專利名稱：一種基于mso/go的水體環(huán)境汞離子檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于汞離子特異性寡核苷酸探針(mercury-specific oligonucleotide, MS0)和氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)的萊離子檢測方法及用于水中汞離子快速檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，由汞引起的環(huán)境污染和中毒事件頻繁爆發(fā)。工業(yè)“三廢”的排放、城鄉(xiāng)垃圾的制造、農(nóng)藥的不合理使用等，使得這個“隱形殺手”正威脅著我們的生活、侵蝕著我們的軀體。其中，我國水體環(huán)境汞污染問題較為突出，據(jù)農(nóng)業(yè)部調(diào)查，我國污灌區(qū)面積約140X 104hm2，遭受重金屬污染的土地面積占污染總面積的64.8%，其中以汞等的污染面積最大。全國目前約有3.2X 104hm2的耕地受到汞的污染，涉及15個省市的21個地區(qū)。2012年4月，全國污染防治工作會議在南京召開，從公布的2011年《重金屬規(guī)劃》考核結(jié)果中看，2011年重金屬污染治理結(jié)果不理想，全國廢水中汞排放量增幅最大，上升26.1%。汞作為引起 全球性環(huán)境污染的重金屬之一，其在環(huán)境中主要以兩種形態(tài)存在，表現(xiàn)為無機汞和有機汞。汞離子(Hg2+)長時間沉積不僅會造成土壤和環(huán)境的不可逆性污染，而且Hg2+通過食物鏈傳遞富集，進而進入人體，蓄積在骨骼與各器官中對大腦、神經(jīng)系統(tǒng)等造成嚴重的破壞，嚴重危害著人類健康。因此，Hg2+的定性分析和定量檢測對環(huán)境監(jiān)測、食品工業(yè)和臨床醫(yī)學等領(lǐng)域都具有重要的意義。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有許多靈敏性和特異性的Hg2+檢測方法逐漸運用到實踐中。傳統(tǒng)的檢測方法有原子吸收分光光度法、原子熒光分光光度法、高效液相色譜法和質(zhì)譜法等，這些檢測法都需要大型儀器，成本昂貴，操作復雜耗時，且需要有熟練的人員操作；而近年來發(fā)展的光化學分析技術(shù)、電化學傳感器技術(shù)等，由于在靈敏度、特異性或操作簡便性等上的缺陷，往往只能對被檢物定性或半定量檢測，仍然無法滿足當前對Hg2+檢測的要求。而新近發(fā)展的納米生物傳感器法具有體積小、簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，很大程度上彌補了這些缺陷，特別是其中利用Hg2+可與MSO之間形成特異錯配結(jié)合(T-Hg2+-T)這一特性構(gòu)建的系列Hg2+生物傳感器近年來逐漸成為研究的熱點，在環(huán)境Hg2+監(jiān)測中有十分廣闊的應用前景。GO是由石墨經(jīng)化學氧化，超聲制備所得。它是一種二維的碳材料，具有電學性能優(yōu)、導熱性能好、力學強度高、比表面積大和水溶性強等優(yōu)點，特別是它具有很好地區(qū)分單雙鏈DNA和極高的熒光猝滅能力，因此也為生物分子的檢測提供了新的思路。GO與生物分子之間的相互作用得到了廣泛的研究。黃維等人設計了一種利用MSO和GO檢測汞離子的突光檢測方法(Xingfen Liu, Likun Miao, Xu Jiang, Yanwen Ma, Quli Fan and WeiHuang.Highly Sensitive Fluorometric Hg2+Biosensor with a Mercury (II)-SpecificOligonucleotide(MSO)Probe and Water-Soluble Graphene Oxide (WSGO).ChineseJournal of Chemistry2011, 29:1031-1035 ;利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測萊離子的突光檢測方法，專利申請?zhí)?201010223065.4.)，但所用MSO是具有28個堿基的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，含有不與Hg2+結(jié)合的環(huán)結(jié)構(gòu)和部分莖結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的汞離子檢測方法存在的不足，提供一種基于MS0/G0的痕量汞離子檢測方法及用于水體環(huán)境汞離子超靈敏檢測的試劑盒。為了能夠降低DNA的合成成本，并提高汞離子檢測的靈敏度，本研究者發(fā)現(xiàn)短序列寡核苷酸比長序列寡核苷酸與GO吸附速率更快而且更緊密，本發(fā)明對MSO進行優(yōu)化設計并提供一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法和試劑盒，以滿足實際環(huán)境監(jiān)測中高效率低成本的要求。