專利名稱：一種siRNA表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種siRNA表達(dá)載體及其應(yīng)用，特別的涉及一種用于構(gòu)建siRNA表達(dá)載體的空載體及其重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由dsRNA 剪切形成的 siRNA。siRNA 長 21_25nt，3’ 端突出。siRNA 的 3' 末端 2_nt的突出對靶點識別的特異性起一定的作用，可將其限定在第一個堿基對相鄰的不成對堿基的位置。隨后 siRNA 與 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA_induced silencing complex, RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合在靶mRNA上并將其切斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。近年來以數(shù)以千計的人類和老鼠基因為目標(biāo)創(chuàng)建了 RNAi庫，在哺乳動物中利用小的干涉RNA和短發(fā)夾RNA (short hairpin RNAs, shRNA)來進(jìn)行RNA干涉以使基因沉默已經(jīng)成為強(qiáng)大而有力的生物工具，通過siRNA，利用具有同源性的雙鏈RNA (dsRNA)誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉默，可以迅速阻斷基因活性。
經(jīng)化學(xué)合成的siRNA被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，能發(fā)揮沉默基因的作用，但因其量少，只能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮短暫的效應(yīng)，且由于其合成成本高，在一定程度上限制了其應(yīng)用。現(xiàn)有的對于動物細(xì)胞的siRNA研究中，通過使用帶有RNA Pol III啟動子的質(zhì)粒，對病毒進(jìn)行鈣轉(zhuǎn)或包裝成為慢病毒，對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以達(dá)到RNAi的功能。但這種方法仍然有較大的缺陷，首先RNA Pol III啟動子驅(qū)動能力較弱，僅能驅(qū)動約IOObp大小的片段，同時對啟動子下游的基因的表達(dá)效率不高。其次，對引入的shRNA的檢測需共表達(dá)一個由RNA Pol III啟動子驅(qū)動的報告基因，而該標(biāo)記基因的表達(dá)并不總是與shRNA的表達(dá)相一致。另外，調(diào)控RNA PolIII啟動子的表達(dá)比較困難。
2004 年 Daniel 等(Daniel Boden, et al.，2004，Vol.32，N0.3:1154 1158)，使用pAAV-U6-MCS質(zhì)粒進(jìn)構(gòu)建，克隆得到has-mir-30的前體71nt的片段，將MiR-30替換成tat-shRNA，使用RNA Pol III啟動子，啟動并成功表達(dá)了 MiR-30骨架的tat基因siRNA。這一實驗證明，shRNA導(dǎo)入至MicroRNA的骨架后，可以模擬MicroRNA，形成小片段的siRNA。但這種方法仍然未能擺脫使用RNA Pol III啟動子，雖然可以證明micro RNA骨架可以用于shRNA的表達(dá)，但并沒有解決質(zhì)粒表達(dá)shRNA效率較低的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，現(xiàn)有的siRNA過表達(dá)技術(shù)，主要使用的是RNA模擬物以及RNA Pol III啟動子所啟動的shRNA質(zhì)粒，前者不能對靶基因穩(wěn)定敲減，后者則是存在表達(dá)量較弱的缺點。
本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題的第一個技術(shù)方案是:一種用于構(gòu)建siRNA表達(dá)載體的空載體，其序列從5’到3’依次包括以下序列:
I)來源于CMV RNA聚合酶II依賴型啟動子序列；
2) pr1-MiR21前部片段序列；
3)限制性內(nèi)切酶酶切位點序列；
4)pr1-MiR21后部片段序列；和
5)終止子序列。
其中，所述的RNA聚合酶II依賴型啟動子是來源于CMV (即皰疹病毒亞P科)的啟動子。
成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，初級轉(zhuǎn)錄物稱為pr1-miRNA。pri_miRNA長度從幾百到幾千個堿基不等,帶有5 ‘帽子和3’polyA尾巴，以及I到數(shù)個發(fā)夾徑環(huán)結(jié)構(gòu)。pr1-miRNA經(jīng)剪切可產(chǎn)生約70個堿基的miRNA前體，即pre-miRNA。由于不存在內(nèi)含子，所以pr1-miRNA可以從基因組DNA中直接擴(kuò)增得到。
