專(zhuān)利名稱(chēng)：一種菲利普孢囊線蟲(chóng)lamp快速檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥孢囊線蟲(chóng)(cereal cyst nematode, CCN)是全世界范圍內(nèi)分布的禾谷類(lèi)作物重要病原線蟲(chóng)。該線蟲(chóng)自1874年在德國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，目前在全世界40多個(gè)國(guó)家均有發(fā)生和危害，其中中國(guó)、澳大利亞、歐洲、印度、中東等地區(qū)的禾谷孢囊線蟲(chóng)病危害嚴(yán)重并遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前小麥孢囊線蟲(chóng)組(Heterodera avenae group)共包括12種孢囊線蟲(chóng),其中以禾谷孢囊線蟲(chóng)(H.avenae)、菲利普孢囊線蟲(chóng)(H.filipjevi)和大麥孢囊線蟲(chóng)(H.1atipons)危害最為嚴(yán)重。在我國(guó)，禾谷孢囊線蟲(chóng)自1989年在湖北天門(mén)縣矮黃麥株上首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)[陳品三，王明祖，彭得良.我國(guó)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)(Heterodera avenae wollenweber)鑒定研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，1992，22 (4): 339— 343]，目前在我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)的河北、河南、北京、山西、內(nèi)蒙古、青海、湖北、安徽等16省、市和自治區(qū)均有發(fā)生和分布，危害面積達(dá)400萬(wàn)hm2以上，且有逐漸蔓延之勢(shì)，目前已成為危害我國(guó)麥類(lèi)作物的重要病原線蟲(chóng)(彭德良等，我國(guó)小麥孢囊線蟲(chóng)的新發(fā)生分布地區(qū).中國(guó)線蟲(chóng)學(xué)研究第二卷，2008，2:344-345;黃文坤，葉文興，王高峰，龍海波，歐師琪，彭德良，寧夏地區(qū)禾谷孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生與分布.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011, 30(1): 74-77)。據(jù)調(diào)查，一般病田可減產(chǎn)20%_40%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)達(dá)70%以上[彭德良，張東升，齊淑華，陳品三等，我國(guó)小麥孢囊線蟲(chóng)(Heterodera avenae)發(fā)生分布區(qū)域和防治初步研究.植物保護(hù)研究進(jìn)展，1995，p53-56.中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社]。1981年菲利普孢囊線蟲(chóng)最先在塔吉克斯坦被報(bào)道(Madzhidov，A.R.1981.Bidera filipjevi n.sp.(Heteroderina:Tylenchida)inTadzhikistan.1zv.Akad.NaukTadzh.SSR Otd.Biol.Nauk2:40-44)，目前已經(jīng)在歐洲、亞洲、北美均有發(fā)生和分布(Smiley, R.ff., Yan, G.P., and Handoo, Z.A.2008.First Record ofthe CystNematode Heterode ra filipjevi on Wheat in Oregon.Plant Disease92(7):1136 ；Ho I gado, R., Andersson, S., Rowe, J.A., and Magnusson, C.2004First recordofHeterodera filipjevi in Norway.Nematologia Mediterranea32(2):205-211 ； X 彭德良等最先在我國(guó)河南湯陰發(fā)現(xiàn)菲利普孢囊線蟲(chóng)危害(Peng，D.L.，Ye, ff.X.，Peng, H.，andGu,X.C.2010.First Report ofthe Cyst Nematode(Heterodera filipjevi)on Wheatin Henan Province, China.Plant Disease94 (10):1262-1262.)。目前該線蟲(chóng)被認(rèn)為是國(guó)際小麥等禾谷類(lèi)作物生產(chǎn)中面臨的潛在威脅性線蟲(chóng)。菲利普孢囊線蟲(chóng)危害也非常嚴(yán)重，在土耳其該線蟲(chóng)造成冬小麥減產(chǎn)35% (Nicol, J.M.，Bolat, N.，Sahin,
E., Tiilek, A., Ylldlrlm, A.F., Yorgancllar, A., Kaplan, A., and Braun, H.J.2006.The cereal cyst nematode is causing economic damage on rain-fed wheatproduction systemsofTurkey.Phytopathology96:S196 ；Yan,G.P.,and Smiley,R.ff.2008.First detection ofthe cereal cyst nematode Heterodera filipjeviin North America.Phytopathology98:176),在伊朗最大造成了 48% 的產(chǎn)量損失(Hajihasani, A., Tanha Maafi, Z., Nicol, J.M., and Rezaee, S.2010.Effect ofthecereal cyst nematode, Heterodera filipjevi, on wheat in microplot trials.Nematologyl2 (3): 357-363.)。