 min，冰上孵育 2 min。2.在上述 PCR 管中加入 2 μ I 5 X 第一鏈 buffer、I μ I 20 mmol/L DTTU μ I10 mmol/L dNTP混合物、I μ I PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻并短暫離心。3.置于PCR儀中42°C保溫I hr后，冰浴終止第一鏈的合成。
B.采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD- PCR)方法擴(kuò)增cDNA第二鏈1.將 I μ I cDNA 第一鏈、40 μ I 去離子水、5 μ I IOXAdvantage 2 PCR 緩沖液、I μ I 50XdNTP 混合物、I μ I 5’PCR 引物、I μ I CDS 111/3’PCR 引物以及 I μ I 聚合酶于PCR管中混勻。2.在 PCR 儀中按以下程序擴(kuò)增:95°C，20 sec ;22 個(gè)循環(huán):95°C，5 sec ；68°C,6min。3.擴(kuò)增結(jié)束后，將合成的雙鏈cDNA置于_70°C保存。C.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:1.在微量離心管中加入I μ L pMD19-T載體(日本Takara公司)、4 “1^塵螨。0嫩雙鏈溶液，全量為5 UL02.加入5 μ L (等量)的連接酶緩沖混合物。3.16°C反應(yīng) 2 小時(shí)。4.全量(10 μ L)加入至100 μ L DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)中，冰浴30分鐘。5.42°C加熱90秒鐘后，再在冰中放置I分鐘。6.加入37°C溫浴過的LB培養(yǎng)基900 μ L，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。7.取200 μ L涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。 8.每個(gè)LB平皿用5 mL LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30%甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含2 X IO6個(gè)單獨(dú)克隆。四、塵螨過敏原基因序列擴(kuò)增和測(cè)定:根據(jù)實(shí)施例一中分離純化所得塵螨過敏原Der f 8的氨基酸序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了一條簡(jiǎn)并引物Der f 8-F和Der f 20-F，與構(gòu)建地鱉蟲消化道中腸cDNA文庫(kù)時(shí)所使用的接頭引物⑶S 111/3’ PCR配對(duì)，正反向引物序列為:CDS 111/3，PCR:5，-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC ATG-3’Der f 8-F: 5，-ATGCT(A/T/C/G)GC(A/T/C/G)TA(T/C)GC(A/T/C/G)GG(A/T/C/G)GT(A/T/C/G)GA(T/C)_3，Der f 20-F: ’ -GG(A/T/C/G)GG(A/T/C/G)GA(T/C)CT(A/T/C/G)AA(A/G)GA(A/G)GT (A/T/C/G) TT (T/C) GG (A/T/C/G) _3，其中，括號(hào)內(nèi)的堿基表示簡(jiǎn)并引物。簡(jiǎn)并引物Der f 8-F和接頭引物⑶S 111/3’ PCR配對(duì)使用，以塵螨cDNA為模板，進(jìn)行PCR。其反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性4 min，接著在如下條件進(jìn)行35輪循環(huán)，94°C 30 sec,55°C 30 sec, 72°C 40 sec，然后72°C 10 min。然后將PCR產(chǎn)物連接到T載體上，導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，篩選單克隆進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明編碼過敏原Der f 8的cDNA序列由595個(gè)核苷酸組成，編碼過敏原Der f 20的cDNA序列由891個(gè)核苷酸組成。實(shí)施例三:塵螨過敏原Der f 8和Der f 20的過敏原性檢測(cè)對(duì)于實(shí)例一中的同一個(gè)樣品需要跑兩塊雙向電泳，其中一塊用于直接染色，一塊接著用于Western blot檢測(cè)其致敏性,具體過程如下:1:轉(zhuǎn)膜:將2-D-SDS-PAGE膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜槽在200 mA 2 h的條件下轉(zhuǎn)至PVDF膜上。2:封閉:將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜用5%的脫脂奶粉在常溫封閉2h。3:一抗孵育:將封閉好的PVDF膜用PBS洗滌，把一抗(塵螨過敏病人血清)用5%的脫脂奶粉按1:20稀釋，在4 °C孵育過夜。4:二抗孵育:將一抗孵育的PVDF膜再用PBS洗滌，把二抗(羊抗人IgE)用5%的脫脂奶粉按1:2000稀釋，在常溫孵育I小時(shí)。5:顯影:將二抗孵育好的PVDF膜用PBS洗滌3次，每次5 min,在膜表面加上適量的二抗特異發(fā)光底物，用膠片進(jìn)行顯影。E.將與膠片上顯 影點(diǎn)匹配較好的2-D-PAGE蛋白點(diǎn)進(jìn)行ES1-Q-TOF質(zhì)譜測(cè)序。結(jié)果如圖2-B所示，其中點(diǎn)I Der f 20，點(diǎn)2和3為Der f 8。
權(quán)利要求
1.塵螨過敏原Derf8和Der f 20、其特征在于分別由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列組成。
2.編碼塵螨過敏原Derf 8和Der f 20的基因，其特征在于分別由SEQ ID NO:2和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列組成。
3.權(quán)利要求1所述的塵螨過敏原Der f 8和Der f 20在制備治療塵螨過敏性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種塵螨過敏原Derf8和Derf20及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。塵螨過敏原Derf8和Derf20、分別由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列組成。編碼塵螨過敏原Derf8和Derf20的基因，其特征在于分別由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列組成。所述的塵螨過敏原Derf8和Derf20在制備治療塵螨過敏性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于提供塵螨過敏原Derf8和Derf20及其基因，塵螨過敏原Derf8和Derf20能作為制備治療塵螨過敏性疾病藥物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/10GK103215236SQ20131003369
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者賴仞, 安輸, 容明強(qiáng), 李東升 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所