專利名稱：一種共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重組畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法，以及混合酶制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及一種共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的重組畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法，以及一種由該重組畢赤酵母菌株制備的混合酶制劑。
背景技術(shù)：
淀粉作為植物的重要貯藏物質(zhì)，是世界上含量最豐富的物質(zhì)之一。淀粉酶是指能夠水解淀粉生成低分子量多聚糖或者單糖的一類糖苷酶。淀粉酶廣泛應(yīng)用于淀粉水解或者其發(fā)酵工業(yè)，比如乙醇生產(chǎn)、淀粉糖生產(chǎn)、啤酒釀造等。當(dāng)前工業(yè)應(yīng)用中最重要的淀粉酶有葡萄糖淀粉酶、a-淀粉酶、普魯蘭酶等。葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3)，又稱糖化酶，是一種外切酶，作用于麥芽寡糖的非還原末端，切割a-1，4糖苷鍵生成葡萄糖；同時(shí)也可以作用于a-1，6糖苷鍵，但水解速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水解a-1，4糖苷鍵的速率。a-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，又稱液化酶，作用于淀粉、糖原以及其他多糖類物質(zhì)，以隨機(jī)的方式水解分子內(nèi)的a -1, 4糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽寡糖和少量葡萄糖。由于a-淀粉酶水解淀粉形成更多的非還原末端，為葡萄糖淀粉酶作用提供更多底物，因此兩者在水解淀粉過程中存在協(xié)同作用，可以促進(jìn)葡萄糖的生成。淀粉水解工業(yè)中的許多步驟，比如淀粉糖化、麥芽糖的生產(chǎn)，在溫度稍高的條件下操作顯然更具有優(yōu)勢(shì)，比如更高的反應(yīng)速率，較低的染菌風(fēng)險(xiǎn)等。但是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的糖化酶和液化酶普遍存在高溫條件不穩(wěn)定易失活的缺陷，因此使得生產(chǎn)成本大大增加。雖然也有很多研究報(bào)道通過菌種篩選尋找新型耐熱葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶，以及采用基因克隆技術(shù)進(jìn)一步獲得其表達(dá)基因，但是迄今為止都很少有新型耐熱葡萄糖淀粉酶或者a -淀粉酶真正用于產(chǎn)業(yè)化，主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)新型酶都存在要么活力太低要么表達(dá)水平過低的缺陷。隨著越來越多的高效異源表達(dá)系統(tǒng)被開發(fā)，通過異源表達(dá)以提高新型葡萄糖淀粉酶或者a -淀粉酶的表達(dá)水平 ，成為耐熱新型酶制劑產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的有效方法之一。雖然現(xiàn)有技術(shù)中也有報(bào)道公開將黑曲霉葡萄糖淀粉酶和大麥a-淀粉酶同時(shí)表達(dá)在釀酒酵母中，但是這種研究卻是為了賦予該菌種以直接降解淀粉產(chǎn)酒精的能力，改進(jìn)后的釀酒酵母菌株具有了淀粉水解酶的活力，但是卻僅限應(yīng)用于釀酒工業(yè)。因此，一種能夠同時(shí)高效表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a-淀粉酶的其他種類的異源表達(dá)系統(tǒng)，并且可用于淀粉的液化和糖化領(lǐng)域，將具有更大的應(yīng)用潛力和價(jià)值。然而至今都沒有人將葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶同時(shí)表達(dá)在畢赤酵母中以進(jìn)行相關(guān)研究，或者制備這兩種酶的混合酶制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種新型的共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的重組畢赤酵母菌株，及其構(gòu)建方法，以及一種由該重組畢赤酵母菌株制備的混合酶制劑。本發(fā)明提供一種共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的重組畢赤酵母菌株，所述重組畢赤酵母菌株同時(shí)含有來自微小毛霉菌的葡萄糖淀粉酶基因和a-淀粉酶基因，其基因序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。所述重組畢赤酵母菌株能夠同時(shí)分泌表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a-淀粉酶。