目前菲利普孢囊線蟲(chóng)病主要發(fā)生在河南省，且造成了嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，目前已經(jīng)成為我國(guó)的麥類(lèi)作物生產(chǎn)中的又一嚴(yán)重威脅，嚴(yán)重制約著麥類(lèi)作物生產(chǎn)的發(fā)展，同時(shí)該線蟲(chóng)的發(fā)生分布還不十分的明確，對(duì)該線蟲(chóng)做出快速準(zhǔn)確的鑒定是當(dāng)前麥類(lèi)作物生產(chǎn)急需解決的問(wèn)題。菲利普孢囊線蟲(chóng)和禾谷孢囊線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)差異非常小，主要在于菲利普孢囊線蟲(chóng)陰門(mén)錐有下橋結(jié)構(gòu)，而禾谷孢囊線蟲(chóng)沒(méi)有該結(jié)構(gòu)，同時(shí)孢囊顏色、囊泡，雙膜孔的形狀也有細(xì)微的差異(Subbotin, S.A., ffaeyenberge, L., Molokanova, 1.A., and Moens, Μ.1999.1dentification of species from the Heterodera avenae group by morphomometricsand ribosomal DNA RFLPs.Nematology (I): 195-207),但是這些差異需要豐富的專(zhuān)業(yè)知識(shí)才能夠區(qū)分，在生產(chǎn)實(shí)際中很難應(yīng)用，同時(shí)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)較多，工作量大很難滿足目前的高通量快速檢測(cè)的要 求。今年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，PCR等快速檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛的運(yùn)用到植物線蟲(chóng)的快速檢測(cè)和鑒定中。目前運(yùn)用到孢囊線蟲(chóng)的檢測(cè)技術(shù)主要包括ITS-RFLP，PCR，realtime PCR 等。zheng等采用ITS-RFLP技術(shù)，通過(guò)HinfI內(nèi)切酶酶切ITS區(qū)域，發(fā)現(xiàn)中國(guó)的禾谷孢囊線蟲(chóng)和歐洲H.avenae (A型)和印度群體(B型)均不相同，稱(chēng)其為“C型”(Zheng, J., Subbotin S.A.,ffaeyenberge L., Moens Μ., Molecular characterizationof Chinese Heterodera glycines and H.avenae populations based on RFLPs andsequences of rDNA-1TS regions.Russian Journal of Nematology2000, 8:109-113.X彭德良等擴(kuò)增了中國(guó)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)群體的核糖體基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，用AluI和RsaI酶切ITS擴(kuò)增產(chǎn)物證明中國(guó)禾谷孢囊線蟲(chóng)ITS屬于“B型”，Hinf I酶切揭示出中國(guó)與摩洛哥禾谷孢囊線蟲(chóng)ITS之間存在明顯差異(彭德良，Subbotin S.A., M.Moens.小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)(Heterodera avenae)的核糖體基因(rDNA)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究.植物病理學(xué)報(bào)，2003, 33(4):323-329)。Subbotin等同樣采用ITS-RFLP技術(shù)通過(guò)Cfo I內(nèi)切酶能夠有效的區(qū)分菲利普孢囊線蟲(chóng)(Subbotin, S.A., Sturhan, D., Rumpenhopst, H.J., andMoens, Μ.2003.Molecular and morphological characterisation of the Heteroderaavenae complex species(Tylenchida:Heteroderidae).Nematology5(5):515-538.X Yan等運(yùn)用rDNA-1TS區(qū)域RFLP結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的方法對(duì)美國(guó)部分地區(qū)的禾谷孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行了檢測(cè)，該方法通過(guò)6種限制性?xún)?nèi)切酶能夠有效的區(qū)分禾谷孢囊線蟲(chóng)和菲利普孢囊線蟲(chóng)(Yan, G.P., and Smiley,R.ff.2010.Distinguishing Heterodera filipjevi and H.avenaeusing polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism andcyst morphology.PhytopathologylOO (3): 216-224.)。Fu 等對(duì)我國(guó)黃淮海麥區(qū)的禾谷抱囊線蟲(chóng)進(jìn)行了 ITS 和 RFLP 分析(Fu Bo, Ian T.Riley, Li Honglian, et al.Molecularcharacterisation of cereal cyst nematodes in winter wheat on the Huang-Huaifloodplainof China using RFLP and rDNA-1TS sequence analyses.Australasian PlantPathol2011, 40:277285)。
