專利名稱：斧文蛤est序列來源微衛(wèi)星特異引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體是屬于斧文蛤DNA分子遺傳標(biāo)記領(lǐng)域，特別是斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星特異引物，以及利用該特異引物的斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星特異引物的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA (Microsatellite DNA)幾乎存在于所有真核生物基因組中，由I一6個(gè)核苷酸組成的簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats, SSR),是近幾十年發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星具有數(shù)量多、隨機(jī)分布、多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)、共顯性遺傳及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位等領(lǐng)域中。關(guān)于微衛(wèi)星在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的開發(fā)應(yīng)用已有很多的報(bào)道。如:牛東紅等報(bào)道了縊蟶的10個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；Liu等發(fā)現(xiàn)了泥蚶的39個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；馬洪雨等報(bào)道了條斑星鰈的31個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記和圓斑星鰈的40個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；李紅蕾等發(fā)現(xiàn)了櫛孔扇貝EST中的3個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；曲妮妮報(bào)道了合浦珠母貝的9個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；Liao等發(fā)現(xiàn)了銅魚的9個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；ElfStr0m等開發(fā)了扇貝的16個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。這些多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、系譜認(rèn)證、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等研究中。來源于編碼序列cDNA的微衛(wèi)星標(biāo)記，很可能與一些重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)，對于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助選擇育種具有重要的意義。斧文給(Meretrixlamarkii Deshayes),屬軟體動物門(Mollusca),瓣觸綱(Lamellibranchia)、簾給目(Veneroida)、簾給科(Veneridae)、文給屬(Meretrix)貝類。斧文蛤?yàn)闇厮院．a(chǎn)雙殼類，主要集中在日本和中國南海，在我國的廣東、南海、廣西等省份沿海均有分布。但隨著海水污染加劇、堵海筑壩及海灘圍墾等人為活動，導(dǎo)致了斧文蛤自然棲息地的大量喪失，斧文蛤的自然資源量急劇下滑，自然資源量稀缺。因此，分析不同地理野生群體的遺傳多樣性的變化及種群間的親緣關(guān)系，對斧文蛤合理保護(hù)、開發(fā)和利用都有重要指導(dǎo)意義。然而，斧文蛤上可有效利用的微衛(wèi)星標(biāo)記還沒有報(bào)道，嚴(yán)重限制了相關(guān)遺傳學(xué)研究的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，而提供一種斧文蛤EST來源微衛(wèi)星特異引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用上述斧文蛤EST來源微衛(wèi)星特異引物的斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星特異引物的快速檢測方法。該方法具有準(zhǔn)確、靈敏、高效、安全、擴(kuò)增條帶清晰等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀地檢測出斧文蛤不同個(gè)體的基因型，從而快速獲得斧文蛤在基因編碼區(qū)微衛(wèi)星遺傳變異的多態(tài)性圖譜。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，其技術(shù)方案是該特異引物如下表所列:Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ；
退火溫度為45°C，核心重復(fù)序列為(ATG)S ；
Fff-390:F: GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R: AGAGATTATAGTGAACAAAGC ；
退火溫度為48°C，核心重復(fù)序列為(CATT) 6 ；
Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ；
退火溫度為46°C，核心重復(fù)序列為(TG) 17 ；
Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ；
退火溫度為46°C，核心重復(fù)序列為(AATTG) 5 ；
Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ；
退火溫度為45°C，核心重復(fù)序列為(AT) 6 ；
Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火溫度為 45°C，核心重復(fù)序列為(AT) 8。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是包括以下步驟:
(1)斧文蛤基因組DNA的提??；
(2)根據(jù)cDNA數(shù)據(jù)庫中斧文蛤的EST序列，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列；
(3)微衛(wèi)星特異引物的設(shè)計(jì),利用生物學(xué)軟件PrimerPremier5.0在核心重復(fù)序列的兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物，按符合以下參數(shù):引物長度在18_25bp之間；GC含量在40-60%之間；退火溫度在45-60°C之間；PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度在130-300bp之間；
(4)斧文蛤不同地理群體或同一群體不同個(gè)體的基因組DNA的PCR擴(kuò)增；
