專利名稱：一種含有合成的重組鴨β-防御素-2基因的重組質粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種動物生物醫(yī)藥工程領域的基因的重組質粒。
背景技術：
現(xiàn)代畜牧業(yè)飼用動物在具有高產性能的同時，對環(huán)境應激和病原愈加敏感。特別是在集約化飼養(yǎng)條件下，飼用動物面臨更多的應激和病原的侵襲。畜牧生產中迫切需要一種高效、無毒害、無殘留的免疫促進劑和生長促進劑，在提高飼用動物抗病力的同時，又能提高飼用動物的生產性能及動物產品的安全，以促進畜牧業(yè)的健康發(fā)展，降低畜牧生產對人類健康及生態(tài)環(huán)境的破壞。前人研究發(fā)現(xiàn)，防御素具有廣譜殺菌活性以及超強的抗微生物作用，且作用機理特殊，微生物不易產生抗性，對腫瘤細胞還有細胞毒性作用，同時也可以作為免疫增強劑用于調節(jié)動物機體免疫系統(tǒng)，給人們展現(xiàn)了一條開發(fā)理想促生長及免疫促進的新途徑。由于動物體天然防御素含量低，直接提取遠不能滿足需要，且成本高、得率低、工序繁；化學合成可行但成本太高 ，應用受到局限；隨著基因工程技術的發(fā)展，通過基因重組技術生產防御素多肽，以滿足研究和生產的需要成為可能。目前，防御素的基因工程已是生物醫(yī)學領域研究的熱點?；诜烙氐闹匾砉δ芗捌湓谏a實際中具有非常好的應用前景，我們進行了一種重組鴨β -防御素-2蛋白體外重組表達生產方法的發(fā)明研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產中進行應用，而且生產成本低、生產效率高的含有合成的重組鴨β -防御素-2基因的重組質粒。本發(fā)明重組鴨防御素-2基因是這樣實現(xiàn)的，依次包括鴨防御素-2(AvBD2)基因核苷酸序列設計與體外合成、重組質粒pPICZ a -A-AvBD2的構建過程、含鴨β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉化子的篩選過程、含鴨β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉化子體外誘導表達過程，
本發(fā)明的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列設計與體外合成過程是這樣實現(xiàn)
的，
參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時根據酵母密碼子偏好性對鴨AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進行改造，然后利用基因合成方法合成(送上海生工生物工程技術有限公司進行基因合成)，改造后合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列如下:
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCT
GTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTM。本發(fā)明的含有重組鴨β -防御素-2基因的重組質粒pPICZ a _A_AvBD2是這樣實現(xiàn)的，
重組質粒pPICZ a -A-AvBD2的構建過程依次是:1、鴨β-防御素-2(AvBD2)基因上游引物、下游引物的設置過程:根據合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因核苷酸序列經多重比較后設計而成，上游引物設計在該基因起始端，同時根據表達載體pPICZ a -A上的酶切位點，上游引物設計時添加了通ο I酶切位點及Kex2與Stel3蛋白酶裂解位點，在ZAo I酶切位點前加有3個保護性堿基TCT ;下游引物設計在基因末端，并加上Not I酶切位點，在Afoi I酶切位點位點前加有4個保護性堿基GCTG，所設置的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因上游引物、下游引物分別為，
鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因上游引物:
5’ -TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3> Xho I 酶切位點，
鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因下游引物:
5’ -GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3，Not I 酶切位點，
2、鴨防御素-2(AvBD2)基因片段的PCR擴增過程:以合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β-防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs 進行擴增反應，PCR 的反應體系為:10XPCR Buffer(包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris (三羥甲基氨基甲烷)*HC1，0.001% 明膠)5 μ L, 4X dNTPs (包含 dATP(三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)、dTTP (三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸)、dCTP (三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸)和dGTP (三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸)各2.5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨防御素-2 (AvBD2)上、下游引物各lyL，模板為合成的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;即獲得鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產物，鴨β -防御素_2(AvBD2)基因的PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約130bp的擴增條帶，與預期的結果一致。3、重組質粒 pPICZ a -A_AvBD2的構建:將過程2的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有IOmmoI/L Tris *HC1, lmmol/L EDTA(乙二胺四乙酸))溶解，TE 溶解物用I 進行雙酶切處理，膠回收大小約130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ a-A質粒進行雙酶切處理，膠回收大小約3.6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素_2(AvBD2)基因片段和3 μ L雙酶切后膠回收的pPICZ a-A質粒，加入IyL的10ΧΤ4 DNA連接Buffer(10XT4 DNA 連接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)，5mmol/L DATP,0.25mg/mL BSA (牛血清白蛋白))，I μ L Τ4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產物轉化Top 10感受態(tài)細胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質粒pPICZ a _A_AvBD2的構建。培養(yǎng)板上長出來的白色菌落即為含有重組質粒pPICZ a -A-AvBD2的陽性菌。pPICZ a -A質粒為Invitrogen公司的產品。不呢發(fā)明的重組鴨β -防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉化子的生產方法是這樣實現(xiàn)的，
