一種江蘺內生枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】一種江蘺內生枯草芽孢桿菌按如下方法獲得：取干凈、新鮮的江蘺用無菌海水沖洗3-5次后，分別用75%乙醇和0.02%次氯酸鈉對江蘺進行體外消毒，消毒后研磨并將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)2天；挑取單個形態(tài)各異的菌落反復劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，即得江蘺內生枯草芽孢桿菌NSN2（Bacillus?subtilis?NSN2）。本發(fā)明提供的菌株及其代謝產(chǎn)物抑菌活性強，制備方法簡單，成本低廉，菌株及其代謝產(chǎn)物可應用于醫(yī)藥抑菌、生物防治、食品保鮮、防腐等領域，具有產(chǎn)業(yè)價值。
【專利說明】一種江蘺內生枯草芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)藥領域，特別是一種江蘺內生枯草芽孢桿菌NSN2{Bacillus subti I is NSN2)菌株及該菌株在對細菌和植物病原菌的生長抑制和其代謝產(chǎn)物在抑菌方面的應用。
【背景技術】
[0002]江蘺{G.verrucosa)又名龍須菜、鹿角菜,鳳菜等，是多年生的大型紅藻，屬于紅藻門真紅藻綱、杉藻目江蘺科江蘺屬。江蘺屬共約近100種，江蘺新鮮的藻體具有獨特的風味和營養(yǎng)保健功能，可用作鮑魚餌料或者加工成海洋蔬菜作為風味食品，經(jīng)常食用江蘺，可以用來防治肥胖、膽結石、便秘、腸胃病等代謝性疾病以及降血脂和降膽固醇疾病。另外，研究表明許多海洋活性物質是由海藻共附生菌產(chǎn)生的，海藻共附微生物是一個潛在的資源庫，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今為止尚未被充分利用。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種制備工藝簡單、成本低的江蘺內生枯草芽孢桿菌NSN2{Bacillus subti I is NSN2)菌株，以利用江蘺在細菌和植物病原菌的生長抑制方面、其代謝產(chǎn)物在抑菌方面發(fā)揮作用。
[0004]本發(fā)明的一種江蘺內生枯草芽孢桿菌NSN2 {Bacillus subti I is NSN2)菌株，按如下方法獲得:
a.取干凈、新鮮的江蘺用無菌海水沖洗3-5次后，分別用75%乙醇和0.02%次氯酸鈉對江蘺進行體外消毒，消毒后研磨并將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37 °C恒溫培養(yǎng)2天；
b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，即得江蘺內生枯草芽孢桿菌NSN2(Bacillus subtilis NSN2),該菌的菌體長和寬分別為 1.54-3.08Mm、0.70-0.77Mm,革蘭氏反應為陽性，芽孢為橢圓狀；菌落特征為圓形，較小，邊緣光滑，不透明，白色；過氧化氫酶陽性，能在7%氯化鈉中生長，酸性條件生長，在0-55 °C可生長；該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7082。
[0005]本發(fā)明的一種江蘺內生枯草芽孢桿菌NSN2 (.Bacillus subtilis NSN2)菌株在細菌和植物病原菌的生長抑制方面、其代謝產(chǎn)物在抑菌方面的應用。
[0006]本發(fā)明提供的菌株及其代謝產(chǎn)物抑菌活性強，制備方法簡單，成本低廉，菌株及其代謝產(chǎn)物可應用于醫(yī)藥抑菌、生物防治、食品保鮮、防腐等領域，具有產(chǎn)業(yè)價值。
[0007]本發(fā)明的江蘺內生枯草芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7082。【具體實施方式】
[0008] a.取干凈、新鮮的江蘺用無菌海水沖洗3-5次后，分別用75%乙醇和0.02%次氯酸鈉對江蘺進行體外消毒，消毒后研磨并將200 PL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37 °C恒溫培養(yǎng)2天。
[0009]b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，即得江蘺內生枯草芽孢桿菌NSN2 (Bacillus subtilis NSN2)，該菌的菌體長和寬分別為1.54-3.08Mm、
0.70-0.77ΜΠ1，革蘭氏反應為陽性，芽孢為橢圓狀；菌落特征為圓形，較小，邊緣光滑，不透明，白色；過氧化氫酶陽性，能在7%氯化鈉中生長，酸性條件生長，在0-55°C可生長；該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7082。
[0010]用濾紙片法檢測各純菌株的抑菌活性。
[0011]抑菌活性的檢測:大腸桿菌Escherichia coli (EC)、變形桿菌Proteus vulgaris(PV)、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (SA)、產(chǎn)氣桿菌 Enterobacter aerogenes(EA)和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis (BS)均采用現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。上述均受贈于中科院大連化學物理研究所。將各菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h作指示菌。
