專利名稱：一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼rna基因的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)新克隆的長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因序列的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是亞洲與部分非洲地區(qū)的高發(fā)腫瘤，其病死率居我國(guó)惡性腫瘤的第二位，五年生存率只有5%左右，肝癌的防治及其發(fā)病機(jī)制研究一直是我國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的重要課題。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌的一種主要類型,盡管目前在肝細(xì)胞癌的診斷和治療方面有了新的進(jìn)展，但是對(duì)于其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制仍然存在大量未知的問題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (longnon-coding RNA, IncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)很多IncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要調(diào)節(jié)作用，它具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)作用。IncRNA根據(jù)其基因位置可分為五種類型:正義 IncRNA(sense IncRNA)、反義 IncRNA(antisense IncRNA)、雙向 IncRNA(bidirectionalIncRNA)、基因內(nèi) IncRNA(intronic IncRNA)及基因間 IncRNA(intergenic IncRNA) 之前一直被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”的IncRNA，因在基因調(diào)節(jié)中的重要功能，目前已成為繼miRNA之后非編碼RNA領(lǐng)域又一研究熱點(diǎn)。近年的研究已表明，IncRNA參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。IncRNA有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后新的標(biāo)志物，同時(shí)也為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。新一代測(cè)序(Next Generation Sequencing, NGS)技術(shù)的迅猛發(fā)展將基因組水平的研究帶入了一個(gè)新的階段，許多基于全基因組的研究成為可能，RNA測(cè)序(RNA-Sequencing, RNA-Seq)就是利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)生物樣品轉(zhuǎn)錄的全部RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，以獲得被測(cè)樣品 轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)數(shù)據(jù)的一種重要新技術(shù)。最近我們利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞癌患者活檢標(biāo)本及正常對(duì)照肝組織樣品進(jìn)行RNA-Seq，在肝癌樣品中檢測(cè)到染色體llql3.1區(qū)域存在相鄰的幾個(gè)明顯RNA-Seq信號(hào)峰，而在正常對(duì)照組織中卻沒有，且該染色體區(qū)域目前尚無已知基因登錄，提示可能存在一個(gè)或多個(gè)未知的新基因。我們以此為線索，證實(shí)這幾個(gè)RNA-Seq峰來自同一個(gè)新基因，并克隆了該基因全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)序列為3526bp，可轉(zhuǎn)錄成多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，將該基因全長(zhǎng)的序列輸入ORF finder軟件進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，未發(fā)現(xiàn)明顯的開放閱讀框，說明該基因編碼一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。我們從肝癌及正常對(duì)照組織中抽提RNA后通過逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)了該IncRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該IncRNA在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)(P〈0.001)。我們隨后又利用原位雜交的方法，進(jìn)一步在大樣本中驗(yàn)證了該IncRNA在肝癌中表達(dá)顯著上調(diào)(P〈0.001)。因此針對(duì)該IncRNA的檢測(cè)制劑可用于肝癌的輔助診斷。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)該IncRNA表達(dá)高的患者其生存時(shí)間短于該IncRNA表達(dá)低的患者(P=0.024)。因此針對(duì)該IncRNA的檢測(cè)制劑也可以用于肝癌的預(yù)后判斷。
我們還針對(duì)該IncRNA基因的序列設(shè)計(jì)了用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達(dá)載體，利用該載體在肝癌細(xì)胞系中抑制了該IncRNA的表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)抑制該IncRNA表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)。因此針對(duì)該IncRNA的抑制制劑也具有肝癌基因治療的潛在用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)新克隆肝癌相關(guān)IncRNA基因的應(yīng)用方法，根據(jù)該基因序列，設(shè)計(jì)并合成實(shí)時(shí)定量PCR引物和原位雜交探針，制備用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑。一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因的應(yīng)用方法，根據(jù)該基因制備用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑；該基因轉(zhuǎn)錄本序列為序列表中SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸序列中的任一條；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所不的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。