本發(fā)明還提供一種如上所述的重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法的步驟如下:1)以微小毛霉菌基因組為模板，克隆得到葡萄糖淀粉酶(Gla)基因，其序列如SEQID N0.1所示，以pPIC9K為載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9KGla，轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71，得到重組畢赤酵母KM71/9KGla ；2)以微小毛霉菌基因組為模板，克隆得到a -淀粉酶(Amy)基因，其序列如SEQ ID N0.2所示，以pPICZ a為載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZ a Amy ;3)將所述重組表達(dá)載體pPICZ a Amy轉(zhuǎn)入重組畢赤酵母KM71/9KGla，通過抗生素篩選，得到同時(shí)含有葡萄糖淀粉酶基因和a -淀粉酶基因的重組畢赤酵母菌株KM71/9KGla_Z a Amy。步驟I)中從微小毛霉菌基因組克隆所述葡萄糖淀粉酶(Gla)基因的上、下游引物序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。步驟2)中從微小毛霉菌基因組克隆所述a-淀粉酶(Amy)基因的上、下游引物序列分別如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。本發(fā)明還提供一種混合酶制劑，所述混合酶制劑由一種共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的重組畢赤酵母菌株制備，包括葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶。所述混合酶制劑的最適作用pH為4-5,優(yōu)選為5。所述混合酶制劑的最適作用溫度為60_80°C，優(yōu)選70°C。本發(fā)明涉及到的葡萄淀粉酶為從微小毛霉菌中克隆得到，構(gòu)建畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC9KGla，轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71，通過搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，最高葡萄糖淀粉酶酶活力達(dá)到1237U/ml，蛋白表達(dá)水平達(dá)到0.762mg/ml。本發(fā)明涉及到的a-淀粉酶基因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室從微小毛霉菌中克隆獲得，構(gòu)建畢赤酵母重組表達(dá)載體pPICZ a Amy，轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71，通過搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，最高a -淀粉酶酶活力達(dá)到2927U/ml，蛋白表達(dá)水平達(dá)到0.236mg/ml。本發(fā)明涉及到的同時(shí)攜帶微小毛霉葡萄糖淀粉酶和a-淀粉酶基因的重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)KM71/9KGla-Z a Amy,通過搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白表達(dá)水平達(dá)到0.939mg/ml ;最高葡萄糖淀粉酶活力達(dá)到2218U/ml，相比只攜帶葡萄糖淀粉酶基因的重組畢赤酵母提高79% ;最高a -淀粉酶酶活力達(dá)到8285U/ml，相比攜帶a -淀粉酶基因的重組畢赤酵母提聞 183.1%。本發(fā)明得到的共表達(dá)微小毛霉葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的重組畢赤酵母菌株的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在于:(I)相比攜帶微小毛霉葡萄淀粉酶基因的重組畢赤酵母，雖然蛋白表達(dá)水平提高了 23.2%，但葡萄糖淀粉酶酶活力卻相應(yīng)提高了 79% ;而相比攜帶微小毛霉a -淀粉酶基因的重組畢赤酵母，a-淀粉酶酶活力也相應(yīng)提高了 183%。(2)本發(fā)明涉及的葡萄糖淀粉酶或a -淀粉酶均來源于微小毛霉，生化性質(zhì)，包括最適作用溫度和最適作用P H均相近，因此有利于在淀粉水解過程中在相同條件下共同作用。(3)在淀粉水解過程中，相比葡萄糖淀粉酶單獨(dú)作用，可以提高淀粉的水解效率，并且減少逆反應(yīng)的發(fā)生；相比a-淀粉酶淀粉酶單獨(dú)作用，產(chǎn)物葡萄糖的比例得到提高。采用本發(fā)明提供的共表達(dá)微小毛霉葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的重組畢赤酵母菌株制備兩種酶的混合酶制劑，有利于提高淀粉的水解效率，降低成本，因此具有較好的應(yīng)用前景。