1、重組質粒的制備和線性化:挑取轉化入重組質粒pPICZ a -A-AvBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)24 h。將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細菌。然后用質粒DNA抽提試劑盒抽提質粒。用Sac I酶將抽提的重組質粒pPICZ a _A_AvBD2線性化。2、畢赤酵母電轉化感受態(tài)細胞的制備:接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mLYPD(含lwt%酵母抽提物，2Iwt %蛋白胨，21wt %葡萄糖)培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。然后接種0.1 0.5mL過夜培養(yǎng)菌液到500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達到1.2 1.3。4°C 3 000r/m離心5min,棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/L山梨糖醇重懸菌體洗漆，4°C 3 OOOr/m離心5min,離心3次；最后將細胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細胞。3、畢赤酵母的電擊轉化:取80 μ L準備好的畢赤酵母感受態(tài)細胞，與5 10 μ g線性化的重組質粒pPICZ a -A-AvBD2混合，轉移到冰浴的0.2cm電轉杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因導入儀進行電擊轉化，電脈沖參數為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω。電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉化小杯中，將小杯內懸液轉移到一個滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育I 2小時，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IM山梨糖醇，20g瓊脂粉)平板上以篩選高拷貝轉化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉化菌落即為含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉化子。4、畢赤酵母轉化子的PCR鑒定:抽提含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉化子，以其為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs進行擴增反應，PCR 的反應體系為:10 XPCR Buffer (包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl,10mmol/L Tris.HC1，0.001wt% 明膠)5μ L，4XdNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各2.5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨AvBD2上、下游引物各I μ L，模板為抽提轉化的酵母基因組DNA I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;PCR擴增產物在1.5被％瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴增條帶，即表明所抽提的酵母為陽性酵母轉化子。本發(fā)明重組鴨β -防御素-2蛋白的生產方法是這樣實現(xiàn)的，
1、陽性酵母轉化子的誘導表達:挑取經鑒定的陽性酵母轉化子接種于3 mL YPD液體中，30。。、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY (lwt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，Iwt %甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體0D600nm達到2 6時離心棄去上清，加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(I wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0), 1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇)，連續(xù)誘導培養(yǎng)72 h，在誘導過程中，每間隔24h加入100 wt%甲醇使其終濃度為0.5%，培養(yǎng)至72h收集樣品，離心,取上清進行Tricine-SDS-PAGE電泳，結果顯示誘導培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導的對照組相比，有一條大小為4.32kD非常明顯的蛋白表達條帶。經超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜鑒定，與目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已經得到表達即重組鴨β -防御素-2基因蛋白已經生產出來。將含鴨β -防御素_2(AvBD2)的酵母重組轉化子體外誘導表達過程所生產的發(fā)酵液直接用于體外抗菌實驗表明重組鴨防御素-2 (AvBD2)蛋白具有抗大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌能力。體內治療實驗發(fā)現(xiàn)重組鴨β-防御素_2(AvBD2)蛋白有較好的體內防治大腸桿菌與沙門氏菌作用效果。本發(fā)明與已有技術相比，是對重組鴨AvBD2蛋白進行體外表達生產研究，采用了酵母密碼子優(yōu)化方法對鴨AvBD2基因核苷酸進行優(yōu)化，有利于鴨AvBD2在酵母中的誘導表達生產，能提高表達量。另外就是，酵母屬于真核表達系統(tǒng)，表達出來的重組蛋白更接近于天然蛋白，有利于重組蛋白活性的保持。從活性檢測也可以看出表達的重組蛋白呈現(xiàn)出鴨AvBD2蛋白所具有的抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產中進行應用，而且生產成本低、生產效率高。
具體實施方式
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現(xiàn)結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述:
本發(fā)明的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列設計與體外合成過程是這樣實現(xiàn)
的，
參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時根據酵母密碼子偏好性對鴨AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進行改造，然后利用基因合成方法合成(送上海生工生物工程技術有限公司進行基因合成)，改造后合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列如下:
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCT
GTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTM。本發(fā)明的含有該基因的重組質粒pPICZ a _A_AvBD2是這樣實現(xiàn)的，
重組質粒pPICZ a -A-AvBD2的構建過程依次是:
