OPN關(guān)聯(lián)蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表達的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明主要涉及一種OPN關(guān)聯(lián)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法,該方法包括:重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構(gòu)建、重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的構(gòu)建和pro-MMP-9蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定。本發(fā)明通過建立原核生物基因表達系統(tǒng),可以大量表達pro-MMP-9,并建立高純度蛋白純化流程,獲得量多、純度高且制備方法簡單可行的pro-MMP-9蛋白。
【專利說明】OPN關(guān)聯(lián)蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表達
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于基因克隆表達【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種OPN下游關(guān)聯(lián)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶9酶原基因的克隆及表達的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤。在我國,胰腺癌發(fā)病率呈逐步上升趨勢,是導(dǎo)致人口死亡的十大惡性腫瘤之一,未經(jīng)治療者一年生存率大約20%,5年生存率不到4%。侵襲(invasion)和轉(zhuǎn)移(metastasis)是目前胰腺癌患者治療失敗的主要原因。骨橋蛋白(osteopontin,0PN)是一種具有多種功能分泌型|丐結(jié)合磷酸化糖蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn),OPN在胰腺癌腫瘤細(xì)胞中呈高表達,并與胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此,對其作用機制及信號通路的研究也顯得極為重要。
[0003]基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (matrix metal1proteinases 9, MMP-9)是金屬蛋白酶家族的重要成員之一,具有多種生物學(xué)功能:降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì),激活生長因子,促進細(xì)胞遷移。多種文獻報道⑴⑵,基質(zhì)金屬蛋白酶-9在腫瘤細(xì)胞中高表達,與腫瘤遷移密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶-9通常以酶原形式存在,從胞內(nèi)分泌到胞外,當(dāng)酶原激活后方具有生物學(xué)功能。而最近研究顯示(3),在胰腺癌中,OPN可能通過激活MMP-9而促進胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,基質(zhì)金屬蛋白酶 _9 酶原(pro-matrix metal1proteinases 9,pro-MMP-9)的研究顯得非常關(guān)鍵。
[0004]基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原作為分泌型蛋白,在細(xì)胞外作用,含量極少,從生物體中直接純化得率低,操作繁瑣,成本也高,不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0005]參考文獻:
1.HemaRangaswamij Anuradha Bulbulej and Gopal C.Kundu.NuclearFactor-1nducing Kinase Plays a Crucial Role in Osteopontin-1nduced MAPK/1κ B aKinase-dependent Nuclear Factor κ B-mediated Promatrix Metalloproteinase-9Activation.(2004) J.Biol.Chem.279:38921 - 35
2.Durlik M, Gardian K Metalloproteinase 2 and 9 activity in thedevelopment of pancreatic cancer.(2012) Pol Przegl Chir.84:377-82.3.Collins AL, Rock J, Malhotra L, Frankel WLj Bloomston M.0steopontinexpression is associated with improved survival in patients with pancreaticadenocarcinoma.(2012) Ann Surg Oncol.19:2673-8.