本發(fā)明的第一個目的是公開兩條優(yōu)化的MSO序列，去除原有MSO非特異的環(huán)部分(4bp)，截取兩端的莖部分(9bp)，序列分別為5 ’ -TTCTTTCTT-3 ’(熒光標記)和5，-TTGTTTGTT-3’ (未熒光標記)。本發(fā)明的第二個目的是公開一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法。這種新方法可包括以下步驟:(I)將熒光標記和未熒光標記的MSO、GO在緩沖液中混合，室溫反應；(2)將待測水溶液加入到上述溶液中，室溫反應；(3)用熒光分光光度計進行熒光波長曲線的掃描，觀察熒光強度變化，實現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。本發(fā)明的第三個目的是提供一種基于MS0/G0的水中汞離子快速檢測的試劑盒，它含有:(1)60，濃度為0.58/1;(2)熒光標記和未熒光標記的MS0，濃度均為I μ mo I/L ；(3)含有金屬離子的Tris-HCl緩沖液，濃度為20mM，PH為7.4 ;(4)陽性對照溶液和陰性對照溶液；(5)說明書。本發(fā)明的有益效果:(I)靈敏度高，最低檢測限為IOpM ；(2)特異性強，與除Hg2+以外的其它10種金屬離子交叉反應低；(3)價格低廉，優(yōu)化設計后的MSO僅截取原MSO兩端的莖部分(9bp)；(4)操作便捷，無需樣本前處理；(5)具有一定的可重復使用性。

我們成功構(gòu)建了一種基于MSO/和GO的汞離子檢測方法及用于水中汞離子快速檢測的試劑盒。具體涉及通過非共價鍵(η-η疊加)作用力將熒光修飾和未熒光修飾的兩種MSO吸附到GO的表面，利用MSO與汞離子形成T-Hg2+-T的結(jié)構(gòu)，使熒光標記的MSO從GO表面釋放和熒光信號得到恢復，通過檢測溶液中熒光信號的變化情況，實現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的兩條截短的MS0(9bp)，序列更短、成本更低；利用GO對熒光標記和未熒光標記的MSO的影響，實現(xiàn)對Hg2+的定量檢測，且靈敏度更高(IOpM)，與黃維和劉興奮等人報道結(jié)果(最低檢測限為187pM)相比提高了 18倍。本發(fā)明涉及的汞離子檢測方法，在其他金屬離子存在的情況下，依然擁有良好的選擇性，并且實現(xiàn)了可重復使用的實際利用價值。該汞離子檢測方法和試劑盒在不使用任何特殊儀器條件下就可以實現(xiàn)對Hg2+便捷分析，操作簡便，分析速度快，靈敏度高，特異性強，對很多非特異性金屬離子的響應都非常小，特別適合于推廣利用。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明。圖1熒光標記和未熒光標記的MSO用量優(yōu)化設計圖2緩沖液優(yōu)化設計(注=Bufferl表示含有金屬離子Tris-HCl緩沖液，Buffer2表示不含有金屬離子Tris-HCl緩沖液)圖3 GO與Hg2+加樣順序探究圖4 GO用量優(yōu)化設計圖5最佳反應時間確定 圖6 Hg2+熒光檢測靈敏度分析圖7 Hg2+熒光檢測特異性評價圖8熒光檢測混合溶液(注:A為一價金屬離子混合組；B為二價金屬離子混合組；C為堿土金屬混合組；D為一價金屬離子混合組+100 μ M Hg2+ ；Ε為二價金屬離子混合組+100 μ M Hg2+ ；F 為堿土金屬混合組 +100 μ M Hg2+ ；G 為 100 μ M Hg2+)圖9熒光檢測河水模擬標本(注:Α:空白對照組組；Β:河水組；C:10 μ M Hg2+河水組)圖10可重復利用性研究(注:1:去離子水組；2:第一次加入Hg2+ ；3:第一次加入Na2S2O3 ；4:第二次加入 Hg2+)
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。以下是部分本發(fā)明實施例中所用的儀器和設備，其他未注明的實驗條件按照常規(guī)或以其制造廠商所建議的條件:RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津公司)；MiniSpin個人型高速離心機(德國Eppendorf公司);Centrifuge5417R小型臺式高速冷凍離心機(德國 Eppendorf 公司)；Thermo Scientific NanoDrop2000 分光光度計(美國 ThermoScientific 公司)；PURELAB Classic 超純水儀(英國 ELGA LabWater 公司);PHS_3C 型 PH計(上海精密科學儀器有限公司)；電子天平BSA224S (德國sartorius公司)；通風櫥(蘇凈集團安泰公司)；高壓鍋(日本ALP公司)。實施例1 MSO優(yōu)化設計本發(fā)明選用的MSO序列見表1，其中MSO1為黃維等人報道的汞離子特異性寡核苷酸探針(莖環(huán)結(jié)構(gòu))。為了能夠提高汞離子檢測的靈敏度，并降低DNA的合成成本，對MSO1進行優(yōu)化設計，去除非特異的環(huán)部分(4bp)，截取兩端的莖部分(9bp)，分別標記為1^02和MSO3。