用于肝癌輔助 診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑包括原位雜交檢測(cè)試劑和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑。根據(jù)該基因設(shè)計(jì)并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針。用于原位雜交的寡核苷酸探針序列包括:5’-CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3’5’-CTTTGGAAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3，5’-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3’ 。根據(jù)該基因設(shè)計(jì)并合成出用于實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)引物。用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的上、下游引物分別為:5，-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3，和 5，-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3，。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新克隆的肝癌相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因序列，并通過原位雜交、熒光實(shí)時(shí)定量PCR等方法證明該基因在肝癌組織中的特異性表達(dá)，為肝癌的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具。


圖1為肝細(xì)胞癌和正常對(duì)照樣品RNA-Seq結(jié)果及其在染色體上的位置圖，表明通過RNA-seq我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新基因；其中A =RNA-Seq發(fā)現(xiàn)的信號(hào)峰位于染色體llql3.1區(qū)段；B =RNA-Seq信號(hào)峰與鄰近基因的位置關(guān)系；C:肝細(xì)胞癌(HCC)和正常對(duì)照(Normal)樣品中RNA-Seq結(jié)果的對(duì)比，及克隆擴(kuò)增該新基因全長(zhǎng)序列所用引物設(shè)計(jì)示意圖；圖2為RT-PCR證實(shí)染色體llql3.1區(qū)段的RNA-Seq峰轉(zhuǎn)錄自同一個(gè)基因且剪接成多個(gè)轉(zhuǎn)錄本；A:以肝癌組織cDNA為模板用引物IF和2R及IF和3R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；B:引物IF和2R及IF和3R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)TA_clone、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)的不同轉(zhuǎn)錄本剪接方式；C:引物3F和4R及4F和5R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果；D:引物3F和4R及4F和5R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)TA-clone、測(cè)序發(fā)現(xiàn)的不同轉(zhuǎn)錄本剪接方式；
圖3為GeneRacer克隆新基因5’和3’全長(zhǎng)序列；A =GeneRacer實(shí)驗(yàn)策略草圖；B:3’ GeneRacer PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；C:5’和3’ GeneRacer測(cè)序結(jié)果得到的該基因5’端和3’端不同的剪接形式；圖4為新克隆的基因及12種不同轉(zhuǎn)錄本，開放閱讀框預(yù)測(cè)結(jié)果顯示為長(zhǎng)鏈非編碼RNA ；A:通過測(cè)序獲得的新克隆基因12種代表性轉(zhuǎn)錄本剪接形式；B:0RF Finder預(yù)測(cè)該新基因，未發(fā)現(xiàn)明顯的開放閱讀框，表明該基因編碼長(zhǎng)鏈非編碼RNA ；圖5為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)該IncRNA在10例正常肝組織和36例肝癌組織中表達(dá)的結(jié)果；其中:N代表正常組織，T代表肝癌組織；圖6為原位雜交檢測(cè)新克隆IncRNA在正常肝組織(左)及肝癌組織中的表達(dá)(右)；表明該IncRNA在正常肝組織中不表達(dá)，而在肝癌組織中高表達(dá)；圖7為新克隆的IncRNA生存曲線分析結(jié)果；根據(jù)新克隆IncRNA的表達(dá)水平將51例肝癌患者分組，IncRNA高表達(dá)患者組(28例患者，細(xì)虛線)生存時(shí)間短于I n c RNA低表達(dá)患者(2 3例患者，粗實(shí)線)，表明新克隆的IncRNA可用于肝癌患者預(yù)后判斷；圖8為針對(duì)該新克隆的IncRNA設(shè)計(jì)`并構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，干擾肝癌細(xì)胞系HepG2中該IncRNA的表達(dá)；表明設(shè)計(jì)的4個(gè)shRNA載體均可干擾H印G2細(xì)胞內(nèi)該IncRNA的表達(dá)，四個(gè)shRNA載體混合轉(zhuǎn)染細(xì)胞，效果更佳；圖9為shRNAs干擾肝癌細(xì)胞H印G2中新克隆IncRNA的表達(dá)后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，表明干擾細(xì)胞內(nèi)新克隆IncRNA的表達(dá)可以抑制!fepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。一、新的IncRNA基因克隆與分析1.材料與方法:1.1試劑及試劑盒瓊脂糖(agrose)等常用生化試劑、膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司，lkbladder DNA 分子量 Marker 購(gòu)自 Invitrogen 公司 j[^RNeasy Mini Kit (Qiagen)抽提試劑盒抽提高質(zhì)量的RNA, SuperScript III (Invitrogen)試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。1.2新一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行RNA測(cè)序人肝癌組織樣品和正常肝組織樣品提取總RNA后，過柱純化，保留200nt以上的RNA ；然后富集mRNA，并用二價(jià)陽(yáng)離子高溫加熱的方法將mRNA片斷化；以mRNA短片段為模板；用六堿基隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，經(jīng)純化、末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭的步驟，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增完成測(cè)序文庫(kù)的制備；構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)cBot擴(kuò)增，用i I lumina soIexa進(jìn)行測(cè)序；