在孢囊線蟲(chóng)模式線蟲(chóng)甜菜孢囊線蟲(chóng)的檢測(cè)中，Amiri等通過(guò)對(duì)H.betae、H.cicer1、H.glycines 和 H.medicaginis、H.schachti1、H.trifolii 的 ITS 序列進(jìn)行分析，篩選出特異性引物SHF6，將此引物與AB28 (或rDNA2)引物結(jié)合，構(gòu)建了甜菜孢囊線蟲(chóng)一步雙重 PCR 的檢測(cè)方法(Amiri S., Subbotin S.A., Moens Μ., An efficient method foridentification ofthe Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR withspecific primers.Nemato1.medit.2001, 29:241-246)。Subbotin S A, Peng D L, Moens M.運(yùn)用雙重PCR檢測(cè)大豆孢囊線蟲(chóng)的方法,在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)運(yùn)用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyFl和rDNA2，從52個(gè)大豆孢囊線蟲(chóng)群體中均擴(kuò)增出兩個(gè)DNA片斷(18Ibp and345bp),檢測(cè)的敏感度高達(dá)單個(gè)抱囊、單頭二齡幼蟲(chóng)的微量 DNA (Subboton S.A., Peng D L, Moens M., A rapid methodfor the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines usingduplex PCR.Nematology2001，vol.3(4): 365-371)。0u, S.Q.和 Peng D.L 采用 RAPD 技術(shù)，獲得了基于大豆孢囊線蟲(chóng)基因組DNA的特異性SCAR標(biāo)記，同時(shí)和D2A和D3B相結(jié)合，發(fā)明了一步雙重PCR方法檢測(cè)大豆孢囊線蟲(chóng)。在PCR擴(kuò)增條件下，大豆孢囊線蟲(chóng)群體都獲得了 500bp 的特異性 SCAR 標(biāo)記片段和 800bp 片段(0u S.Q., Peng D.L.,Li Y.，MoensM.,Identification ofHeterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplified region(SCAR)primers.Nematology2008, 10(3):397-403)。亓?xí)岳虻炔捎肦APD的方法，研究出禾谷孢囊線蟲(chóng)特異性SCAR分子標(biāo)記，該方法能夠特異的將禾谷孢囊線蟲(chóng)與菲利普孢囊線蟲(chóng)、大麥孢囊線蟲(chóng)、旱稻孢囊線蟲(chóng)和豌豆孢囊線蟲(chóng)區(qū)分開(kāi)，檢測(cè)靈敏度高達(dá)1/80條2齡幼蟲(chóng)(亓?xí)岳颍淼铝?，彭煥，龍海波，黃文坤，賀文婦.基于SCAR標(biāo)記的小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)(Heterodera avenae)快速分子檢測(cè)技術(shù).中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,45(21):4388-4395)。同時(shí)，Ophel-Keller等開(kāi)發(fā)出蟲(chóng)土壤中直接檢測(cè)禾谷孢囊線蟲(chóng)的real time PCR檢測(cè)技術(shù),靈敏度達(dá)I個(gè)卵/lg(0phel_Keller Kathy,McKayAlan, Hartley Di, Herdina and Curran, John.Development of a routine DNA-basedtesting service for soilborne diseases in Australia.Australian Plant Pathology,2008，37:243-253)。以PCR為基礎(chǔ)的分子鑒定方法一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定上的缺陷。但PCR檢測(cè)需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)(紫外儀)等昂貴的專(zhuān)業(yè)儀器和分子生物學(xué)試劑，且需要分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)人員操作，以上檢測(cè)只能在實(shí)驗(yàn)室條件下才可以檢測(cè)，需要較長(zhǎng)的時(shí)間，限制了 PCR檢測(cè)方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，在禾谷孢囊線蟲(chóng)發(fā)生分布調(diào)查和田間快速診斷過(guò)程中，迫切需要一種簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)手段。循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification of DNA, LAMP)是2000年日本榮研株式會(huì)社Notomi等人開(kāi)發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。(NotomiT,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T, Watanabe K, Amino N and Hase T.Loop-mediatedisothermal amplification ofDNA [J].Nucleic Acids Res, 2000, 28 (12): e63.),該技術(shù)通過(guò)識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的特異性引物和利用具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下能特異、高敏、快速地?cái)U(kuò)增靶序列。該技術(shù)有如下特點(diǎn):1)特異性強(qiáng)、靈敏度高。LAMP反應(yīng)正針對(duì)靶基 因序列的6-8個(gè)特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)出4-6條引物，相比普通其他分子檢測(cè)方法具有更強(qiáng)的特異性。2)擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間短、設(shè)備要求簡(jiǎn)單。