圖1示出了重組畢赤酵母菌株KM71/9KGla和KM71/9KGla_Z a Amy分別在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上篩選的結(jié)果；圖2 示出了重組畢赤酵母菌株 KM71/9KGla、KM71/Z a Amy、KM71/9KGla_Z a Amy 分別產(chǎn)淀粉酶活力的驗(yàn)證；圖3示出了重組畢赤酵母菌株KM71/9KGla和KM71/9KGla_Z a Amy分別經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)的葡萄糖淀粉酶活力酶活曲線；圖4示出了重組畢赤酵母菌株KM71/Z a Amy和KM71/9KGla_Z a Amy分別經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)的a-淀粉酶活力酶活曲線；圖5 示出了重組畢赤酵母菌株 KM71/9KGla、KM71/Z a Amy、KM71/9KGla_Z a Amy 分別經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；圖6示出了混合酶制劑中葡萄淀粉酶和a -淀粉酶的酶活力與作用pH的關(guān)系曲線圖；圖7示出了混合酶制劑中葡萄淀粉酶和a-淀粉酶的酶活力與作用溫度的關(guān)系曲線圖；圖8示出了混合酶制劑、a -淀粉酶以及葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉的產(chǎn)物薄層層析圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明保護(hù)的范圍。下述實(shí)施例中所述試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑或者耗材，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1.重組表達(dá)載體pPIC9KGla的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化1.1引物設(shè)計(jì)R.pGAf (SEQ ID N0.3):ATGCGTTATGCAACCCCGCR.pGTr (SEQ ID N0.4):GGCGTTATTTATTACCCTCTTTTGACCR.pGEf (SEQ ID N0.5):GGAATTCATGCGTTATGCAACCCCGCR.pGNr (SEQ ID N0.6):TTGCGGCCGCTTACCCTCTTTTGACCA1.2微小毛霉葡萄糖淀粉酶cDNA序列擴(kuò)增以微小毛霉(Rhizomucor pusillus,從北京的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC購得，菌種編號(hào)3.204) cDNA第一鏈為模板，以R.pGAf/R.pGTr引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到葡萄糖淀粉酶(Gla)基因，其序列如SEQ ID N0.1所示。PCR反應(yīng)條件:94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min, 20個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5°C );94°C 30s，54。。30s, 72°C 2min，15 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，保存在 4°C。將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收后連接PMD19-T Simple Vector, 菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆并測(cè)序。1.3重組表達(dá)載體pPIC9KGla的構(gòu)建
以連有來自微小毛霉菌的葡萄糖淀粉cDNA序列的pMD19_T Simple Vector為模板，用引物R.pGEf/R.pGNr進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物用EcoRI和NotI (購自Fermentas)進(jìn)行酶切，然后與同樣經(jīng)EcoR 1、Not I酶切的酵母表達(dá)載體pPIC9K (來源Invitrogen)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (來源天根生化)，PCR驗(yàn)證陽性克隆并測(cè)序；若測(cè)序結(jié)果顯示未發(fā)生移碼等堿基突變，則表明構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPIC9KGla可用。1.4畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備(I)將畢赤酵母KM71接種YH)液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至ODl 2A(600nm)，用于制備感受態(tài)細(xì)胞；(2)將培養(yǎng)液6000rpm，4°C離心3min，收集菌體；(3)用 8ml 緩沖液(IOOmM LiAc, IOmM DTT, 0.6M 山梨醇，IOmM pH7.5Tris-HCl)重懸菌體，室溫靜置30min ；(4) 6000rpm, 4°C離心 5min,收集菌體；(5)用2 3mllM山梨醇洗滌菌體，重復(fù)兩次；(6)用適量IM山梨醇重懸菌體,使細(xì)胞濃度為101°個(gè)/ml,靜置冰上,待用。

