一種促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法。本發(fā)明方法從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得大量脂肪源細(xì)胞，同時(shí)采用納米分子探針標(biāo)記，MRI動(dòng)態(tài)示蹤其對(duì)不同時(shí)期血管損傷的修復(fù)，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GFP-ADSCs能高表達(dá)periostin蛋白，periostin能調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示了過表達(dá)periostin的ADSCs體內(nèi)移植能促進(jìn)缺血下肢血管新生。本發(fā)明方法能為臨床實(shí)踐中改善干細(xì)胞移植治療嚴(yán)重肢體缺血性疾病的療效提供新的參考策略和思路。
【專利說明】—種促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人口的老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的改變,動(dòng)脈粥樣硬化(arterial sclerosis, AS)所導(dǎo)致的外周動(dòng)脈疾病(PAD)的發(fā)病率逐年升高，周圍動(dòng)脈閉塞或狹窄引起的肢體缺血、缺氧、壞死嚴(yán)重影響和危害中老年人的健康。目前臨床上現(xiàn)有技術(shù)的內(nèi)科藥物治療、外科手術(shù)和腔內(nèi)介入治療(球囊擴(kuò)張及支架)等方法，雖能不同程度地改善患者的病情和預(yù)后，但部分患者的遠(yuǎn)期療效尚不理想，對(duì)部分已失去手術(shù)和介入治療機(jī)會(huì)的終末期患者甚至面臨截肢的嚴(yán)重后果。因此，急需尋找一種新的治療方法來提高療效、改善下肢缺血患者的預(yù)后。
[0003]隨著再生醫(yī)學(xué)及臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展，干細(xì)胞移植治療缺血性疾病展現(xiàn)了較好的臨床應(yīng)用前景，為下肢缺血患者帶來新的希望。有研究發(fā)現(xiàn)，與自體骨髓和外周血干細(xì)胞相比，脂肪組織供區(qū)豐富，脂肪干細(xì)胞(ADSCs)采集更方便、體外擴(kuò)增能力更強(qiáng)，免疫源性相對(duì)較低。已有研究相繼證實(shí)將自體或異體脂肪干細(xì)胞(ADSCs)移植用于缺血下肢的治療，可以促進(jìn)新生血管的形成，但同時(shí)國內(nèi)外大量文獻(xiàn)及本申請(qǐng)發(fā)明人的前期研究結(jié)果均表明該干預(yù)方案對(duì)嚴(yán)重肢體缺血性疾病的療效不佳，其療效尚有待提高。研究還進(jìn)一步證實(shí):移植的ADSCs在缺血部位的存活、遷移歸巢及促進(jìn)血管新生的能力均顯減弱，是影響療效的關(guān)鍵。
[0004]Periostin從小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3_ElcDNA文庫中克隆出的一種具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和粘附的功能骨粘附分子(Takeshita ;1993年)，曾命名為成骨細(xì)胞特異因子(0SF-2),其為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白的一種。1999 年 Horiuchi 等在骨膜和牙周韌帶中發(fā)現(xiàn)該蛋白并重新命名為periostin。所述Periostin蛋白的分子量約為90KDa，其包含的四個(gè)氨基酸序列與果蠅的成束蛋白基因fasciclin I (FAS I)密切相關(guān)。之前的研究認(rèn)為該蛋白僅特異性表達(dá)于骨組織，目前越來越多的研究證實(shí)其在牙周韌帶、皮膚、腫瘤、心臟瓣膜等組織中均有表達(dá)。還有研究發(fā)現(xiàn)periostin在正常的血管組織中不表達(dá)，但當(dāng)肌肉、血管受到損傷、低氧等刺激時(shí)卻表達(dá)升高；因此，相關(guān)研究人員推測該periostin蛋白可能與血管損傷修復(fù)有著密切的關(guān)系。其中,Gyongyosi等發(fā)現(xiàn)在頸動(dòng)脈球囊損傷血管內(nèi)膜后，periostin蛋白于血管損傷后3天及7天分別在血管中膜以及血管內(nèi)膜中開始表達(dá)，且在血管損傷的晚期階段28天仍在血管內(nèi)膜中高表達(dá)；Stanton等發(fā)現(xiàn)在平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)periostin基因能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力，而periostin特異性抗體能阻斷該效應(yīng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺氧可誘導(dǎo)periostin蛋白在肺動(dòng)脈血管平滑肌中表達(dá)，表明在慢性缺氧狀態(tài)下periostin蛋白可參與肺血管的重構(gòu)；臨床實(shí)踐研究觀察到，下肢缺血或組織損傷時(shí)導(dǎo)致的局部肌肉組織處于低灌流狀態(tài)，其必然導(dǎo)致創(chuàng)傷愈合組織內(nèi)細(xì)胞處于低氧、低營養(yǎng)的應(yīng)激條件下，業(yè)有研究證實(shí)低氧能夠直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞或者干細(xì)胞的凋亡；Ouyang等觀察腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