對(duì)illumina solexa進(jìn)行RNA測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行分析:包括去除低質(zhì)量、污染、接頭的序列，將RNA測(cè)序結(jié)果與人類基因組參考序列進(jìn)行比對(duì)和映射，在肝癌樣品中檢測(cè)到染色體llql3.1區(qū)域存在相鄰的幾個(gè)明顯RNA-Seq信號(hào)峰，而在正常對(duì)照組織中卻沒有，且該染色體區(qū)域目前尚無已知基因登錄，提示可能存在一個(gè)或多個(gè)未知的新基因。1.3克隆新基因序列為了驗(yàn)證在11號(hào)染色體所檢測(cè)到的各個(gè)RNA-Seq峰是否來自同一個(gè)RNA序列，我們針對(duì)各個(gè)RNA-Seq峰分別設(shè)計(jì)了正向(Forward, F)引物和反向(Revise, R)引物,利用相鄰峰對(duì)應(yīng)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增.各引物所在的大致位置和方向見圖1C，對(duì)應(yīng)的序列如下: IF: 5 ’ -CCCTTGTTTAGCCTCTGCTG-3’，2F: 5 ’ -CCTCTGTCACTGCCACAAAA-3，，2R: 5 ’ -CATGTGGTGAGTGGCTGTG-3’，3F: 5 ’ -TCACTTACCCCTGCGACTCT-3，，3R: 5 ’ -CATCACAGGGTGTGTTTTGC-3’，4F: 5 ’ -GCCCTGCTCTATCAGCAAAC-3，，4R: 5 ’ -GCCTGCTGAGTTTGCTGATA-3’，5R: 5 ’ -CCCAAACCAAGCTGACAAAT-3，。依次對(duì)應(yīng)序列表中SEQ ID NO: 13-20。利用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)擴(kuò)增未知RNA的5’端及3’端全長(zhǎng)序列,針對(duì)本項(xiàng)目RNA序列用于GeneRacer反應(yīng)的基因特異性引物(Gene Specific Primer, GSP)大致位置和方向見圖1C，序列如下:Racer Rl:5’ -GCAGAGGCTAAACAAGGGGGTCCTG-3，，序列表中 SEQ ID NO:21 ；Racer F5:5’ -CACTGAATGCCCCACGTCAAAGAAA-3，；序列表中 SEQ ID NO:22 ；RT-PCR 或者 GeneRacer PCR 的產(chǎn)物均用 TA clone 試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆用Sanger法測(cè)序，以獲得插入片段的序列。1.4序列分析及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)所用軟件 新一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行RNA-Seq發(fā)現(xiàn)的新基因，我們用傳統(tǒng)的Sanger法測(cè)序進(jìn)行了驗(yàn)證，并用Sanger法測(cè)序克隆了該基因的全長(zhǎng)序列，Sanger法測(cè)序所獲得的序列用DNAStar軟件(DNASTAR Inc.)進(jìn)行組裝和校對(duì)；新克隆基因潛在開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)米用美國(guó)國(guó)立生物信息研究所(National Center forBiotechnology Information,NCBI)開發(fā)的在線分析軟件ORF Finder (www.ncb1.nlm.nih.gov/gorgorf.html)進(jìn)行預(yù)測(cè)；潛在開放閱讀框編碼的多肽序列輸入Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)數(shù)據(jù)庫(kù)與已知蛋白結(jié)構(gòu)域是否有同源性。2 結(jié)果2.1RNA-Seq在染色體llql3.1區(qū)域發(fā)現(xiàn)多個(gè)相鄰的RNA信號(hào)峰
通過新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞癌活檢組織及正常對(duì)照樣品中的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序(RNA-Seq)，并以人類基因組參考序列(Build37.3，Hgl9)為模版對(duì)RNA-Seq序列進(jìn)行組裝，我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織中在染色體llql3.1區(qū)域(圖1A)距11號(hào)染色體短臂末端物理距離65.6Mb附近(圖1B)存在6個(gè)相鄰的較明顯的RNA信號(hào)峰(圖1C)，除第5個(gè)峰只有50個(gè)左右測(cè)序讀長(zhǎng)(reads)支持外,其余每個(gè)峰都有超過100個(gè)reads支持,最高達(dá)到近400個(gè)reads支持(圖1C下半部分)，而同一染色體區(qū)域正常對(duì)照樣品中則沒有或僅有痕量的reads (圖1C上半部分)，表明在所檢測(cè)的肝癌組織中這一染色體區(qū)段轉(zhuǎn)錄出了一條或多條RNA序列，且轉(zhuǎn)錄水平較高；這些RNA信號(hào)峰所在的染色體部位沒有已知基因登錄(圖1B)。
為了驗(yàn)證這幾個(gè)RNA-Seq峰到底是來自幾個(gè)獨(dú)立的RNA序列還是來自同一條RNA序列，我們針對(duì)各個(gè)RNA-Seq峰分別設(shè)計(jì)了正向和反向引物(圖1C)，然后以肝癌組織cDNA為模板，用相鄰峰對(duì)應(yīng)的引物配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2.2RT-PCR證實(shí)llql3.1區(qū)域多個(gè)RNA-Seq峰轉(zhuǎn)錄自同一個(gè)基因以肝癌組織cDNA為模版，用引物IF和2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出多條目的帶，引物IF和3R也同樣得到了多條帶(圖2A).將目的條帶分別割膠純化、TA克隆，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)引物IF和2R獲得的PCR產(chǎn)物覆蓋了第1、2和3個(gè)RNA-Seq峰，且存在至少2種轉(zhuǎn)錄后剪接形式，同樣的，引物IF和3R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物覆蓋了第廣4個(gè)RNA-Seq峰，存在至少3種轉(zhuǎn)錄后剪接形式(圖2B).