本發(fā)明中，所述的pr1-MiR21前部片段序列是指pri_MiR21cDNA從MiRNA21前體序列的5’前約200-300nt到3’開始的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的第一個莖干的序列，不包括MiRNA及環(huán)。更佳的，所述的pr1-MiR21前部片段序列是指從MiR21前體的前臂(即莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的第一個莖干的序列)及MiR21前體5’端前200nt-300nt的部分。所述的pri_MiR21前部片段序列可由人肝臟基因組DNA 擴(kuò)增獲得。較佳的，所述pri_MiR21前部片段序列如SEQID N0.1 所示。
所述的pr1-MiR21后部片段序列是指pr1-MiR21cDNA從5’端開始的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的第二個莖干的序列到MiRNA前體的3’端后約200-300nt，不包括MiRNA* (與MiRNA互補(bǔ)的MiRNA)及環(huán)。更佳的，所述的pr1-MiR21前部片段序列是指從MiR21前體的后臂(即莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的第二個莖干的序列)及MiR21前體3’端后200nt-300nt的部分。所述的pri_MiR21后部片段序列可由人肝臟基因組DNA擴(kuò)增獲得。較佳的，所述pri_MiR21后部片段序列如SEQ ID N0.2 所示。
本發(fā)明中所述的pri_MiR21前部片段或后部片段大小各控制在200_300bp，也能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)明目的。
所述的限制性內(nèi)切酶酶切位點可以是常規(guī)的任何限制性內(nèi)切酶可以識別并切割的位點，較佳的可以是Bsm A1.Bsm B1.Bsp CNI (非對稱切割的內(nèi)切酶)酶切位點，最佳的是Bsm BI酶切位點。優(yōu)選的，該酶切位點由5，-3，反向順序為，BsmBI反向序列，SalI ,BsmBI正向序列。該酶切位點序列優(yōu)選的如SEQ ID N0.3所示。
所述的終止子序列是來源于SV40PolyA(猴空泡病毒PolyA，簡稱PolyA)序列，序列是有轉(zhuǎn)錄終止作用和使轉(zhuǎn)錄的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240bp)，含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信號(Polyadenylation signal)。更優(yōu)選的,所述終止子的序列如SEQ IDN0.4所示。
本發(fā)明所述空載體的骨架是常規(guī)的siRNA表達(dá)載體，可以是pCMV、pTR_UF5、pEGFP、pEXPR-1BA3等等。較佳的為pCDH系列質(zhì)粒。
本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題的第二個技術(shù)方案是:一種表達(dá)siRNA的重組載體，其序列從5’到3’依次包括以下序列:
I)來源于CMV RNA聚合酶II依賴型啟動子序列；
2) pr1-MiR21前部片段序列；
3) siRNA正義序列_MiR21環(huán)結(jié)構(gòu)序列-siRNA反義序列；
4) pr1-MiR21后部片段序列；和
5)終止子序列。
其中1)、2)、4)、5)如上文所述。
3)中表示的是插入上述空載體酶切位點的外源的表達(dá)siRNA的基因的序列。所述的siRNA的正義序列和反義序列是任何可以沉默目標(biāo)基因的siRNA的正義序列以及相應(yīng)的反義序列?？梢允且阎母鞣N基因的siRNA的序列，例如可以是Sigma公司的siRNA庫中記載的各種基因的siRNA序列。siRNA也可自行設(shè)計，取所要敲減的基因的mRNA序列的某段(21-23nt)作為siRNA的正義序列，只要能夠沉默該目標(biāo)基因即可。
其中，所述siRNA正義序列是與將被沉默的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的21_23個核苷酸cDNA序列。
所述siRNA反義序列是與所述siRNA正義序列互補(bǔ)的DNA序列。
其中，較佳的，所述的MiR21環(huán)結(jié)構(gòu)序列如SEQ ID N0.5所示。
本發(fā)明載體的制備方法如常規(guī)，可以人工合成，也可以在現(xiàn)有的載體的基礎(chǔ)上加工而成，比如將核酸片段通過限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶等合成。
本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題的第三個技術(shù)方案是:所述的表達(dá)siRNA的重組載體在基因沉默中的用途。可用于基因治療等領(lǐng)域。