在低氧刺激下的反應(yīng),結(jié)果顯示periostin不但能夠抑制低氧狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞的凋亡，還能抑制應(yīng)激狀態(tài)(低氧、低營養(yǎng)狀態(tài))所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；Kuhn及Dorn等研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死大鼠模型，經(jīng)periostin治療數(shù)周后心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期并增殖分化，治療組梗死面積較非治療組明顯減小，且梗死區(qū)及其周圍區(qū)域新生毛細(xì)血管及小動(dòng)脈血管密度均高于非治療組Jiriwardena等采用組織形態(tài)學(xué)分析方法檢測口腔鱗癌組織中的血管密度，證實(shí)過表達(dá)periostin的組織中血管密度明顯增高，對(duì)體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用不同濃度的periostin處理并進(jìn)行小管評(píng)分，結(jié)果顯示periostin能以劑量依賴的方式促進(jìn)毛細(xì)血管新生。上述研究均表明:periostin能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移、歸巢以及新生血管的形成。但是，ADSCs遷移到內(nèi)皮損傷部位的數(shù)量及再內(nèi)皮化或再血管化的效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的Periostin在脂肪干細(xì)胞(ADSCs)中表達(dá)水平低的缺陷和不足，提供一種促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法。
[0006]本發(fā)明的方法，以腺病毒為載體，采用基因轉(zhuǎn)染的方式，使干細(xì)胞過表達(dá)periostin,經(jīng)體內(nèi)、體外試驗(yàn)證實(shí),所述的periostin能促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生；本發(fā)明方法能為臨床實(shí)踐中改善干細(xì)胞移植治療嚴(yán)重肢體缺血性疾病的療效提供新的參考策略和思路。
[0007]具體而言，本發(fā)明的促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法，其特征在于，其包括:從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得大量脂肪源細(xì)胞，同時(shí)采用納米分子探針標(biāo)記，MRI動(dòng)態(tài)示蹤其對(duì)不同時(shí)期血管損傷的修復(fù)；其包括步驟:
[0008](I)用包括膠原酶和酵素酶的消化酶溶液分離、篩選獲得干細(xì)胞，本發(fā)明的實(shí)施例中獲取的干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)GFP小鼠的脂肪源細(xì)胞(GFP-ADSCs)，對(duì)脂肪源細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定及流式分析鑒定；
[0009](2)以腺病毒為載體，采用基因轉(zhuǎn)染的方式，periostin轉(zhuǎn)染GFP-ADSCs，使GFP-ADSCs過表達(dá)調(diào)控蛋白；
[0010](3)檢測periostin調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的水平；
[0011](4)相關(guān)通路阻斷劑等共培養(yǎng)檢測GFP-ADSCs遷移、誘導(dǎo)分化能力、低氧抗凋亡能力，測定periostin調(diào)控ADSCs的抗凋亡、促增殖、促遷移能力的變化；
[0012](5)檢測獲得的過表達(dá)periostin的GFP-ADSCs在缺血組織中存活及遷移浸潤及促血管新生能力。
[0013]本發(fā)明方法中，步驟⑴中干細(xì)胞可為各種干細(xì)胞，包括成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的全能干細(xì)胞；
[0014]本發(fā)明方法中，步驟(I)中的消化酶溶液中膠原酶NB4和酵素酶的濃度為
0.05-0.5%:
[0015]本發(fā)明方法中，步驟(I)的對(duì)脂肪源細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定及流式分析鑒定(CD11B/CD34/CD31/CD45/KDR/CD90/HLA-1/MHC-2 等);
[0016]本發(fā)明方法中，步驟(2)的調(diào)控蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)成分；本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，調(diào)控蛋白為periostin ；[0017]本發(fā)明方法中，步驟(2)的periostin轉(zhuǎn)染GFP-ADSCs的濃度為0-1000 μ mol/ml，最佳的濃度為10-100 μ mol/ml，標(biāo)記的細(xì)胞量為O-1XlO8 ；
[0018]本發(fā)明方法中，通過觀察再生內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光、流式檢測⑶31、vWF, SMA的表達(dá)情況；