用引物3F和4R、4F和5R等組合PCR擴(kuò)增也得到了類似的結(jié)果(圖2C和圖2D)，證實(shí)染色體llql3.1區(qū)段測(cè)得的這幾個(gè)相鄰的RNA-Seq峰實(shí)際上轉(zhuǎn)錄自同一個(gè)基因，它們對(duì)應(yīng)的DNA片段為同一個(gè)基因的不同外顯子，且由PCR和測(cè)序結(jié)果可知該基因轉(zhuǎn)錄的RNA存在多種剪接方式.利用引物IF和5R我們擴(kuò)增了該基因更多種類型的轉(zhuǎn)錄本。 由于PCR擴(kuò)增得到的是DNA雙鏈，僅從測(cè)序結(jié)果我們還無法判斷該RNA的實(shí)際方向，也還沒得到該RNA5’和3’端全長(zhǎng)序列，因此我們進(jìn)一步利用GeneRacer試劑盒擴(kuò)增該RNA的5’和3’端全長(zhǎng)。2.3GeneRacer 克隆 RNA 全長(zhǎng)序列GeneRacer所用引物GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供見圖3A,首先用煙草酸性焦磷酸酶(Tobacco Acid Pyrophosphatase,TAP)去除RNA5’端帽子(cap)結(jié)構(gòu)，然后在去除帽子結(jié)構(gòu)的RNA5’端用RNA連接酶(RNA Iigase)連接一段特異性RNA接頭序列(該接頭序列由GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供圖3A中左端黑色粗線條部分)，接下來用5’端增加了另一段特異性接頭的oligo-dT為引物該接頭序列由GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供,對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA的第一條鏈,此時(shí)cDNA就在兩頭都分別加上了兩段特異性的接頭序列。針對(duì)這兩端的接頭序列，GeneRacer試劑盒(Invitrogen)分別提供了 5’和3’端的GeneRacer公共引物，再在我們感興趣的目的基因序列中設(shè)計(jì)基因特異性引物(gene specificprimer, GSP,即前述的Racer Rl和Racer F5)與公共的5’或3’ GeneRacer引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增就可以得到我們感興趣的基因5’和3’端全長(zhǎng)序列。 將肝癌組織RNA用GeneRacer試劑盒逆轉(zhuǎn)錄的cDNA(兩頭已加接頭)為模板，利用圖1C中設(shè)計(jì)的2條基因特異性GeneRacer引物Racer Rl和Racer F5與試劑盒中的GeneRacer3’公共引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖3B)，結(jié)果Racer Rl與GeneRacer3’公共引物未能擴(kuò)出目的條帶，而Racer F5與GeneRacer3’引物則擴(kuò)出了非常清楚的目的條帶,表明RacerF5靠近目的基因的3’末端，其對(duì)應(yīng)的圖1C中第6個(gè)RNA-Seq峰就是該新基因的第6號(hào)外顯子.利用GeneRacer試劑盒中提供的Hela細(xì)胞cDNA為模板，Racer F5與GeneRacer3’引物也未擴(kuò)出特異性條帶，表明該基因在Hela細(xì)胞中不表達(dá)或者表達(dá)很弱。圖3B中RacerF5與GeneRacerf’公共引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果除了有一條很強(qiáng)的目的條帶外，在該條帶上方還有兩條較弱的條帶(圖中箭頭所示)，表明該基因3’末端可能同樣存在可變剪接。將PCR產(chǎn)物TA clone，Sanger法測(cè)序，我們獲得了該新基因3’端三種不同轉(zhuǎn)錄本的序列(圖3C右邊部分).我們接下來用Racer Rl與GeneRacerf’公共引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了該新基因5’端6種不同轉(zhuǎn)錄本的序列(圖3C左邊部分).