1、鴨β_防御素_2(AvBD2)基因上游引物、下游引物的設置過程:根據合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因核苷酸序列經多重比較后設計而成，上游引物設計在該基因起始端，同時根據表達載體pPICZ a -A上的酶切位點，上游引物設計時添加了通ο I酶切位點及Kex2與Stel3蛋白酶裂解位點，在ZAo I酶切位點前加有3個保護性堿基TCT ;下游引物設計在基因末端，并加上Not I酶切位點，在Afoi I酶切位點位點前加有4個保護性堿基GCTG，所設置的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因上游引物、下游引物分別為，
鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因上游引物:
5’ -TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3> Xho I 酶切位點，
鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因下游引物:
5’ -GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3，Not I 酶切位點，
2、鴨防御素-2(AvBD2)基因片段的PCR擴增過程:以合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β-防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為:10XPCR Buffer(包含0.5mmol/L MgC12, 50mmol/LKC1，lOmmol/L Tris.Η(:1，0.001% 明膠)5μ L，4XdNTPs(包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各2.5mmol/L)4y L，濃度均為20 μ mol/L的鴨β -防御素-2 (AvBD2)上、下游引物各I μ L，模板為合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因lyL，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應過程依 次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;即獲得鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因的PCR產物，鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因的PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約130bp的擴增條帶，與預期的結果一致。
3、重組質粒pPICZ a _A_AvBD2的構建:將過程2的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有IOmmoI/L Tris.HCl，lmmol/L EDTA)溶解，TE溶解物用XohUot I進行雙酶切處理，膠回收大小約130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ a -A質粒進行雙酶切處理，膠回收大小約
3.6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因片段和3yL雙酶切后膠回收的pPICZa-A質粒，加入IyL的10XT4 DNA連接Buffer (IOX T4DNA 連接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT,5mmol/L DATP,0.25mg/mL BSA), I μ L T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產物轉化Top 10感受態(tài)細胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質?？?？102(1^"02的構建。培養(yǎng)板上長出來的白色菌落即為含有重組質粒pPICZ a -A-AvBD2的陽性菌。pPICZ a -A質粒為Invitrogen公司的產品。用于生產重組鴨β -防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉化子是這樣實現(xiàn)的，
1、重組質粒的制備和線性化:挑取轉化入重組質粒pPICZ a -A-AvBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)24 h。將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細菌。然后用質粒DNA抽提試劑盒抽提質粒。用Sac I酶將抽提的重組質粒pPICZ a _A_AvBD2線性化。2、畢赤酵母電轉化感受態(tài)細胞的制備:接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mLYPD(含lwt%酵母抽提物，2Iwt %蛋白胨，21wt %葡萄糖)培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。然后接種0.1 0.5mL過夜培養(yǎng)菌液到500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達到1.2
1.3。4°C 3 000r/m離心5min,棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/L山梨糖醇重懸菌體洗漆,4°C 3 000r/m離心5min,離心3次；最后將細胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細胞。3、畢赤酵母的電擊轉化:`取80 μ L準備好的畢赤酵母感受態(tài)細胞，與5 10 μ g線性化的重組質粒pPICZ a -A-AvBD2混合，轉移到冰浴的0.2cm電轉杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因導入儀進行電擊轉化，電脈沖參數為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200Ω。電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉化小杯中，將小杯內懸液轉移到一個滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育I 2小時，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IM山梨糖醇，20g瓊脂粉)平板上以篩選高拷貝轉化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉化菌落即為含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉化子。4、畢赤酵母轉化子的PCR鑒定:抽提含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉化子，以其為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs進行擴增反應，PCR 的反應體系為:10 XPCR Buffer (包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl,10mmol/L Tris.HC1，0.001wt% 明膠)5μ L，4XdNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各2.5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨AvBD2上、下游引物各I μ L，模板為抽提轉化的酵母基因組DNA I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;PCR擴增產物在1.5被％瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴增條帶，即表明所抽提的酵母為陽性酵母轉化子。
