一種海參源枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種海參源枯草芽孢桿菌按如下方法獲得：將打撈出水的新鮮海參，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨成均漿后，將研磨液均勻涂布于現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37℃恒溫條件下培養(yǎng)2天；挑取單個形態(tài)各異的菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，得海參源（共附生菌株）枯草芽孢桿菌HS22（BacillussubtilisHS22）菌株。本發(fā)明提供的菌株及其代謝產(chǎn)物抑菌活性強，對植物有促生長作用，并對海蝦無節(jié)幼體具有一定毒性，制備方法簡單，成本低廉，菌株及其代謝產(chǎn)物可應(yīng)用于醫(yī)藥抑菌、抗腫瘤、生物防治、食品保鮮、防腐和化妝品添加劑等領(lǐng)域，具有產(chǎn)業(yè)價值。
【專利說明】一種海參源枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 (.Bacillus subtilis HS22)菌株及其在對細菌和植物病原菌的生長抑制、對植物的促生長、其代謝產(chǎn)物在抑菌方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海參屬棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱動物(Holothuroidea)。全世界約有1200種海參，主要生活在熱帶和溫帶的海洋中，常見的可食海參有刺參、梅花參、白瓜參，這些海參除了食用價值之外，還含有豐富的生物活性物質(zhì)，如海參毒素、海參多糖、海參皂苷、脂肪酸、多肽、海參神經(jīng)節(jié)苷酯等，這些成分具有多種生物活性。另海參體內(nèi)及腸道內(nèi)生活著大量的細菌，這些細菌具有獨特的結(jié)構(gòu)與功能，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒有被充分利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種制備工藝簡單、成本低的海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus subtilis HS22)菌株，以利用海參體內(nèi)的有益物質(zhì)，在細菌和植物病原菌的生長抑制方面、對植物的促生長方面發(fā)揮作用。
[0004]本發(fā)明的一種海參源枯草芽孢桿菌，按如下方法獲得:
a.將打撈出水的新鮮海參，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨成均漿后，將研磨液均勻涂布于現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37°C恒溫條件下培養(yǎng)2天。
[0005]b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，即得海參共附生枯草芽孢桿菌HS22 (Bacillus subtilis HS22)，該菌革蘭氏陽性芽孢桿菌，原生質(zhì)中無不著色顆粒，過氧化氫酶陽性，厭氧不能生長，V.P反應(yīng)陽性，V.P反應(yīng)之后的pH值7.2，對溶菌酶、疊氮化鈉有抗性，能產(chǎn)生卵磷脂酶，PH5.7生長，7%的NaCl中生長，生長溫度15~45°C，單個菌落圓形，白色，菌落邊緣不光，表面有光澤，易挑?。辉摼暌延?013年I月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
[0006]本發(fā)明的一種海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus sub tillsHS22)菌株的在對細菌和植物病原菌的生長抑制、對植物的促生長、其代謝產(chǎn)物在抑菌方面的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus sub tillsHS22)菌株及其代謝產(chǎn)物抑菌活性強，對植物有促生長作用，并對海蝦無節(jié)幼體具有一定毒性，制備方法簡單，成本低廉，菌株及其代謝產(chǎn)物可應(yīng)用于醫(yī)藥抑菌、抗腫瘤、生物防治、食品保鮮、防腐和化妝品添加劑等領(lǐng)域，具有產(chǎn)業(yè)價值。
[0008]本發(fā)明中的海參共附生枯草芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
【具體實施方式】
[0009]本發(fā)明的海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus subtilis HS22)菌株按如下方法獲得，
a.將剛打撈的中國黃海海域的新鮮海參，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨后，將200 μ L研磨液均勻涂布于現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37 °C恒溫培養(yǎng)2天。
[0010]b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，即得海參共附生枯草芽孢桿菌HS22 (Bacillus subtilis HS22)菌株，該菌革蘭氏陽性芽孢桿菌，原生質(zhì)中無不著色顆粒，過氧化氫酶陽性，厭氧不能生長，V.P反應(yīng)陽性，V.P反應(yīng)之后的PH值7.2，對溶菌酶、疊氮化鈉有抗性，能產(chǎn)生卵磷脂酶，PH5.7生長，7%的NaCl中生長，生長溫度15~45°C，單個菌落圓形，白色，菌落邊緣不光，表面有光澤，易挑??；該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
[0011]用濾紙片法檢測各純菌株的抑菌活性。
[0012]抑菌活性的檢測:大腸桿菌co7i (EC)、變形桿菌/7Toiew1S vulgaris(?^0、金黃色葡萄球菌5^<3/7力_770<^9<^^/5.aureus (SA)、產(chǎn)氣桿菌aerogenes(EA)和枯草芽孢桿菌(BS)均采用現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。上述各菌均受贈于中科院大連化學(xué)物理研究所。將各菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h作指示菌。
[0013]分別用移液槍取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，用無菌三角涂棒涂抹均勻，然后用記號筆在培養(yǎng)皿底部的外面將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿分成六個區(qū)，每個區(qū)分別放入一張濾紙片，再分別用移液槍移取海參共附菌株(純菌株)發(fā)酵物樣品10 μ L滴到濾紙片中央，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。每個純菌株做3次重復(fù)處理，陽性對照為75%酒精，陰性對照為無菌水。觀察指示菌的生長情況，測定抑菌圈的直徑大小。
[0014]其中HS22菌株發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，抑菌圈平均直徑為10 mm，對該抑菌活性菌株利用16SRNA分子鑒定確定其為芽孢桿菌屬，通過耐鹽性試驗、對溶菌酶抗性試驗、V.P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)糊精結(jié)晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產(chǎn)硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗性、石蕊牛乳實驗、糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、產(chǎn)生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素水解等生理生化試驗將其鑒定到種，該活性菌株為枯草芽孢桿菌。
[0015]c.采用正交試驗(Table I)對HS22菌株進行抑菌條件優(yōu)化，利用極差分析法對試驗結(jié)果進行分析，得到分別得到抑制不同指示菌的最優(yōu)條件，通過綜合平衡分析和實驗驗證，評價其抑制細菌指示菌活性的較優(yōu)條件為淀粉、硝酸鉀、NaCl, K2HP04、MgS04、FeS04的添加量分別為1.5%、2%、0.05%,0.05%,0.05%,0.001%，控制培養(yǎng)基初始pH為5，40°C培養(yǎng)4 cL
[0016]Tablel Orthogonal factors and levels
【權(quán)利要求】
1.一種海參源枯草芽孢桿菌，其特征在于:按如下方法獲得: a.將打撈出水的新鮮海參，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨成均漿后，將研磨液均勻涂布于現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37°C恒溫條件下培養(yǎng)2天； b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，即得海參共附生枯草芽孢桿菌HS22(Bacillus subtilis HS22)，該菌革蘭氏陽性芽孢桿菌，原生質(zhì)中無不著色顆粒，過氧化氫酶陽性，厭氧不能生長，V.P反應(yīng)陽性，V.P反應(yīng)之后的PH值7.2，對溶菌酶、疊氮化鈉有抗性，能產(chǎn)生卵磷脂酶，PH5.7生長，7%的NaCl中生長，生長溫度15~45°C，單個菌落圓形，白色，菌落邊緣不光，表面有光澤，易挑取；該菌株已于2013年I月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海參源枯草芽孢桿菌的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/02GK103966115SQ201310034682
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月30日
【發(fā)明者】張付云, 劉曄, 王維才, 蒼桂璐, 盧航 申請人:大連海洋大學(xué), 張付云