1.5重組表達(dá)載體pPIC9KGla的轉(zhuǎn)化(I)將IOOul重組質(zhì)粒pPIC9KGla用SacI線性化酶切，用Takara核酸共沉劑進(jìn)行濃縮，用IOul的無菌超純水溶解質(zhì)粒；同時(shí)制備兩份；(2)將IOul的上述質(zhì)粒與IOOul的酵母感受態(tài)細(xì)胞KM71混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電極杯中，進(jìn)行電擊，迅速加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇，轉(zhuǎn)移至30°C培養(yǎng)箱中靜置Ih ;涂布MD平板；30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.6高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選用無菌水將MD平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子洗下，涂布含有不同濃度G418抗生素的YPDS平板，篩選含有高拷貝葡萄糖淀粉酶基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子KM71/9KGla。實(shí)施例2.重組表達(dá)載體pPICZ a Amy的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化2.1引物設(shè)計(jì)R.pA-f (SEQ ID N0.7):ATGAAATTCAGCATCTCTCTCTCGGR.pA-r (SEQ ID N0.8):TTAAGCAGAGGTGAAGATAGCGGAR.pAEf (SEQ ID N0.9):GAATTCAGCCCTTTGCCCCAACAGCAR.pANr (SEQ ID N0.10):TTGCGGCCGCTTAAGCAGAGGTGAAGATAG
2.2微小毛霉a -淀粉酶cDNA序列擴(kuò)增以微小毛霉第一鏈cDNA為模板，以引物R.pA-f/R.pA_r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到a -淀粉酶(Amy)基因，其序列如SEQ ID N0.2所示。PCR反應(yīng)條件:94°C 5min ；94°C 30s，65 °C 30s, 72 °C lmin30s，30 個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低 0.5°C);94°C 30s, 50 °C 30s,72°C lmin30s，10個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，保存在4°C。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收后連接PMD19-T Simple Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，菌落PCR驗(yàn)證得到陽性克隆送交華大基因完成測(cè)序。2.3重組表達(dá)載體pPICZ a Amy構(gòu)建以連有來自微小毛霉菌a-淀粉酶cDNA序列的pMD19_T Simple Vector為模板，用引物R.pAEf/R.pANr進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoR1、NotI (購自Fermentas)進(jìn)行酶切，然后與同樣經(jīng)EcoR 1、Not I酶切的酵母表達(dá)載體pPICZ a (來源Invitrogen)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (來源天根生化),驗(yàn)證陽性克隆得到重組質(zhì)粒pPICZa Amy。2.4畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備將畢赤酵母KM71和重組畢赤酵母KM71/9KGla分別接種YPD液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至ODl 2A (600nm)，按照實(shí)施例1.3所述方法制備感受態(tài)細(xì)胞。2.5重組表達(dá)載體pPICZ a Amy的轉(zhuǎn)化(I)將pPICZ a Amy用Sac I線性化酶切后分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71和重組畢赤酵母 KM71/9KGla，獲得重組畢赤酵母菌株 KM71/Z a Amy 和 KM71/9KGla_Z a Amy ；(2)將上述重組菌株KM71/9KGla_ZaAmy涂布含有抗生素Zeocin的YPDS平板，進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子篩選。同時(shí)取沒有轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒Z a Amy的感受態(tài)細(xì)胞KM71/9KGla涂布相同的平板，作為篩選對(duì)照。結(jié)果如圖1所示:轉(zhuǎn)化Z a Amy獲得的重組菌株KM71/9KGla_Z a Amy轉(zhuǎn)化子在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上長(zhǎng)出單菌落，而沒有轉(zhuǎn)化Z a Amy的重組菌株KM71/9KGla在相同的平板上不能生長(zhǎng)。該結(jié)果說明，重組畢赤酵母菌株KM71/9KGla_Z a Amy得到了成功