[0012]分別用移液槍取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，用無菌三角涂棒涂抹均勻，然后用記號筆在培養(yǎng)皿底部的外面將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿分成六個區(qū)，每個區(qū)分別放入一張濾紙片，再分別用移液槍移取江蘺共附菌株(純菌株)發(fā)酵物樣品10 μ L滴到濾約片中央，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。每個純菌株做3次重復處理，陽性對照為75%酒精，陰性對照為無菌水。觀察指示菌的生長情況，測定抑菌圈的直徑大小。
[0013]如其中NSN2菌株發(fā)酵液對對大腸桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為8.5mm、8.5mm,7.5mm、8.5mm和17mm，對該抑菌活性菌株利用16sRNA分子鑒定確定其為芽孢桿菌屬，通過耐鹽性試驗、對溶菌酶抗性試驗、V.P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)糊精結晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產(chǎn)硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗性、石蕊牛乳實驗、糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、產(chǎn)生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素水解等生理生化試驗反應結果與枯草芽孢桿菌的符合率為93%，該活性菌株為枯草芽孢桿菌，該菌的菌體長和寬分別為1.54-3.08Mm、0.70-0.77Mm，革蘭氏反應為陽性，芽孢為橢圓狀；菌落特征為圓形，較小，邊緣光滑，不透明，白色；過氧化氫酶陽性，能在7%氯化鈉中生長，酸性條件生長，在
0-55 °C可生長。
[0014]c.對NSN2菌株抑菌活性培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)優(yōu)化。首先按照下面的配方進行碳源的優(yōu)化:a.牛肉膏0.3 g、蛋白胨I g、NaC10.5 g、水100 mL ；b.酵母粉0.3 g、蛋白胨I g、NaCl0.5 g、水 100 mL ；c.葡萄糖 0.3 g、蛋白胨 I g、NaCl 0.5 g、水 100 mL ；d.鹿糖 0.3g、蛋白胨 I g、NaC10.5 g、水 100 mL ；e.麥芽糖0.3 g、蛋白胨 I g、NaCl 0.5 g、水 100 mL ；
f.乳糖0.3 g、蛋白胨I g、NaCl0.5 g、水100 Ml。結果表明配方c.葡萄糖0.3 g、蛋白胨I g、NaCl 0.5 g、水100 mL所培養(yǎng)發(fā)酵液抑菌效果最佳。然后按照下面的配方進行氮源的優(yōu)化:a.蛋白胨I g、葡萄糖0.3 g、NaCl 0.5 g、水100 mL ；b.硝酸鈉I g、葡萄糖0.3
g、NaCl0.5 g、水 100 mL ；c.硫酸銨 I g、葡萄糖 0.3 g、NaCl 0.5 g、水 100 mL ；d.氯化銨I g、葡萄糖 0.3 g、NaCl 0.5 g、水 100 mL ；e.草酸銨 I g、葡萄糖 0.3 g、NaCl 0.5 g、水100M1 ；f.硝酸鉀I g、葡萄糖0.3 g、NaCl 0.5 g、水100 mL。結果測得配方a.蛋白胨I
g、葡萄糖0.3 g、NaCl 0.5 g、水100 mL所培養(yǎng)發(fā)酵液抑菌效果最佳。最后依據(jù)正交試驗方案對活性菌株進行抑菌條件優(yōu)化，正交因素水平表如下:
【權利要求】
1.一種江蘺內生枯草芽孢桿菌，其特征在于:按如下方法獲得: a.取干凈、新鮮的江蘺用無菌海水沖洗3-5次后，分別用75%乙醇和0.02%次氯酸鈉對江蘺進行體外消毒，消毒后研磨并將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37 °C恒溫培養(yǎng)2天； b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，即得江蘺內生枯草芽孢桿菌subti I is NSN2)，該菌的菌體長和寬分別為L 54-3.08Mm,0.70-0.77Mm,革蘭氏反應為陽性，芽孢為橢圓狀；菌落特征為圓形，較小，邊緣光滑，不透明，白色；過氧化氫酶陽性，能在7%氯化鈉中生長，酸性條件生長，在0-55°C可生長；該菌株已于2013年I月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCCNo: 7082。
2.—種根據(jù)權利要求1 所述的江蘺內生枯草芽孢桿菌的應用。
【文檔編號】A23B7/155GK103966114SQ201310034670
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權日:2013年1月30日
【發(fā)明者】張付云, 王維才, 劉曄, 楊陽, 何云海 申請人:大連海洋大學, 張付云