在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:1)相對于原有的RNA模擬物轉(zhuǎn)染，本發(fā)明可以實現(xiàn)更高效并且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染；2)相對于原有的RNA Pol III啟動子啟動的shRNA表達(dá)，本發(fā)明采用了 RNA Pol II啟動子，相對于原有的技術(shù)，本發(fā)明可完成更高效的siRNA的表達(dá)；3)本發(fā)明采用了 pri_MiRNA21作為shRNA的骨架，可以避免可能產(chǎn)生大量siRNA互補(bǔ)序列所導(dǎo)致的競爭性抑制，在一定程度上提高RNAi的敲減效率。
本發(fā)明改造構(gòu)建了一種具有RNA Pol II啟動子及pri_MiR21作為骨架的新型質(zhì)粒，可以方便有效地將shRNA無縫連接到pr1-MiR21的骨架上，更高效地表達(dá)siRNA。在使用pr1-MiR21骨架后，即可使得shRNA可以經(jīng)由RNA Pol II啟動子進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)的效率要遠(yuǎn)高于采用RNA Pol III啟動子所啟動的shRNA質(zhì)粒。
本發(fā)明改造了一種p⑶H質(zhì)粒，該質(zhì)粒帶有CMV (RNA Pol II型啟動子)，將pr1-MiR21分為前后約200bp片段兩片，使用帶有酶切位點BsmBI及EcoR1、Sal1、BamHI引物擴(kuò)增pr1-MiR21前部片段，連入pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP載體，再使用帶有Sal 1、BamHI引物擴(kuò)增pr 1-MiR21后部片段，通過酶切連入pCDH_CMV-MCS-pri_MiR21前-EFl-copGFP質(zhì)粒，完成質(zhì)粒的改造。該質(zhì)粒中不包括MiR21、MiR21*以及MiRNA的環(huán)結(jié)構(gòu)(具體設(shè)計見圖1)。
在前片及后片之間，設(shè)計了特有的酶切位點(BsmBI)，該酶切位點可以切斷酶切位點后I位及后5位的堿基，這樣可以避免導(dǎo)入普通酶切位點而造成的堿基的偏移，可保證shRNA無縫連接入MiRNA21骨架之中(質(zhì)粒圖 見圖3)。
通過設(shè)計shRNA的Oligo (寡核苷酸)，將退火后帶有MiR21環(huán)的shRNA通過酶切連接，連入該質(zhì)粒。通過質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染或者包裝病毒，即可過表達(dá)該目標(biāo)基因的siRNA,起到高效并穩(wěn)定的RNAi的效果。


圖1為質(zhì)粒改造構(gòu)建圖。(A)為質(zhì)粒pCDH-CMV-pr1-MiR21-EFl-copGFP的細(xì)部結(jié)構(gòu)，BsmBI的正向位點是酶切該酶切位點3’末端后第一位及其互補(bǔ)鏈第五位的堿基，BsmBI的反向位點是酶切該酶切位點5’末端前第五位及其互補(bǔ)鏈第一位的堿基。(B)為質(zhì)粒pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFIi1-EF1-copGFP的細(xì)部結(jié)構(gòu)，其中，shFlil的正反向鏈結(jié)構(gòu)中加入的為MiR21的環(huán)結(jié)構(gòu)序列。(C)本發(fā)明的siRNA表達(dá)載體。(D)Pri MiRNA21。
圖2 為 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 質(zhì)粒圖譜。
圖 3 為 pCDH-CMV-pr1-MiR21-EFl_copGFP 質(zhì)粒圖譜。
圖 4 為 pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFlil-EFl-copGFP 質(zhì)粒圖譜。
圖5 為 pCDH-CMV-pr1-MiR21-EFl_copGFP 質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
圖 6 為 293T 空白細(xì)胞及 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFl1-EF1-copGFP質(zhì)粒后熒光照片。A，293T空白細(xì)胞，白光100X出，293!'轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞，白光100\ ；C, 293T空白細(xì)胞，熒光100X ;D，293T轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞，熒光100X。
圖 7 為 293T 空白細(xì)胞及 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFl1-EF1-copGFP質(zhì)粒后對于Flil的敲減效率。