構(gòu)建?！?shí)施例3.重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)淀粉酶活性驗(yàn)證(I)分別挑取重組畢赤酵母菌株 KM71/9KGla、KM71/Z a Amy、KM71/9KGla_Z a Amy轉(zhuǎn)化子單菌落接種含有2%的可溶性淀粉BMMY平板，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24h在平板下層滴加200ul過濾除菌的無水乙醇；(2)2 3d后用碘液顯色，觀察轉(zhuǎn)化子周圍水解圈的大小，以此判斷轉(zhuǎn)化子是否成功表達(dá)微小毛霉淀粉酶。結(jié)果如圖2所示，上述重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的周圍均出現(xiàn)水解圈，說明上述重組畢赤酵母菌株KM71/9KGla、KM71/Z a Amy、KM71/9KGla_Z a Amy均可分泌表達(dá)淀粉酶。實(shí)施例4.重組畢赤酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)4.1 分別挑取重組畢赤酵母菌株 KM71/9KGla、KM71/Z a Amy、KM71/9KGla_Z a Amy單菌落接種含有3mlYPD培養(yǎng)基的50ml離心管，置于30°C，200rpm搖床過夜培養(yǎng)；4.2將3ml種子培養(yǎng)液全部接入裝有150ml BMGY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，30°C，225rpm 培養(yǎng) 24h ；4.3離心收集菌體，用30ml BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，此處注意控制菌體量一致，均為濕重3.5g，轉(zhuǎn)入250ml搖瓶，置于30°C，230rpm搖床進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，每24ml補(bǔ)加150ul過濾除菌的無水甲醇；4.4從第48h開始，每隔24h取樣，離心，測(cè)定上清液的葡萄糖淀粉酶(糖化酶)活力或者a -淀粉酶(液化酶)活力。本發(fā)明所述的葡萄糖淀粉酶(糖化酶)酶活測(cè)定方法為:在20ml具塞試管中加入
0.5mll.0%(w/v)的可溶性淀粉溶液，60°C預(yù)熱IOmin,然后加入0.5ml適當(dāng)稀釋的酶液,反應(yīng)IOmin ;加入1.0ml DNS顯色劑,沸水浴5min,流水浴冷卻,用IOml蒸懼水稀釋,在540nm處測(cè)定吸光值；酶活力單位定義:一個(gè)葡萄糖淀粉酶(糖化酶)酶活單位(U)定義為在給定條件下Imin內(nèi)水解可溶性淀粉釋放Iumol葡萄糖當(dāng)量的還原糖所需要的酶量。
本發(fā)明所述的重組a -淀粉酶(液化酶)酶活測(cè)定方法為:在20ml具塞試管中加A 5ml0.5%(w/v)可溶性淀粉溶液,預(yù)熱IOmin,然后加入稀釋至適當(dāng)倍數(shù)的酶液0.5ml,反應(yīng)5min，加入5ml預(yù)冷的0.1M HCl終止反應(yīng)。取0.5ml反應(yīng)液加入裝有9.3ml蒸餾水的試管中，加入0.2ml I2-KI (I2,0.08%(w/v) ;KI，0.8%(w/v))溶液顯色。搖勻，使藍(lán)色溶液穩(wěn)定IOmin后，在721分光光度計(jì)波長(zhǎng)660nm處測(cè)定吸光值。酶活力單位定義為:一個(gè)a -淀粉酶(液化酶)酶活單位(U)定義為在給定條件下，5min內(nèi)水解Img淀粉所需的酶量。結(jié)果如圖3所示，重組畢赤酵母菌株KM71/9KGla和KM71/9KGla_Z a Amy的葡萄糖淀粉酶酶活力均在96h達(dá)到最大值，其中，重組菌株KM71/9KGla_Z a Amy的最高葡萄糖淀粉酶活力達(dá)到2218U/ml，而只攜帶葡萄糖淀粉酶基因的重組菌株KM71/9KGla的最高酶活力為1237U/ml，因此，重組菌株KM71/9KGla-Z a Amy的最高葡萄糖淀粉酶活力相比重組菌株KM71/9KGla 提高了 79% ；結(jié)果如圖4所示，重組畢赤酵母菌株KM71/ZaAmy和KM71/9KGla_ZaAmy的a-淀粉酶酶活力均在96h達(dá)到最大值,重組菌株KM71/9KGla_Z a Amy的最高a -淀粉酶活力達(dá)到8285U/ml，而只攜帶a -淀粉酶基因的重組菌株KM71/Z a Amy的最高酶活力為2927U/ml,因此，重組菌株KM71/9KGla_Z a Amy的最高a -淀粉酶活力相比重組菌株KM71/Z a Amy提聞了 183%。