LAMP反應(yīng)具有極高的擴(kuò)增效率，30-90分鐘內(nèi)可將靶基因擴(kuò)增IO9-1Oltl,同時(shí)擴(kuò)增過(guò)程無(wú)需專(zhuān)業(yè)的PCR儀等設(shè)備，簡(jiǎn)單的水浴即可完成反應(yīng)。3)檢測(cè)結(jié)果可以肉眼直接觀察，簡(jiǎn)便快捷。由于該檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，目前已廣泛引用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測(cè)中。但在植物病原線蟲(chóng)檢測(cè)中的運(yùn)用剛剛起步，2008年日本科學(xué)家首次利用LAMP技術(shù)建立了從病木中直接檢測(cè)松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)的方法(Kikuchi T, AikawaT, OedaY, Karim N, Kanzaki N.A Rapid and Precise Diagnostic Method for Detectingthe Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated IsothermalAmplification.Nematology, 2009，12:1365-1369)。2011 年 Niu et al 等建立了南方根結(jié)線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)技術(shù)，能夠從土壤和根結(jié)中檢測(cè)出南方根結(jié)線蟲(chóng)(Niu J H, Guo Q X，JianH,Chen C L, Yang D, Liu Q, Guo Y D.Rapid detection of Meloidogyne spp.by LAMPassay in soil and roots.Crop Protection, 2011，8:1063-1069)和象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)(NiuJ H, Jian H, Guo Q X, Chen C L, Wang X Y,Liu Q, Guo Y D.Evaluation of loop-mediatedisothermal amplification(LAMP)assays based on5S rDNA_IGS2regions for detectingMeloidogyne enterolobi1.Plant Pathology, 2011，02562.x)。2012 年彭德良首次以象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)ITS為靶標(biāo)，建立了象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1/200000 條幼蟲(chóng)(專(zhuān)利號(hào):201110034960)。2012 年彭煥等(Peng H, Peng D L, Hu X Q, He XF，Wang Q, Huang W K, He ff T.Loop-mediated isothermal amplification for rapid andprecise detection of the burrowing nematode, Radopholus similis, directly fromdiseased plant tissues.Nematology, 2012, 14 (8):977-986.)研究出從摧病植物組織中用LAMP快速和特異性檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)的方法，檢測(cè)極限達(dá)1/20000條幼蟲(chóng)，靈敏度比常規(guī)PCR檢測(cè)高100倍。除此之外，LAMP檢測(cè)技術(shù)在菲利普孢囊線蟲(chóng)上尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明首次建立了菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)菲利普孢囊線蟲(chóng)的LAMP快速檢測(cè)方法，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)工作的使用，也適合在實(shí)驗(yàn)條件不足的室外檢測(cè)。一種菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于:其中LAMP反應(yīng)體系所使用的引物是:①HF11-F3:5'-GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HFl 1-B3:5' -AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ;③HFl1-BIP:5' -GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTTGGAGCCATGTTATTT TGTTGA-3' ;④HFl1-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCCGCATCTAACATTCTCAATA ATTGTC-3';⑤HFl 1-LF:5' -GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HFl1-LB:5' -TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3' ;其中的LAMP反應(yīng)體系包括:I)引物混合液: 外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2ymol/L，內(nèi)引物HF11-FIP和HFll-BIP 各 1.4 μ mol/L,環(huán)引物 HFll-LB 和 HFll-LF 為 0.4 μ mol/L ；2)反應(yīng)混合液:2.0mmol/L dNTP, 20mmol/LTris-HCl(pH8.8), 10mmol/LKCl, 5mmol/LMgS04, I Ommol/L (NH4)2S04, 0.l%Triton x-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段;