重組鴨β -防御素-2蛋白的生產方法，
1、陽性酵母轉化子的誘導表達:挑取經鑒定的陽性酵母轉化子接種于3 mL YPD液體中，30。。、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY (lwt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，Iwt %甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體0D600nm達到2 6時離心棄去上清，加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(I wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0), 1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇)，連續(xù)誘導培養(yǎng)72 h，在誘導過程中，每間隔24h加入100 wt%甲醇使其終濃度為0.5%，培養(yǎng)至72h收集樣品，離心,取上清進行Tricine-SDS-PAGE電泳，結果顯示誘導培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導的對照組相比，有一條大小為4.32kD非常明顯的蛋白表達條帶。經超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜鑒定，與目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已經得到表達即重組鴨β -防御素-2基因蛋白已經生產出來。本發(fā)明所使用的限制性內切酶Xho 1、Not 1、Sac 1、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶等均購自廣州寶泰克生物科技有限公司。菌株X-33、Zeocin抗生素、pPICZ a-A質粒為Invitrogen公司的產品。體外抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn)重組鴨A vBD2蛋白具有抗大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌能力，對大腸桿菌44103、豬霍亂沙門氏菌(ATCC13312)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、分離株大腸桿菌和分離株豬霍亂沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為16.41,65.63,32.81,16.41,65.63和131.25 μ g/mL.以兩周齡的雛雞為對象，初步研究了重組鴨AvBD2蛋白防治雛雞細菌感染的效果。在治療實驗中，對大腸桿菌攻毒的雛雞注射250 μ g重組鴨AvBD2蛋白治療效果最好，一周后雛雞存活率達到90% ；對沙門氏菌攻毒雛雞注射300 μ g重組鴨AvBD2蛋白治療效果最好，一周后雛雞存活率達到80% ;結果表明，重組鴨β -防御素-2蛋白有較好的體內防治效果。
權利要求
1.一種含有合成的重組鴨β-防御素-2基因的重組質粒，其特征在于， 含有重組鴨β -防御素-2基因的重組質粒的構建過程依次是: (1)鴨β_防御素-2基因上游引物、下游引物的設置過程:根據合成的鴨β_防御素-2基因核苷酸序列經多重比較后設計而成，上游引物設計在該基因起始端，同時根據表達載體pPICZ a -A上的酶切位點，上游引物設計時添加了通ο I酶切位點及Kex2與Stel3蛋白酶裂解位點，在XAo I酶切位點前加有3個保護性堿基TCT ;下游引物設計在基因末端，并加上Afoi I酶切位點，在Afoi I酶切位點位點前加有4個保護性堿基GCTG，所設置的鴨β -防御素-2基因上游引物、下游引物分別為， 鴨防御素-2基因上游引物: 5’ -TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3> Xho I 酶切位點， 鴨防御素-2基因下游引物: 5’ -GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3，Not I 酶切位點， (2)鴨β-防御素-2基因片段的PCR擴增過程:以合成的鴨β-防御素-2基因為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2上/下游引物、dNTPs進行擴增反應，PCR的反應體系為:10XPCR Buffer5y L，4XdNTPs4y L，濃度均為 20ymol/L 的鴨 β -防御素 _2 上、下游引物各I μ L,模板為合成的鴨β -防御素-2基因I μ L，ddH2037.5 μ L，濃度為5 μ mol/L 的 ExTaq DNA 聚合酶 0.5 μ L，IOXPCR Buffer 包含 0.5mmol/L MgC12、50mmol/L KCl,IOmmoI/L Tris.HC1、0.001wt% 明膠，4XdNTPs 包含用量均為 2.5mmol/L 的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP,反應過程 依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應過程進行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;即獲得鴨β _防御素_2基因的PCR產物， (3)重組質粒pPICZa -A-AvBD2的構建:將過程(2)的鴨β -防御素-2基因的PCR產物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE溶解，TE包含有IOmmol/L Tris.HCl、lmmol/L EDTA，TE溶解物用ΖοΑΙ、I進行雙酶切處理，膠回收大小約130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ a-A質粒進行雙酶切處理，膠回收大小為3.6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素-2基因片段和3 μ L雙酶切后膠回收的 pPICZ a-A 質粒，加入 IyL 的 10ΧΤ4 DNA 連接 Buffer，I μ L Τ4 DNA 連接酶，在 16°C下連接處理18小時，將連接產物轉化Top 10感受態(tài)細胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質粒？？102 0^"02的構建，形成轉化入重組質粒 pPICZ a -A-AvBD2 的 Top 10 陽性菌，10 X T4 DNA 連接 Buffer 包含有 0.5mol/LTris.HC1、0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT、5mmol/L DATP。
全文摘要
一種含有合成的重組鴨β-防御素-2基因的重組質粒，其特征在于，含有重組鴨β-防御素-2基因的重組質粒的構建過程依次是(1)鴨β-防御素-2基因上游引物、下游引物的設置過程(2)鴨β-防御素-2基因片段的PCR擴增過程重組質粒pPICZα-A-AvBD2的構建。本發(fā)明與已有技術相比，具有抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產中進行應用，而且生產成本低、生產效率高的優(yōu)點。
文檔編號C12N15/81GK103205453SQ20131005686
公開日2013年7月17日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權日2011年12月6日
發(fā)明者張輝華, 韓小鳳, 馬保華, 畢英佐, 馬靜云, 謝青梅, 李辰 申請人:佛山科學技術學院