4.5分別取第96h的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，結(jié)果如圖5所示:其中，M表示蛋白Marker，第I和第2泳道表示轉(zhuǎn)化空載體Z a或者空載體9K的畢赤酵母KM71，第3、第4和第5泳道分別表示重組菌株KM71/Z a Amy，KM7l/9KGla和謂71/91 1&-2 0 41^，通過觀察可知，轉(zhuǎn)化空載體2 0或者空載體9K的畢赤酵母KM71均沒有條帶出現(xiàn)，而轉(zhuǎn)化葡萄糖淀粉酶基因或者a -淀粉酶基因的重組畢赤酵母KM71/Z a Amy,KM71/9KGla和KM71/9KGLa_Z a Amy均在預(yù)期位置出現(xiàn)了清晰條帶，因此說明表達(dá)成功。實(shí)施例5.蛋白濃度測(cè)定5.1制定牛血 清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線:在試管中依次加入200ug/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0111、10111、20111、30111、40111、50111和 75ul，用雙蒸水補(bǔ)足 200ul ;各管中加入 2mlBradford工作液，震蕩混勻，室溫放置5min，在595nm處測(cè)定吸光值；每個(gè)樣品做三個(gè)平行，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，A595為縱坐標(biāo),制得標(biāo)準(zhǔn)曲線；5.2樣品蛋白含量測(cè)定:將樣品稀釋n和m倍，配置成濃度約為0.025 0.075mg/ml的溶液；取稀釋過的樣品200ul加入試管中，加入2mlBradford工作液，振蕩均勻，室溫放置5min，在595nm處測(cè)定吸光值；每個(gè)樣品做三個(gè)平行。將測(cè)得的吸光值扣去空白，從標(biāo)準(zhǔn)曲線差的相應(yīng)的蛋白含量，在按照各自的稀釋倍數(shù)推算出蛋白濃度，去平均值后即為樣品的蛋白濃度。經(jīng)過測(cè)量，本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌株KM71/9KGla的葡萄糖淀粉酶的蛋白表達(dá)水平為0.762mg/ml，重組菌株KM71/ZaAmy的a -淀粉酶的蛋白表達(dá)水平為0.236mg/ml，而同時(shí)攜帶微小毛霉葡萄糖淀粉酶和a-淀粉酶基因的重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)KM71/9KGla_Z a Amy的蛋白表達(dá)水平達(dá)到0.939mg/ml,得到顯著提高。實(shí)施例6.酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定6.1最適pH的測(cè)定在50。。，分別在pH3.0(甘氨酸-鹽酸)、4.0、5.0、6.0(檸檬酸-檸檬酸鈉)、7.0 (磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀)、8.0 (Tris-鹽酸)的條件下，分別測(cè)定微小毛霉葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算其他溫度條件下的相對(duì)酶活力。
結(jié)果如圖6所示，重組葡萄糖淀粉酶的最適作用pH為4，而重組a -淀粉酶的最適作用PH為5，二者較為接近，從而便于為同時(shí)含有這兩種酶的混合酶制劑的應(yīng)用提供有利的pH條件。6.2最適溫度的測(cè)定在pH5.0 (IOOmM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)條件下，分別在30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、9(rC測(cè)定微小毛霉葡萄糖淀粉酶和a-淀粉酶的酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算其他溫度條件下的相對(duì)酶活力。結(jié)果如圖7所示，重組葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的最適作用溫度為60-80°C，優(yōu)選為70°C。實(shí)施例7.薄層層析分析法分析葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉的產(chǎn)物用PH5.0的緩沖液配置l%(w/v)的可溶性淀粉底物溶液，在Iml底物溶液中加入0.2ml適當(dāng)稀釋的酶液，混勻，置于50°C水浴中反應(yīng)。反應(yīng)48h后，取出在沸水浴中煮沸15min，使酶失活，最大轉(zhuǎn)速離心，然后用0.22 的過濾器過濾后，進(jìn)行薄層層析。用毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣，每個(gè)樣約2 3iU，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)使點(diǎn)樣圈的直徑盡可能小。在250ml密閉玻璃瓶中進(jìn)行展層(氯仿:冰乙酸:水(30:35:5))，待溶劑線跑出硅膠板上沿后繼續(xù)展層30min,取出，烘干。將染色劑(a-萘酚-硫酸試劑:15%a-萘酚乙醇溶液21ml，加13ml濃硫酸，再加81ml乙醇，8ml水混勻，置棕色瓶中，要新鮮配制)噴灑于硅膠板上，烘干，置于100°C烘箱IOmin,取出觀察。結(jié)果如圖8所示，其中，M從`上至下依次表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽三塘和麥芽四糖，樣品I表示本發(fā)明所制備的混合酶制劑，樣品2表示a -淀粉酶，樣品3表示葡萄糖淀粉酶，通過觀察譜圖可知，本發(fā)明所制備的混合酶制劑在水解可溶性淀粉的過程中，由于a-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶發(fā)生了協(xié)同作用而更有利于對(duì)可溶性淀粉的水解。