3) I μ IDNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。其中LAMP反應(yīng)條件如下:將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入I μ IDNA模板，61 65°C保溫 30 90min，85°C保溫 lOmin。LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物中加入顯色劑，輕甩離心管后觀察。所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級(jí)DMSO的混合物，其體積比為1:9。所述DNA模板的提取方法為:挑取單個(gè)菲利普孢囊放入裝有10 μ IddH2O的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min, 95°C反應(yīng)IOmin處理后12000rpm離心Imin后，上清液作為線蟲(chóng)DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)，所述LB溶液為500mmol/L KCl,10mmol/LTris-HCl, 15mmol/LMgCl2,1.0mmol/L DTT, 4.5%Tween20,等體積混勻，過(guò)濾滅菌。上述任一檢測(cè)方法在診斷植物、土壤的菲利普孢囊線蟲(chóng)感染情況或鑒別菲利普孢囊線蟲(chóng)中的應(yīng)用。本發(fā)明利用循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermalamp Ii feat ion, LAMP)建立針對(duì)菲利普孢囊線蟲(chóng)的檢測(cè)方法。本方法具有多條引物的擴(kuò)增，并在兩端形成了帶有引物功能 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種多引物結(jié)合和可自產(chǎn)生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，由于LAMP反應(yīng)操作步驟簡(jiǎn)單及反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)熒光顯色后，結(jié)果可以通過(guò)肉眼直接判定，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)工作的使用，特別適合在實(shí)驗(yàn)條件不足的室外檢測(cè)。本發(fā)明的方案具體實(shí)施步驟如下:1.線蟲(chóng)DNA提取試劑配制I) LB (Lysis Buffer)溶液:500mmol/L KCI, 10mmoI /I, Tris-HCl, 15mmol/LMgCl2, 1.0mmol/L DTT, 4.5%Tween20,121。。滅菌 15min。2)蛋白酶K:600 μ g/ml蛋白酶K，過(guò)濾滅菌。2.DNA 的提取挑取單個(gè)菲利普孢囊放入裝有10 μ I ddH20的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無(wú)菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2μ I的eooyg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲(chóng)DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。3.菲利普孢囊線蟲(chóng)PCR擴(kuò)增及序列分析采用本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的菲利普孢囊線蟲(chóng)SCAR特異性分子標(biāo)記引物0PK16-HfF2(5'-CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3')和 0PK16_HfR2(5' -AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3' )對(duì)菲利普孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ 1，PCR反應(yīng)體系為10XBuffer (含Mg2+) 5 μ 1，IOmM dNTP4y 1，引物0PK16_HfF2 和 0PK16_HfR2 (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ I, Takara)0.5 μ 1，模板DNA5y 1，滅菌ddH20補(bǔ)足至50 μ I。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min，58°C退火30sec，72°C延伸1.5min ;35個(gè)循環(huán)；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增后，取5μ I擴(kuò)增產(chǎn)物加I μ I加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相回收、克隆和測(cè)序，序列測(cè)定由北京六合華大基因科技有限公司完成。4.菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP引物設(shè)計(jì)根據(jù)菲利普孢囊線蟲(chóng)SCAR片段的測(cè)序結(jié)果為模板，采用在線軟件設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)篩選出以下6條特意性強(qiáng)，穩(wěn)定性高的引物，序列如下:①HF 11-F3:5' -GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HFl 1-B3:5' -AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ;③HFll-BIP:5'-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTT-GGAGCCATGTTATT TTGTTGA-3';④HFll-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCC-GCATCTAACATTCTCAATAA TTGTC-3';⑤HF 11-LF: 5' -GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HFl 1-LB:5' -TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3' ;5.LAMP反應(yīng)體系配置:外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2 μ mol/L,內(nèi)引物HFl 1-FIP和 HFl 1-BIP 各 1.4 μ mol/L，環(huán)引物 HFl 1-LB 和 HFl 1-LF 為 0.4 μ mol/L，2.0mmol/LdNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，I Ommol/L KCl, 5mmol/L MgSO4, lOmmol/L (NH4) 2S04, 0.1%Triton x-100和8U Bst DNA聚合酶大片段，I μ IDNA模板，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足25 μ I。