圖8 為 H1299 細(xì)胞感染 pCDH-CMV—pr1-MiR21-shFl1-EFl-copGFP 質(zhì)粒包裝的慢病毒后熒光照片，其中H1299-C0N為空白的H1299細(xì)胞，H1299-NC為感染陰性病毒的H1299細(xì)胞，H1299-VL 為感染了 pCDH-CMV- -pr1-MiR21-shFl1-EFl_copGFP 質(zhì)粒包裝的慢病毒后的H1299細(xì)胞。
圖9 為 H1299 細(xì)胞感染 pCDH-CMV—pr1-MiR21-shFl1-EFl-copGFP 質(zhì)粒包裝的慢病毒后對于Flil基因的敲減效率，其中H1299-C0N為空白的H1299細(xì)胞，H1299-NC為感染陰性病毒的 H1299 細(xì)胞，H1299-VL 為感染了 pCDH-CMV—pr1-MiR21-shFl1-EFl-copGFP 質(zhì)粒包裝的慢病毒后的H1299細(xì)胞。
具體實施方式
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用 pr1-miRNA作為骨架并使用RNA Pol II啟動子，對siRNA進(jìn)行表達(dá)，能夠達(dá)到了高效表達(dá)miRNA的目的，并且使得同樣使用RNA Pol II啟動子的報告基因(GFP)能與siRNA的表達(dá)更為一致。
在miRNA骨架的選擇上，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，將pr1-MiR-21作為micro RNA骨架，具有預(yù)料不到的更好的效果。MiR30的轉(zhuǎn)錄本為5p MiRNA,即該MiRNA位于pre_MiRNA的5'末端，其表達(dá)的豐度與其互補(bǔ)的MiR30*表達(dá)差異并不是很大，使用MiRNA30作為骨架表達(dá)siRNA, siRNA的互補(bǔ)鏈也有一定的表達(dá)，siRNA的互補(bǔ)鏈作為siRNA的抑制劑對所產(chǎn)生的siRNA起到競爭性抑制的作用，大大降低作為實用的siRNA的表達(dá)所產(chǎn)生敲減的效率。而采用pr1-MiR-21作為micro RNA骨架，作為一個位于5'末端的miRNA，其互補(bǔ)鏈MiR-21*的表達(dá)在深度測序后顯示，要遠(yuǎn)小于MiR21的表達(dá)量，產(chǎn)生的影響也更小，其對基因的敲減效率更高。
本發(fā)明首先制備pr1-MiR21前部片段(PCR擴(kuò)增)、制備pri_MiR21后部片段(PCR擴(kuò)增)。接著將pr1-MiR21前部片段和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP質(zhì)粒(pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP 質(zhì)粒，購自 System Biosciences, SBI,公司，貨號:CD511B_1)連接，獲得質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-pr1-MiR21前-EFl-copGFP。然后將pri_MiR21后部片段連接入其中，得到質(zhì)粒 pCDH-CMV-MCS-pr1-MiR21-EFl-copGFP，如圖 3。
本發(fā)明然后制備ShFlil退火片段(使用帶有MiRNA環(huán)序列Oligo (寡核苷酸)005及Oligo (寡核苷酸)006進(jìn)行退火)。接著連接ShFlil退火片段及質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-pr1-MiR21-EF1-copGFP,獲得最終改造質(zhì)粒 pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFl1-EFl_copGFP，如圖 4。
用該最終改造質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。抽提轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR方法檢測Flil基因敲減效率。可見，轉(zhuǎn)染最終改造質(zhì)粒p⑶H-CMV-pr1-MiR21-shFl1-EFl-copGFP后，293T細(xì)胞中Flil基因的表達(dá)量有明顯降低，降低了原水平的80%。
本發(fā)明還使用最終改造質(zhì)粒pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFl1-EFl-copGFP包裝慢病毒，熒光拍照記錄轉(zhuǎn)染效率。感染后觀察熒光，拍照幾率熒光效率并推算病毒滴度約2 X IO6左右。
本發(fā)明還使用 pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFl 1-EFl-copGFP 慢病毒感染 H1299 細(xì)胞，抽提感染病毒后H1299細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR方法檢測Flil基因敲減效率?？梢?，經(jīng)過pCDH-CMV-pr1-MiR21-shFl 1-EFl-copGFP慢病毒感染，H1299細(xì)胞的Flil基因明顯下調(diào)，基因的表達(dá)量降低了原表達(dá)的90%以上。