權(quán)利要求
1.一種共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a-淀粉酶的重組畢赤酵母菌株，其特征在于，所述重組畢赤酵母菌株同時(shí)含有來自微小毛霉菌的葡萄糖淀粉酶基因(Gla)和a-淀粉酶基因(Amy)，其基因序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母菌株，其特征在于，所述重組畢赤酵母菌株能夠同時(shí)分泌表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a-淀粉酶。
3.一種權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法的步驟如下: 1)以微小毛霉菌基因組為模板，克隆得到葡萄糖淀粉酶(Gla)基因，其序列如SEQIDN0.1所示，以pPIC9K為載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9KGla，轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM71，得到重組畢赤酵母KM71/9KGla ； 2)以微小毛霉菌基因組為模板，克隆得到a-淀粉酶(Amy)基因，其序列如SEQIDN0.2所示，以pPICZ a為載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZ a Amy ； 3)將所述重組表達(dá)載體pPICZa Amy轉(zhuǎn)入重組畢赤酵母KM71/9KGla，通過抗生素篩選，得到同時(shí)含有葡萄糖淀粉酶基因和a-淀粉酶基因的重組畢赤酵母菌株KM71/9KGla-Za Amy0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟I)中從微小毛霉菌基因組克隆所述葡萄糖淀粉酶(Gla)基因的上、下游引物序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中從微小毛霉菌基因組克隆所述a-淀粉酶(Amy)基因的上、下游引物序列分別如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
6.一種混合酶制劑，其特征在于，所述混合酶制劑由權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶的重組畢赤酵母菌株制備，包括葡萄糖淀粉酶和a -淀粉酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的混合酶制劑，其特征在于，所述混合酶制劑的最適作用pH為4-5。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的混合酶制劑，其特征在于，所述混合酶制劑的最適作用pH為5。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 所述的混合酶制劑，其特征在于，所述混合酶制劑的最適作用溫度為 60-80。。。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的混合酶制劑，其特征在于，所述混合酶制劑的最適作用溫度為 70。。。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種共表達(dá)葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重組畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法，以及一種由該重組畢赤酵母菌株制備的混合酶制劑。所述重組畢赤酵母菌株同時(shí)含有來自微小毛霉菌的葡萄糖淀粉酶基因和α-淀粉酶基因，其基因序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。由該重組菌株制備的混合酶制劑，糖化酶活力相對(duì)僅攜帶葡萄糖淀粉酶基因的菌株提高了79%，淀粉液化酶活力相對(duì)僅攜帶α-淀粉酶基因的菌株提高了183%。兩種酶的最適作用溫度和最適作用pH均相近，在淀粉水解過程中具有協(xié)同促進(jìn)作用，因而具有較大的應(yīng)用潛力和優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK103114049SQ20131003396
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者魏東芝, 高蓓, 何正貴 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)