6.LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件:將以上混合液置于65°C恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增75min，再85°C保溫lOmin，反應(yīng)結(jié)束 后加入I μ I配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果。7.LAMP結(jié)果檢測(cè):結(jié)果可以采用以下兩種檢測(cè)方法:I)將上述反應(yīng)完的體系中加入I μ I的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；2)取2 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；本發(fā)明所提供的菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn):一、靈敏度高。對(duì)菲利普孢囊線蟲(chóng)的檢測(cè)極限可達(dá)到1/20000個(gè)孢囊水平，比常規(guī)PCR檢測(cè)菲利普孢囊線蟲(chóng)的檢測(cè)靈敏度高100倍。二、特異性強(qiáng)。所用的特異引物根據(jù)菲利普孢囊線蟲(chóng)的特異性的SCAR片段的八個(gè)不同位置設(shè)計(jì)出6條引物，特異性比常規(guī)PCR要強(qiáng)。三、檢測(cè)時(shí)間短。1.5小時(shí)左右可獲得檢測(cè)結(jié)果，比常規(guī)PCR檢測(cè)縮短2 4h。四、對(duì)儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)等專(zhuān)業(yè)儀器設(shè)備，簡(jiǎn)單的水浴鍋或者保溫設(shè)施就可以完成檢測(cè)。五、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直接。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不涉及復(fù)雜儀器和和實(shí)驗(yàn)操作，一般技術(shù)人員即可完成檢測(cè)，結(jié)果通過(guò)肉眼即可判定。六、對(duì)人和環(huán)境友好。檢測(cè)過(guò)程不需要使用EB等有毒試劑，對(duì)人和環(huán)境非常安全。綜上所述，本發(fā)明比現(xiàn)有的檢測(cè)菲利普孢囊線蟲(chóng)方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性。可以在實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用檢測(cè)。該技術(shù)可應(yīng)用于對(duì)菲利普孢囊線蟲(chóng)田間土壤樣品及菲利普孢囊線蟲(chóng)病的發(fā)生早期快速分子檢測(cè)，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為菲利普孢囊線蟲(chóng)RAPD序列的LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖，圖2為菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP方法檢測(cè)，
A為加熒光染料檢測(cè)結(jié)果，1:陽(yáng)性結(jié)果，具有綠色熒光，2:陰性對(duì)照，為紅褐色。B檢測(cè)結(jié)果為電泳圖，M:D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)1:陽(yáng)性結(jié)果，為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增梯形條帶，2:陰性對(duì)照，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果圖A為L(zhǎng)AMP加熒光染料檢測(cè)結(jié)果圖，1-10分別為:禾谷孢囊線蟲(chóng)、菲利普孢囊線蟲(chóng)、大豆孢囊線蟲(chóng)、旱稻孢囊線蟲(chóng)、豌豆孢囊線蟲(chóng)、大麥孢囊線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、香蕉穿孔線蟲(chóng)和象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)。B為L(zhǎng)AMP檢測(cè)結(jié)果電泳圖，M:D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，1-10分別為:禾谷孢囊線蟲(chóng)、菲利普孢囊線蟲(chóng)、大豆孢囊線蟲(chóng)、旱稻孢囊線蟲(chóng)、豌豆孢囊線蟲(chóng)、大麥孢囊線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、香蕉穿孔線蟲(chóng)和象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)。圖4為菲利普孢囊線蟲(chóng)靈敏度檢測(cè)結(jié)果A為L(zhǎng)AMP加熒光染料檢測(cè)結(jié)果圖，I 7分別為:單頭線蟲(chóng)，10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6和陰性對(duì)照。