2.4新克隆的基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本且沒有明顯的開放閱讀框我們?cè)谄渌伟┙M織樣本中進(jìn)一步大量PCR，TA克隆和測(cè)序分析，得到了該基因更多的轉(zhuǎn)錄本序列，圖4A是在肝癌組織中表達(dá)頻率比較高的12種轉(zhuǎn)錄本剪接模式。將該基因不同的轉(zhuǎn)錄本序列輸入NCBI的ORF finder軟件進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因沒有明顯的開放閱讀框(所有潛在的開放閱讀框均小于500bp)。將所有潛在ORF編碼翻譯為多肽序列與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的蛋白或者結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)，也未發(fā)現(xiàn)有同源性，表明該基因可能編碼一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。二、熒光實(shí)時(shí)定量PCR1.材料與方法:10例正常肝臟組織和36例肝癌組織抽提總RNA，2 μ g RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。新克隆IncRNA引物為5’ -GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3’(序列表中SEQID NO:23)和 5’ -ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:24)。用于對(duì)照的18S 引物為 5’ -TCTTAGCTGAGTGTCCCGCG-3’(序列表中 SEQ ID NO:25)和 5’ -ATCATGGCCTCAGTTCCGAA-3’(序列表中 SEQ ID NO:26),熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系
SYBR Premix Ex Taqrw (2χ)10μ1 PCRForwardPrimer (10pn)0.4μ1
PCR Reverse Primer (IOpm)0.4μ]
cDNA 投板2.0μ
M2O7.2μ1
Total20μ1熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)步驟1 94 0C5min2 95 °CIOsec3 58 °C30sec4 72 °C20sec5 Plate read6 82 °C30sec7 Plate read8 Go to step2for more39times9 Perform melting curve from55.0 °C to95.0 °C , read every0.2 °C , holdforlsec反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)熒光實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)CT值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(18S)標(biāo)化后,采用group t_test檢驗(yàn)計(jì)算P值。2.結(jié)果
新克隆的IncRNA在正常對(duì)照組織中不表達(dá)或者表達(dá)很低，而在肝癌組織中高表達(dá) P〈0.001 (圖 5)三、原位雜交1.材料方法I)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)利用DNA Club軟件將新克隆的IncRNA序列轉(zhuǎn)換為其互補(bǔ)序列。利用Primer3軟件(http://frod0.w1.mit.edu/cg1-bin/primer3/primer3.cgi/)的探針設(shè)計(jì)功能，以每一個(gè)基因的互補(bǔ)序列為模板，在其閱讀框架內(nèi)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，探針參數(shù)設(shè)定基本一致，GC含量為40-60%，Tm為65-70°C。根椐基因序列長(zhǎng)度，以200或300個(gè)堿基的間隔，在同一條件下設(shè)計(jì)5-6條30個(gè)堿基長(zhǎng)度的寡核苷酸探針。使用美國(guó)國(guó)立生物信息學(xué)研究中心(NCBI)的在線 BLAST 軟件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)對(duì)所設(shè)計(jì)探針進(jìn)行精確匹配，篩選出雜交參數(shù)最佳特異性的3條寡核苷酸探針。2)用于肝癌和對(duì)照正常組織原位雜交的寡核苷酸探針新克隆的IncRNA及用作對(duì)照的看家基因GAPDH對(duì)應(yīng)的寡核苷酸探針長(zhǎng)度為30個(gè)喊基，募核昔酸探針5’端為憐酸基團(tuán)，3’端為輕基，探針序列均為這些基因cDNA的互補(bǔ)序列?；蚬押塑账崽结樀脑敿?xì)序列如下。寡核苷酸探針采用化學(xué)合成方法合成。新克隆的IncRNA探針:5’-CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3’(序列表中 SEQ ID NO:27)5’-CTTTGG AAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3’(序列表中 SEQ ID NO:28)5’-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3’(序列表中 SEQ ID NO:29)看家基因GAPDH所對(duì)應(yīng)的探針:5’-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3’(序列表中 SEQ ID NO:30)5’-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’(序列表中 SEQ ID NO:31)5’-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3’(序列表中 SEQ ID NO:32)3)寡核苷酸探針標(biāo)記試劑盒和原位雜交檢測(cè)試劑Dig Oligonucleitide Tailing Kit (2nd Generation)試劑盒(Roche 公司)，抗地高辛-辣根過氧化物酶復(fù)合物檢測(cè)試劑盒(Ant1-Digoxigenin_POD,Fab fragments, Roche公司)。增強(qiáng)原位表達(dá)檢測(cè)信號(hào)的TSA信號(hào)放大系統(tǒng)(TSA Biotin System, NEL700試劑盒,PerkinElmer公司)。DAB染色試劑盒(北京中山公司)。