下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例1
實驗試劑及器材:
主要儀器為:5417R臺式冷凍高速離心機(jī)，thermo公司，商品號cat#5417R ；
PCR 儀，cat#2500 ;
ThermoForma310 系列直熱式 CO2 培養(yǎng)箱，thermo 公司，cat#3111 ；
酶標(biāo)儀Biotek 公司，VE-186 ；
qPCR 儀，BioRad 公司，CFX Connect，商品號:BR001139。
主要試劑為:PrimerSeript*+反轉(zhuǎn)錄酶，Takara公司，商品號:cat#U1240 ；
E.coli Poly(A)聚合酶，NEB 公司，商品號:#M0276S ；
pCDH-CMV-MCS-EF 1-copGFP 質(zhì)粒(質(zhì)粒圖見圖 2)，購自 SystemBiosciences(SBI)公司，貨號:CD511B-1 ；
內(nèi)切酶:EcoRI,NEB 公司，cat#R0101V ；SalI, NEB 公司，cat#R0138V ；BsmBI,NEB 公司，cat#R0580L ；BamHI, NEB 公司，cat#0136V ；
人肝臟抽提的基因組DNA，購自杭州贊道科技有限公司，BioDev貨號ZD10-6404 ；
DH5a感受態(tài)細(xì)胞，購自北京艾比根生物技術(shù)有限公司，貨號:C1041 ;
5 X退火緩沖液,碧云天公司，商品號:D0251 ；
GXD kit iq SYBR Green , Bio-Rad 公司，商品號:1708882AP。
293T細(xì)胞株，購自中科院細(xì)胞庫，商品號:GNHul7 ；
H1299細(xì)胞株，購自中科院細(xì)胞庫，商品號:TCHul60 ；
DMEM/ 高糖培養(yǎng)基購自 Hyclone，貨號:SH30243.0lB
改良RPM1-1640 培養(yǎng)基，購自 Hyclone，貨號:SH30809.0lB ；
FBS，胎牛血清，購自普飛生物，貨號:1101-500 ；
SP (Penicillin-Streptomycin solution,青霉素 / 鏈霉素雙抗)，購自 Hyclone,貨號 J121071 ；
I rizol；試劑，購自 Invitrogen 公司，貨號:15596-026 ；
SYBR'* 突光染料:IQ SYBR^ Green Super Mix,購自 BioRad 公司，貨號:170-8880AP ；
無水乙醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:10009218 ；
異丙醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:80109218 ；
氯仿，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:10006818 ；
無水氯化鈣，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:SCRCCSDS100058 ；
HEPES，購自上海源聚生物科技有限公司，貨號:N0.7365-45-9 ；
NaCl，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:10019318 ；
KC1，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:10016318 ；
Na2HPO4，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:20040617 ；
Dextrose (葡萄糖)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號:K4913901
陰性慢病毒:pSCN_陰性滿病毒顆粒，購自紐恩生物，貨號:NED1120。
1.引物合成
引物 001: CGGAATTCTGATTGAACTTGTTCATTTTGT。
引物002:
CGGGATCCCGCCCGTCGACCGTCTCCCCGACAAGGTGGTACA。
弓丨物OO3:CCCGTCGACCGTCTCTCTGACATTTTGGTATCTTTCATC。
引物OO4: CGGGATCCAAGACTATCCCCATTTCTCCA。
引物005:
TCGGGGCTGTTGTCACACCTCAGTTACTGTTGAATCTCATGGTAACTGA GGTGTGACAACAGCT。
引物006:
TCAGAGCTGTTGTCACACCTCAGTTACCATGAGATTCAACAGTAACTG AGGTGTG ACAACAGCC。
引物007:GATGGCAAGGAACTGTGTA。
引物008:TGAGGTAACTGAGGTGTGA。