表I汞離子特異性寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種基于MSO/GO汞離子檢測用的熒光標記MSO序列:5’ -TTCTTTCTT-3’和未熒光標記 MSO 序列:5’ -TTGTTTGTT-3’。
2.一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，依次包括以下步驟: (1)將突光標記和未突光標記的MSO、GO在緩沖液中混合,室溫反應； (2)將待測水溶液加入到上述溶液中，室溫反應； (3)用熒光分光光度計進行熒光波長曲線的掃描，觀察熒光強度變化，實現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，將熒光標記和未熒光標記的MS0，通過非共價鍵(J1-Ji疊加)作用力吸附到GO表面，如果溶液中不存在汞離子，熒光標記和未熒光標記的MSO會無規(guī)則卷曲，通過強烈的π-π疊加作用而吸附于GO的表面，使得標記于MSO末端的熒光基團由于染料與GO之間的高效電子或能量轉(zhuǎn)移而嚴重猝滅；如果溶液中存在汞離子，這兩種MSO會與汞離子形成T-Hg2+-T的結(jié)構(gòu)，使熒光標記的MSO從GO表面釋放和熒光信號得到恢復；通過檢測溶液中熒光信號的變化情況，可以實現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的突光標記和未突光標記的MSO的序列為權(quán)利要求1所述的序列，突光標記的MSO的序列5’ -TTCTTTCTT-3’和未熒光標記的MSO的序列5’ -TTGTTTGTT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的MSO的濃度均為I μ Μ,熒光標記的染料為熒光素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的GO用量為5 μ 1，濃度 為0.5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的緩沖液為含有IOOmM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2的Tris-HCl緩沖液，PH為7.4，Tris-HCl 濃度為 20mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的室溫反應時間為5分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，所有步驟均需在避光條件下進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述的室溫反應時間為30分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的熒光波長掃描，所用的激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為522nm。
12.—種用于特異性檢測汞離子檢測的MS0/G0試劑盒，其特征在于，試劑盒中含有: (1)G0，濃度為0.5g/L； (2)熒光標記和未熒光標記的MS0，濃度均為Iμ mo I/L ； (3)含有金屬離子的Tris-HCl緩沖液，濃度為20mM，PH為7.4 ; (4)陽性對照溶液和陰性對照溶液； (5)說明書。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特異性檢測汞離子的MS0/G0試劑盒，其特征在于，步驟(4)所述的陽性對照溶液為10iimol/LHgCl2溶液，陰性對照為去離子水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于汞離子特異性寡核苷酸探針(mercury-specific oligonucleotide，MSO)和氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)的汞離子檢測方法及用于水中汞離子快速檢測的試劑盒。利用非共價鍵(π-π疊加)作用力將熒光修飾和未熒光修飾的優(yōu)化MSO吸附到GO的表面，利用MSO與汞離子形成T-Hg2+-T的結(jié)構(gòu)，使熒光標記的MSO從GO表面釋放和熒光信號得到恢復，通過檢測溶液中熒光信號的變化情況，實現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。本發(fā)明所述的方法在不需要任何特殊條件下即可實現(xiàn)對汞離子便捷分析，最低檢測限為10pM，靈敏度大幅提高，并降低了DNA合成成本，為監(jiān)測水中汞離子的污染提供一種簡便、高效、靈敏、高性價比的解決方案，易于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK103173540SQ201310037728
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月3日
發(fā)明者呂建新, 吳文鶴 申請人:溫州醫(yī)學院