20 X SSC,硫酸葡聚糖(Dextransulphate),去離子甲酸胺(Deionized Formamide),多聚腺苷酸(polyadenylic acid,PolyA),多聚脫氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid,Poly dA),變性剪切的娃精 DNA (denaturedand sheared salmon sperm DNA, ssDNA),酵母轉(zhuǎn)運(yùn) RNA (yeast t-RNA, tRNA), DTT,50XDenhardts’ s solution, PBS buffer,胃蛋白酶K, BSA(牛血清清蛋白)，三乙醇胺(TEA), TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，ρΗ7.5，0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNTBuffer (0.1M Tris-HCl, pH7.5,0.15M NaCL,0.05%Tween20)醋酸酐，阻斷試劑(Blockingreagent agent, Roche 公司)。4)其他主要試劑和材料無水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松節(jié)油、雙蒸水、PBS緩沖液(pH7.2
7.4，NaC1137mmol/L, KC12.7mmol/L, Na2HP044.3mmol/L, KH2PO4L 4mmol/L) ；3% 甲醇-雙氧水溶液(80%甲醇和30%雙氧水配置)；0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer, CB,pH6.0±0.1,9ml0.1M檸檬酸溶液和41ml0.1M檸檬酸鈉溶液加入450ml蒸餾水中臨時(shí)配置后再校正工作液PH值)；0.1%胰蛋白酶；蘇木素；I %鹽酸酒精(Iml濃鹽酸+99ml70%酒精配置)；組織微陣列專用封片膠(PTS Cure Mount II );專用蓋玻片(480 X 240mm2)定制于鄭州玻璃儀器廠。Leica低熔點(diǎn)(58°C)石蠟，國(guó)產(chǎn)蜂蠟，無水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛(0.01mol/L, pH7.4，DEPC雙蒸水和PBS緩沖液配制)，蘇木素，伊紅，中性封片樹膠，蓋玻片，載玻片。5)寡核苷酸探針的標(biāo)記利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit進(jìn)行寡核苷酸探針標(biāo)記，反應(yīng)體系如下。IOOpmol oligonucleotide + ddH20 = 9 μ I (control: controloligonucleutide5 μ l+ddH20 4 μ I)
Reaction buffer (vial I)4μΙ
Coc!2 (vial 2)4μ1
Dig-dUTP(vial 3)Ιμ
dATP( vial 4)ΙμΙ
Terminal transferaseΙμ 混勻，稍離心。37°C水浴反應(yīng)30min，加2ul EDTA(0.2M，ρΗ8.0)中止反應(yīng)。6)寡核苷酸探針標(biāo)記后純化為了增加標(biāo)記探針的純度，需對(duì)已標(biāo)記的探針進(jìn)行純化，具體操作如下:a)探針反應(yīng)混合物(22 μ 1)+2.5 μ 14Μ LiCL+75 μ 1100% 冷乙醇(_20°C ).
b)-7(TC 沉淀 60min，or-20°C 2h。c) 13.000Xg4°C離心 15min。d)棄上清，用50 μ I冰冷的70%(V/V)乙醇洗滌。e) 13.0OOxgfC,離心 5min。f)棄上清，真空4°C干燥。g)用無菌雙蒸水重溶探針。7)組織切片雜交前處理a) 4°C保存的組織切片置于58°C烤片30min，熔化表面石蠟。b) 二甲苯依次脫臘3X5min。c)梯級(jí)酒精洗滌，100%酒精2X2min — 95%酒精lX5min — 70%酒精I(xiàn) X 5min— 50%酒精lX5min — DEPC 水洗滌 2X3min — DEPC-PBS 洗滌 2X5min。d)滴加300 μ I胃蛋白酶Κ(10μ g/ml)于切片上，37°C消化20min。e)切片入PBS (0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗滌lmin，中止反應(yīng)。f)切片入0.2N HCL,于37°C反應(yīng)20_30min，增加組織的通透性。g)切片用4%多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定lOmin，室溫。
h)為了增加組織陽(yáng)性雜交強(qiáng)度，對(duì)切片進(jìn)行乙酰化處理。切片入0.25%乙酸酐Buffer I(0.1M 三乙醇胺)，室溫 IOmin。i)lM PBS 洗滌 2X5min。8)組織預(yù)雜交和雜交a)預(yù)雜交:_20°C保存的預(yù)雜交液，先置于37°C孵育60min，預(yù)雜交液的用量為每平方厘米切片面積12.5 μ 1，相應(yīng)大小的石蠟?zāi)じ采w切片，37°C濕盒中預(yù)雜交2小時(shí)。(預(yù)雜交液成份包括:2XSSC, 10%Dextran sulphate, IX Denhardt’s solution, 50mM PhosphateBuffer(PH7.0),50mM DTT,250 μ 1,100 μ g/ml poly A,5 μ g/ml poly dA,250 μ g/ml yeastt-RNA,500 μ g/ml ssDNA,47%Deionized formamide)。b)移去石蠟?zāi)ぃΦ纛A(yù)雜交液，切片置于2X SSC中5min。c)雜交反應(yīng):37°C雜交過夜(18_20h)。每一切片加入250 μ I雜交液并用石蠟?zāi)じ采w。預(yù)雜交液中加入相應(yīng)的探針就成為雜交液。雜交液在預(yù)雜交時(shí)配制，放置37°C孵育，使探針充分溶解于雜交液中，本實(shí)驗(yàn)用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配制成探針雜交液。地高辛加尾標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針濃度計(jì)算依據(jù):每一探針的濃度按其與陽(yáng)性定量探針時(shí)檢測(cè)反應(yīng)時(shí)顯色進(jìn)行比對(duì)和100pmol30個(gè)堿基的裸探針標(biāo)記反應(yīng)理論探針產(chǎn)量為900ng兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合計(jì)算出標(biāo)記探針的濃度。d)雜交后洗滌，切片浸入2XSSC，10min，揭去石蠟?zāi)?。依次于搖床上搖動(dòng)洗滌，2X SSC(0.5%SDS)，2X15min — 0.25X SSC(0.5%SDS)，2X 15min。9)雜交后顯色檢測(cè)反應(yīng)a)采用Ant1-Digoxigenin-POD檢測(cè)地高辛探針與目的RNA結(jié)合復(fù)合物；TSA放大系統(tǒng)增強(qiáng)原位雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)，DAB顯色。