[0019]本發(fā)明方法中，進(jìn)行部分標(biāo)本的組織學(xué)觀察(HE，油紅，免疫熒光染色，透射電鏡等)，觀察小血管的密度及數(shù)量；
[0020]本發(fā)明方法中，通過Western-blot和Realtime-PCR測定periostin調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及促進(jìn)血管新生的能力。
[0021]本發(fā)明方法，從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得大量脂肪源細(xì)胞，同時(shí)采用納米分子探針標(biāo)記，MRI動(dòng)態(tài)示蹤其對(duì)不同時(shí)期血管損傷的修復(fù)，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 GFP-ADSCs能高表達(dá)periostin蛋白,periostin能調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示了過表達(dá)periostin的ADSCs體內(nèi)移植能促進(jìn)缺血下肢血管新生。本發(fā)明方法能為臨床實(shí)踐中改善干細(xì)胞移植治療嚴(yán)重肢體缺血性疾病的療效提供新的參考策略和思路。
[0022]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠腹股溝脂肪組織中分離獲得GFP-ADSCs，
[0024]圖A為P3代光鏡下GFP-ADSCs，圖B為熒光顯微鏡下ADSCs發(fā)綠色熒光；流式檢測發(fā)現(xiàn)ADSCs高表達(dá)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記⑶90、⑶105、Sca-l，而造血系及內(nèi)皮細(xì)胞系等標(biāo)記⑶I lb、⑶31、⑶34、⑶45、⑶83、⑶133表達(dá)較低，免疫源性MHC-2陰性。
[0025]圖2:圖A為免疫熒光染色鑒定periostin在轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的GFP-ADSCs的表達(dá)情況，可見經(jīng)轉(zhuǎn)然后P-ADSCs高表達(dá)periostin蛋白；圖B為Western Blot檢測轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的GFP-ADSCs表達(dá)periostin的差異；圖C數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖進(jìn)一步證實(shí)P-ADSCs高表達(dá)periostin 蛋白。
[0026]圖3 =Annexin檢測低氧培養(yǎng)條件下GFP-ADSCs的凋亡情況，其中顯示，經(jīng)periostin基因轉(zhuǎn)染的GFP-ADSCs可以減少細(xì)胞的凋亡。
[0027]圖4:研究證實(shí)GFP基因可以示蹤ADSCs促進(jìn)缺血下肢的血管新生，但是新生血管數(shù)量及密度較低，其中，
[0028]A為熒光顯微鏡下可以觀察示蹤色的GFP-ADSCs ；B為ADSCs可以促進(jìn)血管新生，但是新生血管數(shù)量及密度較低。
[0029]圖5:經(jīng)periostin基因轉(zhuǎn)染的GFP-ADSCs可以明顯促進(jìn)缺血下肢的血管新生,新生血管較多，其中，M為⑶31染色；N為SMA染色；0為F4/80染色；P為MAC-3染色。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生實(shí)驗(yàn)，[0031](I)體外實(shí)驗(yàn):研究periostin調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；
[0032]GFP轉(zhuǎn)基因小鼠腹股溝脂肪組織中經(jīng)消化酶溶液處理分離獲得GFP-ADSCs，以腺病毒為載體，采用基因轉(zhuǎn)染的方式，使GFP-ADSCs過表達(dá)periostin及相關(guān)通路阻斷劑等共培養(yǎng)檢測GFP-ADSCs體外遷移、多向誘導(dǎo)分化能力、低氧抗凋亡能力測定，結(jié)果顯示，GFP-ADSCs高表達(dá)periostin蛋白，經(jīng)periostin基因轉(zhuǎn)染的GFP-ADSCs可減少細(xì)胞的凋亡；熒光顯微鏡下ADSCs發(fā)熒光；流式檢測顯示ADSCs高表達(dá)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記⑶90、CD105、Sca-Ι，而造血系及內(nèi)皮細(xì)胞系等標(biāo)記CDllb、CD31、CD34、CD45、CD83、CD133表達(dá)較低，免疫源性MHC-2陰性；
[0033]所述的periostin轉(zhuǎn)染GFP-ADSCs的濃度為0-1000 μ mol/ml,標(biāo)記的細(xì)胞量為O-1XlO8 ；
[0034]所述的的消化酶溶液中膠原酶NB4和酵素酶的濃度為0.05-0.5% ；
[0035](2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):測定過表達(dá)periostin的ADSCs體內(nèi)移植促進(jìn)缺血下肢血管新生的能力；
[0036]將獲得的過表達(dá)periostin的GFP-ADSCs，體內(nèi)移植修復(fù)Apo E基因敲除的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠下肢缺血，測定過表達(dá)periostin的GFP-ADSCs在缺血組織中存活及遷移浸潤能力，以及缺血組織的新生血管密度及肢體缺血的變化；