其中引物001/002用于擴(kuò)增pr1-Mirco RNA-21的前部片段，其中導(dǎo)入了EcoRI, BsmBI, SalI及BamHI酶切位點；引物003/004用于擴(kuò)增priMircoRNA21的后部片段，其中導(dǎo)入了 Sail, BsmBI及BamHI酶切位點；引物005/006為帶有MiRNA環(huán)序列的shFlil退火用Oligo (寡核苷酸)序列；引物007/008為Flil基因檢測引物對。
2.對 pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP 質(zhì)粒進(jìn)行改造
對pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP質(zhì)粒(見圖2)進(jìn)行酶切，并分別連入pri_MiR21的前部片段及后部片段，改造成為pCDH-CMV-pr1-MiR21
-EF1-copGFP質(zhì)粒，改造流程示意圖見圖5。
I)模板DNA為人肝臟基因組DNA (購自杭州贊道科技有限公司，貨號ZD10-6404)。使用引物001及002擴(kuò)增pr1-MiR21前部片段，使用引物003及004擴(kuò)增pri_MiR21后部片段，PCR反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.一種用于構(gòu)建siRNA表達(dá)載體的空載體，其特征在于，其序列從5’到3’依次包括以下序列: 1)來源于CMVRNA聚合酶II依賴型啟動子序列； 2)pr1-MiR21前部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID N0.1所示； 3)限制性內(nèi)切酶酶切位點序列； 4)pr1-MiR21后部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；和 5)終止子序列。
2.如權(quán)利要求1所述的空載體，其特征在于，所述的限制性內(nèi)切酶酶切位點是BsmBI酶切位點。
3.如權(quán)利要求1所述的空載體，其特征在于，所述的終止子序列是來源于SV40PolyA的序列。
4.如權(quán)利要求1所述的空載體，其特征在于，所述空載體的骨架是PCDH質(zhì)粒。
5.一種表達(dá)siRNA的重組載體，其序列中包括以下序列，其特征在于，其序列從5’到3’依次包括以下序列: 1)來源于CMVRNA聚合酶II依賴型啟動子序列； 2)pr1-MiR21前部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID N0.1所示； 3)siRNA正義序列-MiR21環(huán)結(jié)構(gòu)序列-siRNA反義序列； 4)pr1-MiR21后部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；和 5)終止子序列。
6.如權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述的MiR21環(huán)結(jié)構(gòu)序列如序列表中SEQ ID N0.5 所示。
7.如權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述的限制性內(nèi)切酶酶切位點是BsmBI酶切位點。
8.如權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述的終止子序列是來源于SV40PolyA的序列。
9.如權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述空載體的骨架是p⑶H質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求5 -9任一項所述的表達(dá)siRNA的重組載體在基因沉默中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于構(gòu)建siRNA表達(dá)載體的空載體及其重組載體和應(yīng)用。該空載體從5’到3’依次包括1)來源于CMV RNA聚合酶II依賴型啟動子序列；2)pri-MiR21前部片段序列SEQ ID NO.1；3)限制性內(nèi)切酶酶切位點序列；4)pri-MiR21后部片段序列SEQ ID NO.2；5)終止子序列。在限制性內(nèi)切酶酶切位點插入序列siRNA正義序列-MiR21環(huán)結(jié)構(gòu)序列-siRNA反義序列，即得siRNA重組表達(dá)載體。本發(fā)明采用RNA Pol II啟動子，可方便有效地將shRNA連接到pri-MiR21骨架上，使shRNA經(jīng)由RNAPol II啟動子穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)高效，提高了RNAi的敲減效率。
文檔編號C12N15/85GK103205461SQ20131003894
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者姚遠(yuǎn)颋, 王海峰, 費倩嵐, 談竹君, 勞昕元 申請人:上海黃離生物科技有限公司