B為L(zhǎng)AMP檢測(cè)結(jié)果電泳圖，M:D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，I 7分別為:單頭線蟲(chóng)，10-1、10_2、10_3、I O-4、1 O-5、10_6 和陰性對(duì)照。C為普通PCR法檢測(cè)結(jié)果電泳圖，M:D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，I 7分別為:單頭線蟲(chóng)，10-1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。所述試劑均為市售，所用菲利普孢囊線蟲(chóng)本申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室均有保存，可以免費(fèi)向公眾發(fā)放。主要試劑:Taq DNA聚合酶購(gòu)自天根公司；DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；pGEM_T EasyVector購(gòu)于美國(guó)promega Pro K(蛋白酶K)購(gòu)自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段購(gòu)自New England Biolabs公司；SYBR green I購(gòu)自 Invitrogen 公司。實(shí)施例1菲利普孢囊線蟲(chóng)DNA的提取、RAPD擴(kuò)增及序列分析1.1菲利普孢囊線蟲(chóng)DNA的提取挑取單個(gè)菲利普孢囊放入裝有10 μ I ddH20的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無(wú)菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2μ I的eooyg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲(chóng)DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。1.2菲利普孢囊線蟲(chóng)SCAR片段擴(kuò)增及序列分析應(yīng)用SCAR 標(biāo)記弓丨物 0PK16-HfF2(5'-CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3')和0PK16-HfR2 (5' -AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3' )擴(kuò)增菲利普孢囊線蟲(chóng)特異性 SCAR 片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ 1，PCR反應(yīng)體系為10XBuffer (含Mg2+) 5 μ I, IOmM dNTP4 μ 1，引物 0PK16-HfF2 和 0PK16-HfR2 (10 μ mol/L) # I μ I, Taq 酶(5υ/μ I, Takara) 0.5 μ 1，模板DNA5y 1，滅菌ddH20補(bǔ)足至50 μ I。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min，58°C退火30sec，72°C延伸1.5min ;35個(gè)循環(huán)；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增后，取5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物加I μ I加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相回收、克隆和測(cè)序，序列測(cè)定由北京六合華大基因科技有限公司完成。實(shí)施例2LAMP技術(shù)檢測(cè)菲利普孢囊線蟲(chóng)方法的建立2.1LAMP 引物設(shè)計(jì)根據(jù)菲利普孢囊線蟲(chóng)SACR特異性片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)并篩選下述LAMP引物(見(jiàn)圖1)，引物交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下:①HFl 1-F3:5' -GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HFl 1-B3:5' -AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ;③HFll-BIP:5' -GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTTGGAGCCATGTTATTT TGTTGA-3' ;④HFll-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCCGCATCTAACATTCTCAATA ATTGTC-3';
⑤HF 11-LF: 5' -GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HF 11-LB: 5' -TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3' ;2.2LAMP反應(yīng)體系配置:弓I物混合液:外引物HFl 1-F3和HFl 1-B3各0.2 μ mol/L,內(nèi)引物HFl 1-FIP和HFl IBIP 各 1.4 μ mol/L,環(huán)引物 HF11-LB 和 HFll-LF 為 0.4 μ mol/L ；反應(yīng)混合液:2.0mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl(pH8.8), lOmmol/LKCl, 5mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04, 0.l%Triton x-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ IDNA模板，加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。2.3LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件:將以上混合液置于65°C恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增75min，85°C保溫lOmin，反應(yīng)結(jié)束后加入I μ I配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果(圖2中Α)。