(5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，獲得電泳數(shù)據(jù)，可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得斧文蛤遺傳變異的多態(tài)性圖譜。從而獲得斧文蛤遺傳變異的多態(tài)性圖譜。進(jìn)一步設(shè)置是所述的微衛(wèi)星特異引物為:
Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ；
退火溫度為45°C，核心重復(fù)序列為(ATG)S ；
Fff-390:F: GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R: AGAGATTATAGTGAACAAAGC ；
退火溫度為48°C，核心重復(fù)序列為(CATT) 6 ；
Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ；
退火溫度為46°C，核心重復(fù)序列為(TG) 17 ；
Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ；
退火溫度為46°C，核心重復(fù)序列為(AATTG) 5 ；
Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ；
退火溫度為45°C，核心重復(fù)序列為(AT) 6 ；
Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火溫度為 45°C，核心重復(fù)序列為(AT) 8。進(jìn)一步設(shè)置是所述步驟(I)中的斧文蛤基因組DNA提取，具體操作如下:剪取斧文蛤肌肉組織100-150mg，至于500W組織提取液中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K，55°C消化3個(gè)小時(shí)；用酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1配成的混合液抽提3次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE緩沖液中；最后將濃度稀釋為100ng/W，并保存在-20°C備用。進(jìn)一步設(shè)置是所述的組織提取液具體成分為10mmol/L Tris-Cl,pH8.0 ；100mmol/L EDTA, pH8.0 ；100 mmol/L NaCl ；0.5% SDS。進(jìn)一步設(shè)置是所述步驟(4)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系為25沿，包括終濃度均為0.4Mfliol/L的上下游引物、終濃度為1.5mmol/L Mg2+、終濃度為0.2mmol/L dNTP、lXPCR buffer,
0.75U Tag DNA聚合酶、基因組DNA模板1.5W，最后補(bǔ)充滅菌水至總體積25耵。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒、特異性的退火溫度退火30秒、72°C延伸45秒，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。本發(fā)明設(shè)計(jì)的斧文蛤6個(gè)EST來源的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記(特異引物)可應(yīng)用于斧文蛤遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管理及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。有益效果:本發(fā)明具有準(zhǔn)確、靈敏、高效、安全、擴(kuò)增條帶清晰等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀地檢測出斧文蛤不同個(gè)體的基因型，從而快速獲得斧文蛤在基因編碼區(qū)微衛(wèi)星遺傳變異的多態(tài)性圖譜，且提供的6個(gè)EST-SSR標(biāo)記可應(yīng)用于不同斧文蛤群體遺傳變異分析和聚類、種質(zhì)資源保護(hù)與管理及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。1、斧文蛤基因組DN A的提取
剪取斧文蛤肌肉組織100-150mg，至于500W組織提取液中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K,55°C消化3個(gè)小時(shí)；用酹、氯仿、異戍醇按體積比25:24:1配成的混合液抽提3次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE緩沖液中；最后將濃度稀釋為lOOng/沿，并保存在-20°C備用。2、斧文蛤EST序列查找及微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)。根據(jù)cDNA庫中斧文蛤EST序列，利用生物學(xué)軟件SSRHUNTER1.3查找微衛(wèi)星核心重復(fù)序列，查找標(biāo)準(zhǔn)為:2 — 5個(gè)堿基重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)> 3次，從而獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列；利用生物學(xué)軟件Primer Premier5.0在核心重復(fù)序列的兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物，按一下參數(shù)標(biāo)準(zhǔn):a.引物長度在18 — 25bp之間；b.GC含量在40% — 60%之間；c.退火溫度在45-60°C之間；d.PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度在130-300bp之間；引物詳細(xì)信息見表I。3、利用上述微衛(wèi)星引物對斧文蛤群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為25沿，包括終濃度均為0.4Mmol/L的上下游引物、終濃度為1.5mmol/L Mg2+、終濃度為0.2mmol/L dNTP、IXPCR buffer, 0.75U Tag DNA聚合酶、基因組DNA模板1.5W，最后補(bǔ)充滅菌水至總體積25耵。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒、特異性的退火溫度退火30秒、72°C延伸45秒，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存?zhèn)溆谩?、PCR產(chǎn)物的電泳檢測
向PCR產(chǎn)物中加入約1/2體積的變性劑(98.0%甲酰胺，IOmmoI/L EDTA，0.25%溴酚藍(lán)，
0.25% 二甲苯氰)，于95°C變性5分鐘，快速冷卻，然后上樣約3W于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)為pBR322/MspI，電泳液位I XTBE^gS 35_40V/cm，電泳約