[0037]其中，通過觀察再生內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光、流式檢測⑶31、vWF, SMA的表達(dá)情況；部分標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)觀察(HE，油紅，免疫熒光染色，透射電鏡等)，觀察小血管的密度及數(shù)量；通過Western-blot和Realtime-PCR探討periostin調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及促進(jìn)血管新生能力；結(jié)果顯示，ADSCs可促進(jìn)血管新生，但是新生血管數(shù)量及密度較低；經(jīng)periostin基因轉(zhuǎn)染的GFP-ADSCs可明顯促進(jìn)缺血下肢的血管新生，新生血管較多，本發(fā)明方法，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 periostin調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及低氧刺激下抗凋亡的能力；經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示了過表達(dá)periostin的ADSCs體內(nèi)移植能促進(jìn)缺血下肢血管新生。
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)干細(xì)胞粘附、遷移、歸巢及血管新生的方法，其特征在于，其包括:從脂肪組織中利用膠原酶和酵素酶分離、篩選獲得脂肪源細(xì)胞，同時(shí)采用納米分子探針標(biāo)記，MRI動(dòng)態(tài)示蹤其對(duì)不同時(shí)期血管損傷的修復(fù)；其包括步驟: (1)用包括膠原酶和酵素酶的消化酶溶液分離、篩選獲得干細(xì)胞或脂肪源細(xì)胞，對(duì)脂肪源細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定及流式分析鑒定； (2)以腺病毒為載體，采用基因轉(zhuǎn)染的方式，periostin轉(zhuǎn)染脂肪源細(xì)胞使脂肪源細(xì)過表達(dá)調(diào)控蛋白； (3)檢測periostin調(diào)控干細(xì)胞或脂肪源細(xì)胞粘附、遷移及低氧刺激下抗 凋亡的水平； (4)相關(guān)通路阻斷劑共培養(yǎng)檢測干細(xì)胞或脂肪源細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)分化能力、低氧抗凋亡能力，測定periostin調(diào)控干細(xì)胞或脂肪源細(xì)胞的抗凋亡、促增殖、促遷移能力的變化； (5)檢測獲得的過表達(dá)periostin的干細(xì)胞或脂肪源細(xì)胞的存活及遷移浸潤及促血管新生能力。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中干細(xì)胞為成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的全能干細(xì)胞。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的消化酶溶液中膠原酶NB4和酵素酶的濃度為0.05-0.5%。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)的對(duì)脂肪源細(xì)胞進(jìn)行CDllB/⑶34/⑶31/⑶45/KDR/⑶90/HLA-1/MHC-2免疫熒光鑒定及流式分析鑒定。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的調(diào)控蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)成分，選自調(diào)控蛋白periostin。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的periostin轉(zhuǎn)染脂肪源細(xì)胞的濃度為Ο-ΙΟΟΟμπιοΙ/ml，標(biāo)記的細(xì)胞量為0-1 X 108。
7.按權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述步驟(2)的periostin轉(zhuǎn)染脂肪源細(xì)胞的濃度為 10-100 μ mol/ml。
8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通過觀察再生內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光、流式檢測CD31、vWF、SMA的表達(dá)情況。
9.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，通過HE，油紅，免疫熒光染色和透射電鏡檢測組織標(biāo)本的小血管的密度及數(shù)量。
10.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，通過Western-blot和Realtime-PCR測定periostin調(diào)控脂肪干細(xì)胞粘附、遷移及促進(jìn)血管新生的能力。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103969442SQ201310041328
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月1日
【發(fā)明者】陸信武, 秦金保, 李祥祥, 葉開創(chuàng), 楊心蕊, 蔣米爾 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院