取2 μ I產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相，可看到有LAMP的特征性梯形帶(圖2中B)。實(shí)施例3菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP特異性檢測(cè)收集禾谷孢囊線蟲(chóng)、菲利普孢囊線蟲(chóng)、大豆孢囊線蟲(chóng)、旱稻孢囊線蟲(chóng)、豌豆孢囊線蟲(chóng)、大麥孢囊線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、香蕉穿孔線蟲(chóng)、象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)(見(jiàn)表1)，分別提取其DNA作為模板與菲利普孢囊線蟲(chóng)DNA模板一起進(jìn)行LAMP檢測(cè)，以檢測(cè)菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法的特異性。表I供試的其它植物線蟲(chóng)群體樣品代碼及來(lái)源
權(quán)利要求
1.一種菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于:其中LAMP反應(yīng)體系所使用的引物是:①HF11-F3:5'-GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HF11-B3:5'-AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ; HFll-BIP:5'-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTT-GGAGCCATGTTATTTTGTTGA-3';④HFll-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCC-GCATCTAACATTCTCAATAATTGTC-3';⑤HFll-LF:5'-GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HFll-LB:5'-TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中的LAMP反應(yīng)體系包括: 1)引物混合液:外引物HFl1-F3和HFl 1-B3各0.2 μ mol/L,內(nèi)引物HFl1-FIP和HFll-BIP 各 1.4 μ mol/L,環(huán)引物 HFll-LF 和 HFll-LB 各為 0.4 μ mol/L ； 2)反應(yīng)混合液:3.2mmol/LdNTP, 20mmol/L 且 ρΗ8.8 的 Tris-HCl, 10mmol/LKCl, 3mmol/L MgS04, lOmmol/L (NH4) 2S04, 0.l%Triton x-100, 8U Bst DNA 大片段聚合酶；3)I μ I DNA 模板； 加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。`
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中LAMP反應(yīng)條件如下:將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入Iul DNA模板,61 65°C溫育30 90min,85°C保溫lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其中LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物中加入有顯色劑，輕甩離心管即可肉眼觀察。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級(jí)DMSO的混合物，其體積比為1:9。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，所述DNA模板的提取方法為:挑取單個(gè)菲利普孢囊放入裝有10 μ I ddH20的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8 μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在-80°C冷凍30min ;將離心管取出，在65°C溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后以上清液作為線蟲(chóng)DNA模板直接用于LAMP反應(yīng)，所述LB溶液為500mmol/L KCl，10mmol /T, Tris-HCl, 15mmol/L MgC12,1.0mmol/L DTT, 4.5%Tween20,等體積混勻，過(guò)濾滅菌。
7.權(quán)利要求1-6所述任一檢測(cè)方法在診斷罹病植物、土壤的菲利普孢囊線蟲(chóng)感染情況或鑒別菲利普孢囊線蟲(chóng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)方法及應(yīng)用。根據(jù)菲利普孢囊線蟲(chóng)RAPD特異性片段序列，設(shè)計(jì)篩選出6條LAMP引物HF11-F3、HF11-B3、HF11-FIP、HF11-BIP、HF11-LB和HF11-LF，通過(guò)提取菲利普孢囊線蟲(chóng)基因組DNA，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系建立及其優(yōu)化、擴(kuò)增產(chǎn)物顯色和觀察，從而快速檢測(cè)和鑒定出菲利普孢囊線蟲(chóng)。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、高效快捷，結(jié)果肉眼即可觀察，在菲利普孢囊線蟲(chóng)快速檢測(cè)和菲利普孢囊線蟲(chóng)病的早期和田間診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103285SQ20131005305
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月18日
發(fā)明者彭德良, 徐小琴, 彭煥, 黃文坤, 亓?xí)岳? 姜道宏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所