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明提供一種克隆、表達并分離純化OPN關(guān)聯(lián)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原(pro-MMP-9)蛋白質(zhì)的方法,該方法包含:重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構(gòu)建、重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的構(gòu)建和pro-MMP-9蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定。
[0007]進一步地,所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法中,重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構(gòu)建具體分為以下步驟:
1).pro-MMP-9的引物設(shè)計:
以pET28a (+) -pro-MMP-9為模板,通過拼接PCR擴增pro-MMP-9,設(shè)計出4條引物pro-MMP-9pl>pro-MMP-9p2>pro-MMP-9pl-G_3,、pro-MMP-9p2-G_5,,
上游引物pro-MMP-9p I含有內(nèi)切酶位點Nde I,下游引物pro-MMP_9p2含有內(nèi)切酶位點Hind III,
pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’
pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’
pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’
pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’ ;
2).拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段
以pET28a (+) -pro-MMP-9為模板,通過拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段,先擴增NdeI與pro-MMP-9基因第66堿基中間的片段和pro-MMP-9基因第54-285位堿基序列,上述PCR產(chǎn)物用凝膠電泳,切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段,再拼接PCR擴增Nde I_mE7序列;
3).TA克隆連接與轉(zhuǎn)化
取pMD18-T載體,加入 延伸過A的pro-MMP-9片段,再加入連接緩沖液,連接;
將上述TA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化,即得TA陽性克隆。
[0008]進一步地,所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法中,重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的構(gòu)建具體分為以下步驟:
0.酶切與回收目標(biāo)片段:pro-MMP-9基因序列中有I酶切位點,用I/HindIII雙酶切TA- pro-MMP-9及pET_28a(+)質(zhì)粒,然后回收目標(biāo)片段;
2).T4 DNA連接酶連接及轉(zhuǎn)化:在連接體系中連接過夜,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài),培養(yǎng)過夜即得陽性克隆。
[0009]進一步地,所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法中,pro-MMP-9蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定具體分為以下步驟:
0.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌:將上述鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-pro-MMP-9轉(zhuǎn)入感受態(tài)Rosetta,涂布于LB — Kan+平板上,培養(yǎng)過夜;
2).1PTG誘導(dǎo)蛋白表達:挑單克隆于LB - Kan+中,培養(yǎng)過夜,然后接過夜菌于LB —Kan+中,繼續(xù)培養(yǎng),然后加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達。
[0010]進一步地,所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法中,所述的方法中還包括pro-MMP-9蛋白的純化和鑒定:
0.細(xì)菌蛋白表達形式的分析:_80°C凍存菌體:加入細(xì)菌裂解液,超聲破菌后離心,包涵體沉淀在底部,分別取上清、包涵體做SDS-PAGE,結(jié)果顯示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵體中;
2).pro-MMP-9蛋白的純化:超聲破菌后,離心棄上清,沉淀超聲洗滌,將溶解有包涵體的溶液離心,取上清上樣至預(yù)先平衡好的鎳柱,分別用溶液洗滌10個柱床體積,再用洗脫緩沖液洗脫,收集蛋白液,充分透析,離心取上清液,收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析;3).pro-MMP-9蛋白的鑒定:SDS_PAGE電泳結(jié)束后取下凝膠,電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上,取膜,于室溫用5%脫脂奶粉封閉,加入鼠抗人pro-MMP-9抗體,室溫孵育,用PBST洗膜,加入羊抗鼠抗體室溫孵育,再用PBST洗膜,加入底物液顯色,在暗室內(nèi)顯影、定影,即得目標(biāo)條帶。
