一種細胞色素p450 cyp3a4 snp的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細胞色素P450CYP3A4SNP的檢測試劑盒，該試劑盒包括探針，引物，MIX反應液，其中所述探針，序列如下：TCCTTCTCCATGTATCA（序列3），CTCCTTCTCCATGTACCA（序列4）其中所述引物，序列如下：TGGTGAGGAGGCATTTTTGC（序列5），TGCAGGAGGAAATTGATGCA（序列6）。
【專利說明】—種細胞色素P450 CYP3A4 SNP的檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因表型的測定，特別涉及一種細胞色素P450 CYP3A4 SNP的檢測試劑盒，檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002]同一種藥物對一些人非常有效，對另一些人效果卻不明顯，是因為他們基因組中存在的差異。這種差異很多表現(xiàn)為人類基因組上單個堿基上的變異，也就是單核苷酸的多態(tài)性(SNP)。單核苷酸的多態(tài)性，全稱Single Nucleotide Polymorphisms,是指在基因組上單個核苷酸的變異，形成的遺傳標記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。因此，SNP成為第三代遺傳標志，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關。
[0003]細胞色素P450(CYP450)是一組含有亞鐵血紅素的酶蛋白是肝臟中主要的藥物代謝I相酶，而CYP4503A4(CYP3A4)是其中重要的藥物代謝酶，人肝臟中它的含量約占CYP450總量的30%，臨床上約50%的藥物靠它代謝。CYP3A4基因具有多態(tài)性且其多態(tài)性存在種族差異，CYP3A4(WT)是CYP3A4亞家族最主要的基因型；CYP3A4*3( M445T )、CYP3A4*4(I118V)、CYP3A4*17 (F189S)和 CYP3A4*18 (L293P)是 WT 的基因非同義突變所得。通過體外研究基因突變導致酶氨基酸改變，從而引起酶學性質的變化，為臨床個體化用藥指導和預測有關的藥物相互作用等奠定基礎。
[0004]藥物的有效性和毒性主要取決于藥物在體內(nèi)的藥代動力學過程，包括藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝 和排泄等步驟。這些步驟若發(fā)生改變將會影響到藥物的安全性。目前，對藥物代謝的研究較為清楚。很多藥物代謝酶已經(jīng)被鑒定出來，其中最重要的一類就是細胞色素P450 (CYP)家族。
[0005]芬太尼為一種阿片受體激動劑，屬強效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，鎮(zhèn)痛作用產(chǎn)生快，但持續(xù)時間較短，用于麻醉前、中、后的鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛，也用于各種原因引起的疼痛。
[0006]2011年5月發(fā)表在Journal of Human Genetics上的文章中有報道,CYP3A4在漢族人群中分布普遍的11種單核苷酸多態(tài)性，見圖1。其中，2011年11月份由Dr.Jack以及2009年董章力等發(fā)表的文章中均指出，CYP3A4作為鎮(zhèn)痛藥芬太尼的主要代謝酶，其基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是導致芬太尼鎮(zhèn)痛效果個體差異的原因。
[0007]CYP3A4*1G (CYP3A4 SNP (rs2242480))，人群中突變率為 2.5%，P450 基因的第十個內(nèi)含子上第20230位堿基由鳥嘌呤G由腺嘌呤A取代.CC純合子相較于CT/TT雜合子，芬太尼鎮(zhèn)痛效果有所減弱。
[0008]羅哌卡因是單一對映結構體(S形)長效酰胺類局麻藥，其作用機制與其它局麻藥相同，通過抑制神經(jīng)細胞鈉離子通道，阻斷神經(jīng)興奮與傳導。對運動神經(jīng)的阻滯作用與藥物濃度有關，濃度為0.2%對感覺神經(jīng)阻滯較好，但幾乎無運動神經(jīng)阻滯作用；0.75%則產(chǎn)生較好的運動神經(jīng)阻滯作用。
[0009]無痛分娩，在醫(yī)學上叫做〃分娩鎮(zhèn)痛"。是用各種方法使分娩時的疼痛減輕甚至使之消失。目前通常使用的分娩鎮(zhèn)痛方法有兩種:一種方法是藥物性的，是應用麻醉藥或鎮(zhèn)痛藥來達到鎮(zhèn)痛效果，這種就是我們現(xiàn)在所說的無痛分娩。
[0010]羅哌卡因在用于無痛分娩時在發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果時不影響肌張力，在產(chǎn)程中不影響產(chǎn)婦行走活動，有利于降低胎心音異常發(fā)生，減少尿潴留發(fā)生等。羅哌卡因對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的影響較小，對子宮胎盤血流沒有明顯影響，不影響產(chǎn)生和新生兒呼吸，在無痛分娩過程中起著很重要的作用。