1.5小時(shí)。電泳完成后進(jìn)行染色和顯色，其操作過程為:首先用10%冰醋酸固定20分鐘，之后用雙蒸水沖洗膠板2次，每次3分鐘；然后用染色液(1.5%0 AgNO3:1.5%。甲醛=v/v)染色30分鐘，之后快速用雙蒸水沖洗2次；最后用顯色液(1.5%。甲醛:3% Na2CO3= v/v )顯色至帶型清楚后用10%冰醋酸終止顯色，再用蒸餾水將凝膠沖洗干凈，即獲得斧文蛤遺傳變異的多態(tài)圖譜。最終，檢測到6個(gè)擴(kuò)增條帶清晰、雜合度高的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)(表I)。表1:
權(quán)利要求
1.一種斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星特異引物，其特征在于包括有: Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ;退火溫度為 45°C，核心重復(fù)序列為(ATG)S ；Fff-390:F: GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R: AGAGATTATAGTGAACAAAGC ;退火溫度為 48°C，核心重復(fù)序列為(CATT) 6 ； Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ;退火溫度為 46°C，核心重復(fù)序列為(TG) 17 ； Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ;退火溫度為 46°C，核心重復(fù)序列為(AATTG) 5 Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ;退火溫度為 45°C，核心重復(fù)序列為(AT) 6 Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火溫度為 45°C，核心重復(fù)序列為(AT)S。
2.一種斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟: (1)斧文蛤基因組DNA的提?。? (2)根據(jù)cDNA數(shù)據(jù)庫中斧文蛤的EST序列，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列； (3)微衛(wèi)星特異引物的設(shè)計(jì)，符合以下參數(shù):引物長度在18-25bp之間；GC含量在40-60%之間；退火溫度在45-60°C之間；PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度在130_300bp之間； (4)斧文蛤不同地理群體或同一群體不同個(gè)體的基因組DNA的PCR擴(kuò)增； (5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，獲得電泳數(shù)據(jù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于:所述的微衛(wèi)星特異引物為:Fff-134:F:ACTACTAGGAACTTGCAT ；R:GACAGTTTGGTTAAGAAT ； 退火溫度為45°C，核心重復(fù)序列為(ATG)S ；Fff-390:F:GCCATAGTAGTCAGAGGG ；R:AGAGATTATAGTGAACAAAGC ； 退火溫度為48°C，核心重復(fù)序列為(CATT) 6 ；Fff-496:F:TTGATCTAGGCAGTCGTT ；R:GGCACTTCGTGTAAACAT ； 退火溫度為46°C，核心重復(fù)序列為(TG) 17 ；Fff-599:F:CTCAATGAATCGGACTGG ；R:ATGAAAACTGGATGTCGC ； 退火溫度為46°C，核心重復(fù)序列為(AATTG) 5 ；Fff-808:F:TTTTACCTTTCCCGAATA ；R:GATGTTACGATGCCACTT ； 退火溫度為45°C，核心重復(fù)序列為(AT) 6 ； Fff-832:F: CTGCCACAGAATCATAGA ；R: CTTCAAATCAGCAACTCA ;退火溫度為 45°C，核心重復(fù)序列為(AT) 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于:所述步驟(1)中的斧文蛤基因組DNA提取，具體操作如下:剪取斧文蛤肌肉組織100-150mg，至于500W組織提取液中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K，55°C消化3個(gè)小時(shí)；用酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1配成的混合液抽提3次；然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE緩沖液中；最后將濃度稀釋為100ng/m，并保存在-20 °C備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于:所述的組織提取液具體成分為10mmol/L Tris-Cl，pH8.0 ；IOOmmoI/L EDTA，pH8.0 ；100 mmol/L NaCl ；0.5% SDS。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于:所述步驟(4)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系為25W，包括終濃度均為0.4Mfliol/L的上下游引物、終濃度為 1.5mmol/L Mg2+、終濃度為0.2mmol/L dNTP、lXPCR buffer,0.75U Tag DNA聚合酶、基因組DNA模板1.5W，最后補(bǔ)充滅菌水至總體積25耵，反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒、特異性的退火溫度退火30秒、72°C延伸45秒，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。 ·
全文摘要
本發(fā)明涉及一種斧文蛤EST序列來源微衛(wèi)星特異引物及其應(yīng)用，包括(1)斧文蛤基因組DNA的提取(２)根據(jù)cDNA數(shù)據(jù)庫中斧文蛤的EST序列，獲得含有SSR重復(fù)的基因序列；(３)SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)；(４)斧文蛤不同地理居群DNA的PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；(5)獲得斧文蛤EST序列區(qū)呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)圖譜，對圖譜分析可得到斧文蛤每個(gè)個(gè)體EST-SSR的基因型。本發(fā)明的檢測方法具有快速、方便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀的檢測出斧文蛤不同個(gè)體的基因型。本發(fā)明可應(yīng)用于斧文蛤群體遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管理、系譜認(rèn)證及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/11GK103146813SQ201310035598
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者劉博 , 柴雪良, 張炯明, 滕爽爽, 邵艷卿, 方軍, 肖國強(qiáng), 閆茂倉, 龐少華 申請人:浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所