[0011]本發(fā)明通過建立原核生物基因表達系統(tǒng),可以大量表達pro-MMP-9,并建立高純度蛋白純化流程,獲得量多、純度高且制備方法簡單可行的pro-MMP-9蛋白。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的闡述。
[0013]實施例1 Dro-MMP-9克降、表汰與蛋白鈍化
一種基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法,主要分為以下步驟:
1.重組克隆載體TA- pro-MMP-9的構(gòu)建
(1)pro-MMP-9的引物設(shè)計
以pET28a (+) -pro-MMP-9為模板,通過拼接PCR擴增pro-MMP-9,設(shè)計出4條引物pro-MMP-9 p1、pro-MMP-9p2、pro-MMP-9pl-G-3,、 pro-MMP-9p2-G-5,。
[0014]上游引物pro-MMP-9p I含有內(nèi)切酶位點Nde I,下游弓丨物pro-MMP_9p2含有內(nèi)切酶位點 Hind III,
pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3,
pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’
pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’
pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3>
(2)拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段
以pET28a (+) -pro-MMP-9為模板,通過拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段,先擴增NdeI 與 pro-MMP-9 基因第 66 堿基中間的片段(108bp,稱為 Nde 1-PR0-MMP_966)和 pro-MMP-9基因第54-285位堿基序列(稱為pro-MMP-954_285)。PCR反應(yīng)體系(Pyrobest酶):41.25 μ L無菌水,5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), I μ L IOmM dNTPs, I μ L mE7pl/mE7pl-G_3’,I μ LmE7p2-G-5’/mE7p2,0.5μ L pET28a (+)-Ε7,0.25 μ L Pyrobest 酶,混勻后立即進行擴增。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min ;然后進行以下33個循環(huán):94°C 45s, 55°C lmin,72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。
[0015]上述PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠90V恒壓電泳20min,切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段,再拼接PCR擴增1-mE7序列。PCR反應(yīng)體系(Pyrobest酶):39.75 μ L無菌水,5uL IOXbuffer(含MgCl2), I μ L IOmM dNTPs, I μ L pro-MMP_9pl,I μ L pro-MMP-9p2,I μ L Nde 1-pro-MMP-966, 1 μ L pro-MMP-954_285 , 0.25 μ L Pyrobest 酶,混勻后立即進行擴增。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min ;然后進行以下33個循環(huán):94°C 45s, 55°C lmin,72°C45s ;最后在72°C延伸3min。
[0016] 瓊脂糖凝膠電泳、膠回收DNA片段,為便于用Taq酶延伸加A,膠回收的洗脫緩沖液使用含MgCl2的Taq酶緩沖液。用25 μ L膠回收洗脫緩沖液洗脫PCR擴增的DNA片段。取13.7μ L 的膠回收洗脫液,加入 1.2μ L IOmM dOTl^P0.lyL Taq 酶,72°C 延伸 6min,PCR 產(chǎn)物延伸A。[0017](3) TA克隆連接
取I μ L pMD18-T載體,加入2 μ L延伸過A的pro-MMP-9片段,再加入5 μ L的連接緩沖液,2 μ L無菌水補足至1(^1^體系,于161:連接2hr。
[0018](4) TA克隆轉(zhuǎn)化
將上述TA連接產(chǎn)物1(^1^轉(zhuǎn)移到0冊(1感受態(tài)細(xì)胞中;冰上靜置30min ;42°C熱激90s ;冰上再靜置 5min ;加入 800 μ L LB, 37°C搖床 120rpm 搖 Ihr ;4000rpm 離心 3min ;在超凈臺中移去大部分上清,輕懸沉淀,涂布于含50 μ g/mL氨節(jié)青霉素(Amp)的LB平板中;LB平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
[0019](5) TA克隆的鑒定
隨機挑取4個TA陽性克隆,接入4mL LB (Amp+)中;37°C搖床220rpm搖過夜;抽提質(zhì)粒TA-pro-MMP-9,保存于_80°C,并進行雙酶切和PCR鑒定。選取雙酶切和PCR都為陽性的TA克隆質(zhì)粒測序。
[0020]2.重組表達質(zhì)粒 pET_28a(+)-pro-MMP-9 的構(gòu)建 (O酶切與回收
pro-MMP-9基因序列中有&oR I酶切位點(pro-MMP-9上游引物中引入),用&oR I/Hind III雙酶切TA- pro-MMP-9及pET_28a(+)質(zhì)粒,用1%瓊脂糖凝膠電泳,膠回收目標(biāo)片段。 [0021 ] (2 ) T4 DNA連接酶連接及轉(zhuǎn)化