[0011]但是，羅哌卡因對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制和興奮雙相作用。血藥濃度過高時可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀。羅哌卡因對心血管系統(tǒng)具有毒性作用。血藥濃度過高時可抑制心臟傳導和心肌收縮力。
[0012]在無痛分娩中，采用羅哌卡因芬太尼聯(lián)合用藥可明顯減少產(chǎn)婦下肢運動阻滯，給藥后體征穩(wěn)定，產(chǎn)婦鎮(zhèn)痛后5分鐘、30分鐘和60分鐘VAS評分、心率、呼吸頻率、平均動脈壓分別與鎮(zhèn)痛前比均具有統(tǒng)計學差異。
[0013]CYP3A4 SNP (rs2242480)影響芬太尼的鎮(zhèn)痛效果。所以羅哌卡因、芬太尼聯(lián)合用于分娩鎮(zhèn)痛時應考慮CYP3A4 SNP (rs2242480)的基因型而決定其用藥方案和用量，以便達到最佳效果。 [0014]舒芬太尼為芬太尼的衍生物，藥用其枸櫞酸鹽，主要作用于μ阿片受體。舒芬太尼與芬太尼一致，作用于同一類受體亞型。
[0015]對亞洲人的基因組型的調(diào)查顯示，北京漢族人中，CT基因組出現(xiàn)幾率為14.7%，TT/TC基因型在日本人中出現(xiàn)的幾率為51.2%。(附件1: rs2242480基因頻率人群分布)等位基因T攜帶者CT/TT組鎮(zhèn)痛后2、4小時舒芬太尼的中位數(shù)用量(四分位數(shù)間距)分別為80.0(45.0，112.5) yg和120.0(80,173.8) μ g，CC純合子基因型組分別為(91.3 [80.0, 125.0] μ g 和 169.0 [112.5，226.3] μ g, CT/TT 組顯著低于 CC 純合子基因型組(P0.05)。盡管在鎮(zhèn)痛后24和48小時舒芬太尼的用量CT/TT組有低于CC組的趨勢，但是兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義。得出結論:按照平均均數(shù)計算，CT/TT基因型組術后2小時以及4小時給藥劑量為CC組的87.6%和71.0%。
[0016]舒芬太尼的鎮(zhèn)痛效果在CYP3A4 SNP(rs2242480)的CC純合子和CT雜合子TT純合子上表現(xiàn)有所不同。CC所需要的舒芬太尼量稍高于CT/TT基因型。所以在羅哌卡因舒芬太尼聯(lián)合用藥用于分娩鎮(zhèn)痛之前進行CYP3A4 SNP (rs2242480)，根據(jù)結果定出羅哌卡因和舒芬太尼所需劑量，可以在無痛分娩過程中減少產(chǎn)婦的副作用，在提高麻醉效果的同時，更低的麻醉藥用量可以更有效的減少產(chǎn)婦下肢阻滯，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的影響，更好的保護新生兒和產(chǎn)婦的健康。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明提供一種技術解決方案，即根據(jù)每位孕婦的細胞色素P450 CYP3A4 SNP(rs2242480)基因表型確定分娩鎮(zhèn)痛中麻醉藥的用藥計劃和用量。
[0018]本發(fā)明根據(jù)rs2242480的多態(tài)性位點特點(rs2242480位點多態(tài)性基因組序列見附件2)，設計并合成了特異性探針和引物，檢測人基因組中rs2242480位點多態(tài)性，將人群分為正常代謝組(CC型)和緩慢代謝組(CT型和TT型)。正常代謝組常規(guī)給藥。緩慢代謝組在羅哌卡因的基礎上，同時給低劑量舒芬太尼，觀察療效，及時調(diào)整用藥劑量。[0019]為檢測人群的正常代謝組(CC型)和緩慢代謝組(CT型和TT型)本發(fā)明設計了一種檢測方法，在此基礎上設計了一種檢測試劑盒，以便更加方便的使用試劑盒中的試劑對上述人群進行檢測。
[0020]本發(fā)明的檢測方法，包括以下步驟:
1、孕婦全血基因組DNA提取，提取方法如下:
在1.5毫升離心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待檢樣品(EDTA抗凝全血)，并混勻，2000rpm離心10秒，加入200微升緩沖液B，顛倒混勻，56°C放置10分鐘，期間顛倒混勻2-3次，加入200微升無水乙醇，顛倒混勻，并加入吸附柱中，12000rpm離心30秒，倒掉非也,將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升緩沖液C，12000rpm理性30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，然后12000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于一個新的1.5毫升離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，向吸附膜中間部位懸空滴加100微升洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，收集管中即為基因組DNA。[0021]2、PCR擴增:方法如下:
從以下序列中自主設計探針和引物
aggctatgac cactagcatc aaataacata tgagaaagtg attgttacct ttcaaaaaaaaaagtcacat gtctgtaacc aagaaaataa aaagagataa aaagagcaaa ttcctgtgtc catatgtggatacagctaag gggacatcac acaccactat ggtgcctgct gcaaacatgt aattcacaac caaaaccaatgtgaaatgag tgtgagcaac aaatgcttat tgttagatgc cactgaggtt tttggaggtt ttttacttagcattattgta gtaatagaaa gcagatgaac cagagccagc acgttttaca aagatcttac gcttctgccagtagcaacca tttgctatgt ttctttcttt ttcttttcag agccttccta catagagtca gtgaaagaatcagtgattat gctttttata aaaattctcc tgggaagtgg tgaggaggca tttttgctaa ggtttcacctcctccctcct tctccatgta (序列 I)
[C/T]
catccactca ccttattggg taaaactgca tcaatttcct cctgcagttt ctgctggacatcagggtgag tggccagttc atacataatg aaggagagaa cactgctcgt ggtttcatagccagcaaaaa taaagataat tgattgggcc acgagctcca gatcggacag agctgaaagg agaggaaagacattttaggt aaatcagatc aatgtagggc atcacagttt agatgaagag aaatctaagt gaagccctcaaatccctaag ggaaaagaat agaaaagcaa ttcagaggta cactgggggt ggtttcattc tgatgtgtatcttacagaac cagaataagg caaatcattt taatccagtt ttccccaagg tcttcgagaatgtgggccat ccac (序列 2)
使用GeneCopoeia公司所提供的2*Probe AllinOne Q-PCR Mix按照合適的比例加入MIX，探針，引物以及上一步提取出來的基因組DNA，最后加入石蠟油，在熒光PCR儀上按照以下程序進行擴增:95°C 10分鐘40次循環(huán)(95°C 10秒_60°C 30秒)，
3、按照擴增曲線進行單鏈多態(tài)性分析待檢樣品的基因型，方法如下:
使用單鏈多態(tài)性分析儀器，如使用BIO-RAD iQ5儀，通過Taq-man熒光PCR檢測候檢位點待檢樣品的基因型，不同的基因型顯示的結果是不相同的，如正常代謝組(CC型)顯示的結果為:FAM標記探針擴增
緩慢代謝組(CT型和TT型)顯示的結果為:FAM標記探針和VIC標記探針同時擴增，或者VIC標記探針擴增。
[0022]根據(jù)以上所得到的待檢樣品的基因型的結果，就可以按照相對應的給藥方式有針對性的調(diào)節(jié)藥物劑量，給予合適的臨床用藥，如針對正常代謝組(CC型)給藥方式為:0.01%舒芬太尼和0.15%羅哌卡因混合液負荷劑量6ml
緩慢代謝組(CT型和TT型)給藥方式為:按照常規(guī)用量的87.6%給予舒芬太尼，(0.0087%舒芬太尼和0.15%羅哌卡因混合液負荷劑量6ml)，之后補加藥量為按照常規(guī)用量的71%給予舒芬太尼(0.007%舒芬太尼和0.15%羅哌卡因混合液)
以上檢測方法中，全血基因組DNA提取，可以使用莊盟血液基因組DNA小量提取試劑盒(Blood Genomic DNA KU)，試劑盒中內(nèi)容為:紅細胞裂解液，緩沖液A，B，C，漂洗液W2，洗脫緩沖液TE，蛋白酶K，吸附柱，收集管，說明書等，該試劑盒可以從市場上購買得到。全血基因組DNA提取屬于現(xiàn)有技術，因此可以根據(jù)現(xiàn)有技術的方法進行提取，不局限于上述提及的方法。
[0023]以上本發(fā)明的檢測方法，在臨床應用中得到了良好的評價，如進行的以下實驗: 根據(jù)評價標準選取入組孕婦，按照研究方法線路圖進行(圖3)，按照技術路線(圖4)，