連接體系為:1μ L IOX連接酶緩沖液,I μ L雙酶切pET-28a(+)質(zhì)粒,7 μ L pro-MMP-9片段,ΙμL Τ4 DNA連接酶,16°C連接過夜。
[0022]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài),轉(zhuǎn)化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上,37 °C倒置培養(yǎng)過夜。
[0023](3)陽性克隆鑒定
隨機挑取4個陽性克隆,接入4mL的LB (Kan+)中;37°C搖床220rpm搖過夜;抽提質(zhì)粒進行雙酶切(&oR l/Η?η? III)和PCR鑒定。
[0024]3.pro-MMP-9蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定
(I)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
將上述鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET-28a (+) -pro-MMP-9轉(zhuǎn)入感受態(tài)Rosetta,涂布于LB平板(Kan+)上,37 °C倒置培養(yǎng)過夜。
[0025](2) IPTG誘導(dǎo)蛋白表達
挑單克隆于LB (Kan+)中,37°C搖床,220rpm培養(yǎng)過夜,以1:50接過夜菌于20 mL LB(Kan+)中,繼續(xù)培養(yǎng)3hr左右,OD6tltol達到0.6-0.8時加入IPTG至ImM誘導(dǎo)蛋白表達,分別于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。
[0026](3) SDS-PAGE 鑒定
取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體,加入100 μ L的I X上樣緩沖液,煮沸5min,冷卻后12000rpm離心Imin,取10 μ L樣品進行12% SDS-PAGE,電泳條件為18mA, 1.5hr。取下凝膠在考馬斯亮藍(lán)染液中搖動染色lhr,移入洗脫液中搖動洗脫過夜。觀察誘導(dǎo)前后蛋白條帶的變化,結(jié)果顯示誘導(dǎo)4hr后蛋白表達到達高峰。
[0027]4.pro-MMP-9蛋白的純化和鑒定(I)pro-MMP-9蛋白的誘導(dǎo)表達
將過夜培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pET-28a (+)-pro-MMP-9的Rosseta菌液以1:50接于IL LB (Kan+)中,37°C搖床,220rpm培養(yǎng)2hr左右,OD6tltlnm達到0.6-0.8時,加入IPTG至ImM,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr,4°C,7000rpm離心6min,收集菌體,_80°C保存。
[0028](2)細(xì)菌蛋白表達形式的分析
-80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細(xì)菌裂解液(0.5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巰基乙醇,ImM PMSF,pH7.9),超聲破菌,4°C, 8000rpm離心20min,包涵體沉淀在底部,分別取上清、包涵體做SDS-PAGE,結(jié)果顯示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵體中。
[0029](3 ) pro-MMP-9 蛋白的純化
超聲破菌后,4°C,8000rpm離心20min,棄上清,沉淀用50mL溶液(0.5M NaCl, 20mMTris, 0.5% Triton, ρΗ7.9)超聲洗漆一次;4°C, 8000rpm離心20min,棄上清。沉淀即包涵體加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris,6M 鹽酸胍,ρΗ7.9),置 37°C溶解 2hr 以上。4°C,16000rpm離心20min,取上清上樣至預(yù)先用0.5M NaCl, 20mM Tris,6M鹽酸胍,pH7.9的溶液平衡好的鎳柱,分別用溶液①、②、③(①0.5M NaCl, 20mM Tris,5mM巰基乙醇,5mM咪唑,6M 鹽酸胍,ρΗ7.9;② 0.5Μ NaCl, 20mM Tris,5mM 巰基乙醇,5mM 咪唑,8M 尿素,ρΗ7.9 ;③
0.5Μ NaCl, 20mM Tris,5mM巰基乙醇,20mM咪唑,8M尿素,pH7.9)洗滌10個柱床體積,再用洗脫緩沖液(0.5 M NaCl, 20mM Tris, 5mM巰基乙醇,200mM咪唑,8M尿素,pH7.9)洗脫,收集蛋白液,置4°C對1父?85充分透析,41:,16000印111離心201^11,取上清液。收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析,結(jié)果顯示純化的蛋白分子量約為20kDa。
[0030](4) pro-MMP-9 蛋白的鑒定
Western blot鑒定:SDS_PAGE電泳結(jié)束后取下凝膠,電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上(4°C,100V,lhr),取膜,于室溫用5%脫脂奶粉封閉2hr,加入鼠抗人pro-MMP-9抗體,室溫孵育2hr,用PBST洗膜3次,每次lOmin,加入羊抗鼠抗體室溫孵育1.5hr,再用PBST洗膜3次,每次IOmin,加入底物液顯色,在暗室內(nèi)顯影、定影,結(jié)果顯示約40kDa處出現(xiàn)了 pro-MMP-9的目標(biāo)條帶。
[0031]應(yīng)當(dāng)說明的是,以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用于限制本發(fā)明的范圍,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作出的任何修改、等同的替換和改進等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種OPN關(guān)聯(lián)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法,其特征在于,該方法包含:重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構(gòu)建、重組表達質(zhì)粒pET-28a(+) -pro-MMP-9的構(gòu)建和pro_MMP-9蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法,其特征在于,重組克隆載體TA-pro-MMP-9的構(gòu)建具體分為以下步驟: 1).pro-MMP-9的引物設(shè)計: 以pET28a (+) -pro-MMP-9為模板,通過拼接PCR擴增pro-MMP-9,設(shè)計出4條引物pro-MMP-9pl>pro-MMP-9p2>pro-MMP-9pl-G_3,、pro-MMP-9p2-G_5,, 上游引物pro-MMP-9p I含有內(nèi)切酶位點Nde I,下游引物pro-MMP_9p2含有內(nèi)切酶位點Hind III,
pro-MMP-9pl:5’ -CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’
pro-MMP-9pl-G-3>:5’ -GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’
pro-MMP-9p2-G-5>:5’ -AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’
pro-MMP-9p2:5’ -CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’ ; 2).拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段 以pET28a (+) -pro-MMP-9為模板,通過拼接PCR擴增pro-MMP-9基因片段,先擴增NdeI與pro-MMP-9基因第66堿基中間的片段和pro-MMP-9基因第54-285位堿基序列,上述PCR產(chǎn)物用凝膠電泳,切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段,再拼接PCR擴增Nde I_mE7序列; 3).TA克隆連接與轉(zhuǎn)化 取pMD18-T載體,加入延伸過A的pro-MMP-9片段,再加入連接緩沖液,連接; 將上述TA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化,即得TA陽性克隆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法,其特征在于,重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的構(gòu)建具體分為以下步驟: 0.酶切與回收目標(biāo)片段:pro-MMP-9基因序列中有R I酶切位點,用I/HindIII雙酶切TA- pro-MMP-9及pET_28a(+)質(zhì)粒,然后回收目標(biāo)片段; 2).T4 DNA連接酶連接及轉(zhuǎn)化:在連接體系中連接過夜,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài),培養(yǎng)過夜即得陽性克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法,其特征在于,pro-MMP-9蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定具體分為以下步驟: 0.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌:將上述鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-pro-MMP-9轉(zhuǎn)入感受態(tài)Rosetta,涂布于LB — Kan+平板上,培養(yǎng)過夜; 2).1PTG誘導(dǎo)蛋白表達:挑單克隆于LB - Kan+中,培養(yǎng)過夜,然后接過夜菌于LB —Kan+中,繼續(xù)培養(yǎng),然后加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶原的克隆、表達與蛋白純化方法,其特征在于,所述的方法中還包括pro-MMP-9蛋白的純化和鑒定: 1).細(xì)菌蛋白表達形式的分析:_80°C凍存菌體:加入細(xì)菌裂解液,超聲破菌后離心,包涵體沉淀在底部,分別取上清、包涵體做SDS-PAGE,結(jié)果顯示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵體中;2).pro-MMP-9蛋白的純化:超聲破菌后,離心棄上清,沉淀超聲洗滌,將溶解有包涵體的溶液離心,取上清上樣至預(yù)先平衡好的鎳柱,分別用溶液洗滌10個柱床體積,再用洗脫緩沖液洗脫,收集蛋白液,充分透析,離心取上清液,收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析; 3).pro-MMP-9蛋白的鑒定:SDS_PAGE電泳結(jié)束后取下凝膠,電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上,取膜,于室溫用5%脫脂奶粉封閉,加入鼠抗人pro-MMP-9抗體,室溫孵育,用PBST洗膜,加入羊抗鼠抗體室溫孵育,再用PBST洗膜,加入底物液顯色,在暗室內(nèi)顯影、定影,即得目標(biāo)條帶。
【文檔編號】C12N15/70GK104004738SQ201310056149
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月22日
【發(fā)明者】陳愛萍, 蔣晟, 梁靜, 顧傳虎, 姚洛芫 申請人:南京優(yōu)科制藥有限公司