取孕婦外周血2毫升(EDTA抗凝)，全血提取基因組DNA，分別采用雙向測序方法和實時熒光Teqman探針技術確定每例樣本的基因型，然后隨機分成2組，一組按照常規(guī)給藥方式，進行效果評價。另外一組( 組):分型組的CC基因型組按照臨床常規(guī)給藥方案給藥；(0.01%舒芬太尼和0.15%羅哌卡因混合液負荷劑量6ml)。分型組的CT和TT基因型組按照臨床常規(guī)給藥劑量給予羅哌卡因，按照常規(guī)用量的87.6%給予舒芬太尼，(0.0087%舒芬太尼和0.15%羅哌卡因混合液負荷劑量6ml)之后補加藥量為按照常規(guī)用量的71%給予舒芬太尼(0.007%舒芬太尼和0.15%羅哌卡因混合液)，根據(jù)臨床效果評價，這一組還可以進一步進行(B組)研究實驗:CC基因型按照常規(guī)給藥方案給藥。CT/TT基因型按照常規(guī)給藥減低羅哌卡因的用量，按照首次給藥(0.0087%舒芬太尼和0.13%羅哌卡因混合液負荷劑量6ml)，根據(jù)產(chǎn)婦的情況，持續(xù)給藥以及補加藥物為(0.007%舒芬太尼和0.1%羅哌卡因混合液)記錄孕婦術后鎮(zhèn)痛2、4、24和48小時的舒芬太尼用量、靜息狀態(tài)下的視覺模擬疼痛評分VAS (visualanalogue scales, VAS)、鎮(zhèn)靜評分、惡心、嘔吐、瘙癢等不良反應。根據(jù)以上實驗結論,可以得出初步給藥方案。實驗后重新評價，確定剔除或者繼續(xù)研究。
[0024]評價標準
【權利要求】
1.一種細胞色素P450 CYP3A4 SNP的檢測試劑盒，該試劑盒包括探針，引物，MIX反應液， 其中所述探針，序列如下:
TCCTTCTCCATGTATCA，CTCCTTCTCCATGTACCA, 其中所述引物，序列如下:
TGGTGAGGAGGCATTTTTGC, TGCAGGAGGAAATTGATGCA。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其中，試劑盒中裝有:熒光反應管，去離子三蒸水，MIX反應液； 其中熒光反應管中裝有以下探針:TCCTTCTCCATGTATCA，CTCCTTCTCCATGTACCA ;引物:TGGTGAGGAGGCATTTTTGC, TGCAGGAGGAAATTGATGCA。
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其中，探針配制成:25μΜ，引物配制成:20μΜ。
4.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒,其中,各試劑的比例如下: 每條探針0.1微升，每條引物0.8微升，去離子三蒸水，用1.5毫升小瓶盛裝，MIX用1.5毫升小瓶盛裝。
5.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其中還包括石蠟油。
6.權利要求1所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟: 1)孕婦全血基因組DNA提取，提取方法如下: 在1.5毫升離心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待檢樣品(EDTA抗凝全血)，并混勻，2000rpm離心10秒，加入200微升緩沖液B，顛倒混勻，56°C放置10分鐘，期間顛倒混勻2-3次，加入200微升無水乙醇，顛倒混勻，并加入吸附柱中，12000rpm離心30秒，倒掉非也,將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升緩沖液C，12000rpm理性30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，然后12000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于一個新的1.5毫升離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，向吸附膜中間部位懸空滴加100微升洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，收集管中即為基因組DNA, 2)PCR擴增: 使用GeneCopoeia公司所提供的2*Probe AllinOne Q-PCR Mix按照合適的比例加入MIX，探針，引物以及上一步提取出來的基因組DNA，最后加入石蠟油，在熒光PCR儀上按照以下程序進行擴增:95°C 10分鐘40次循環(huán)(95°C 10秒_60°C 30秒)， 3)按照擴增 曲線進行單鏈多態(tài)性分析待檢樣品的基因型，方法如下: 使用單鏈多態(tài)性分析儀器，如使用BIO-RAD iQ5儀，通過Taq-man熒光PCR檢測候檢位點待檢樣品的基因型，不同的基因型顯示的結果是不相同的，正常代謝組(CC型)顯示的結果為:FAM標記探針擴增 緩慢代謝組(CT型和TT型)顯示的結果為:FAM標記探針和VIC標記探針同時擴增，或者VIC標記探針擴增。
【文檔編號】C12Q1/68GK103834721SQ201310054334
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年2月20日 優(yōu)先權日:2013年2月20日
【發(fā)明者】池里群, 張曉靜, 鄂文, 邵宏, 劉叔平, 盧新 申請人:鄂文