b)切片轉(zhuǎn)至TNT緩沖液中，3X5min。c)滴加 TNB 阻斷緩沖液，300 μ 1/TMAs，室溫，30min。d)不洗，吸去多余阻斷劑，1:100 稀釋的 Ant1-Digoxigenin-POD (TBS+0.l%TritonX-100+1%阻斷劑)，室溫4小時(shí)。e)TNT Buffer (0.1M Tris-HCl, PH7.5，0.15M NaCL, 0.05%Tween20)洗 3X5min。f)切片上滴加信號(hào)放大試劑Biotinyl Tyamid, 300 μ 1/TMAs, (Biotinyl Tyramid忙存液:Biotinyl Tyramid 溶解于 0.2ml DMS0, Biotinyl Tyramid 工作液:I X 稀釋液，1:50稀釋Biotinyl Tyramid忙存液)，室溫10分鐘。8)丁町洗，3父511^11。h)切片滴加SA-HRP (鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶)，300 μ 1/TMAs,室溫30min。丨)丁町洗，3父511^11。j)蒸溜水洗滌，I X lmin。k)DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)。I)蘇木素復(fù)染，m)酒精梯級(jí)脫水，切片干燥。η)滴加組織切片專用封片膠，相應(yīng)規(guī)格的蓋玻片蓋片，切片膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)配備的紫外燈下交聯(lián)切片lmin。10)結(jié)果判斷及標(biāo)準(zhǔn)
應(yīng)用Nikon E600雙目光學(xué)顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進(jìn)行觀察，首先觀察目標(biāo)RNA的陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)在觀察目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的定位:位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。再分別以該檢測(cè)RNA表達(dá)部位陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度和陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分，判斷標(biāo)準(zhǔn)為:(1)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷:a.細(xì)胞無染色，記O分；b.細(xì)胞染成淺棕色為弱陽(yáng)性，記I分；c.細(xì)胞染成棕色且無背景著色，或細(xì)胞染成深棕色并有淺棕色背景為中等陽(yáng)性，記2分；d.細(xì)胞染成深棕色且無背景著色為強(qiáng)陽(yáng)性，記3分。(2)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)計(jì)分:a.無陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，記O分；b.陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)< 25%，記I分；c.25%<陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 50%，記2分；d.陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)彡50%,記3分(由于每一組織點(diǎn)直徑僅為
0.9_，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)時(shí)于IOX低倍鏡下記數(shù)每個(gè)組織點(diǎn)的全部目標(biāo)細(xì)胞)。為了盡量降低評(píng)分結(jié)果的主觀因素，由兩位病理學(xué)專家在不知道各個(gè)組織點(diǎn)性質(zhì)的情況下，分別按上述標(biāo)準(zhǔn)之一各自進(jìn)行判斷和評(píng)分，再將兩者評(píng)分相乘，結(jié)果為:①O分者最終計(jì)為O分，認(rèn)為陰性表達(dá) 級(jí)I分和2分者最終計(jì)為I分，認(rèn)為弱陽(yáng)性表達(dá)3分和4分者最終計(jì)為2分，認(rèn)為中等陽(yáng)性表達(dá)；@6分和9分者最終計(jì)為3分，認(rèn)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。11)分析和統(tǒng)計(jì)軟件應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用x 2test或Fisher exact test,相關(guān)性分析米用Spearmen correlation方法；P < 0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存曲線分析采用Kaplan-Meier method及l(fā)og-rank test ;多變量分析采用Cox’ s proportional hazards model ；P < 0.05 即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果I)新克隆的IncRNA在肝癌及正常對(duì)照組織中的表達(dá)新克隆的IncRNA在 51例肝癌中均有表達(dá)，其表達(dá)在細(xì)胞漿和胞核均有(圖6右)，而在92% (50例正常組織樣本中的46例)的正常肝組織中呈陰性表達(dá)，其余8%為弱表達(dá)(圖6左)，兩者之間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0.001)。2) Kaplan-Meier 生存分析我們對(duì)所有51例肝癌患者進(jìn)行了電話隨訪，詳細(xì)詢問了他們的首發(fā)時(shí)間、治療情況、有無復(fù)發(fā)、有無再患其他疾病、復(fù)發(fā)及死亡時(shí)間等，并登記了生存時(shí)間和狀態(tài)，并對(duì)肝癌組織中新克隆IncRNA的表達(dá)與病人的生存時(shí)間和狀態(tài)進(jìn)行的生存分析，發(fā)現(xiàn)新克隆的IncRNA高表達(dá)患者平均生存時(shí)間為16.09個(gè)月，四年(48個(gè)月)內(nèi)82.1% (23/28)的患者已經(jīng)死亡，而新克隆IncRNA低表達(dá)的患者，平均生存時(shí)間已超過24.53個(gè)月，四年(48個(gè)月)內(nèi)僅34.8% (8/23)的患者已經(jīng)死亡(圖7)。說明新克隆的IncRNA是一個(gè)與肝癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記，該IncRNA表達(dá)高，病人預(yù)后差。四、構(gòu)建shRNA載體干擾新克隆I ncRNA的表達(dá)1.材料方法I)試劑及試劑盒限制性內(nèi)切酶HindII1、BglI1、EcoR I及Cla I，T4DNA連接酶等購(gòu)自TakaRa公司；TRIZ0LTM Reagent (Invitrogen)；質(zhì)粒抽提試劑盒(#D6943_01，OMEGA)；膠回收試劑盒(#M5212，OMEGA)；
逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(#A3500,Promega)；抗生素G418 (Ameresc)。2) shRNA 的設(shè)計(jì)首先將新克隆的IncRNA序列輸入Invitrogen公司的Block-1t RNAi designer軟件，尋找該IncRNA的shRNA最佳祀點(diǎn),挑選最佳的4條相應(yīng)的祀點(diǎn)序列如下:shRNA-Ι:5’ -GGACAAGGTCCAAGCTCTTAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:33)shRNA-2:5，-GCAGTGCAGCAGTATCATTGC-3’(序列表中 SEQ ID NO:34)shRNA-3:5’ -GCAGCAGTATCATTGCTTAGC-3’(序列表中 SEQ ID NO:35)shRNA-4:5’ -GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT-3’(序列表中 SEQ ID NO:36)以廣泛使用的在人類基因組中沒有任何靶點(diǎn)的Scramble序列作為陰性對(duì)照，其序列如下:Scramble:5’ -GACACGCGACTTGTACCAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:37)針對(duì)這4條IncRNA祀點(diǎn)序列，及Scramble序列，根據(jù)OligoEngine公司pSUPER載體說明書，設(shè)計(jì)可形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈及其反向互補(bǔ)序列，它們退火后即可形成兩端分別帶限制性酶切位點(diǎn)BglII和HindIII粘性末端的DNA雙鏈。具體需合成的各條寡核苷酸序列及它們配對(duì)退回后形成的DNA雙鏈如下:shRNA-Ι:5’ -GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTACTTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCCTTTTTA-313 ' -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5’ -GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:5， -GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:5， -GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGCTTTTTA-3’3 ' -GGG CGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCT TGTTTAGAGTGTGTCTCGACGAAAAATTCGA-5， Scramble5’-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACMGTCGCGTGTC TTTTTA-3，3’-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5J依次對(duì)應(yīng)序列表中SEQ ID NO:38-47。下劃線的部分為shRNA靶向的IncRNA序列。兩條互補(bǔ)配對(duì)的DNA退火后，左邊是限制性內(nèi)切酶BglII的粘性末端，右邊是HindIII的粘性末端。3) shRNA 載體構(gòu)建
化學(xué)合成上述4個(gè)shRNA對(duì)應(yīng)的8條單鏈oligo序列,將合成好的oligo用oligoannealing buffer溶解成20 μ Μ,互補(bǔ)單鏈各取10 μ I混合。然后將oligo混合物在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段。用Bgl II和Hind III雙酶切pSUPER質(zhì)粒，回收3.1kb的載體片段，將退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的載體按照3:1的物質(zhì)量的比例混合，用T4連接酶，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化E.coil感受態(tài)，挑選轉(zhuǎn)化子，菌落PCR以及測(cè)序鑒定，再用Cla I和EcoR I酶切構(gòu)建好的PSUPER質(zhì)粒，2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳，以空白pSUPER為空白對(duì)照，判斷插入了目的片段的陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證后用于干擾細(xì)胞內(nèi)新克隆IncRNA的表達(dá)。4)細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所，細(xì)胞培養(yǎng)所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化細(xì)胞所用的胰蛋白酶均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞!fepG2按2X IO5個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，將6孔板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50-70%密度即可開始shRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過程如下:在無菌EP管中加入3 μ I的lipofectamine2000于100 μ I無血清培養(yǎng)基中混勻靜置5min ； 將構(gòu)建的shRNA表達(dá)載體加入ΙΟΟμ I無血清培養(yǎng)基中；然后與上述包含Iipofectamine的100 μ I無血清培養(yǎng)基溫和混勻，室溫靜置30分鐘，使DNA與脂質(zhì)體形成復(fù)合體；用D-Hank’ s液洗滌細(xì)胞3次；將上述混合物中加入800 μ I無血清培養(yǎng)基(無抗生素)，溫和混勻后加入6孔板中的I個(gè)孔；將6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6小時(shí)，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。5)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)shRNA干擾IncRNA表達(dá)的效果: 將各種shRNA載體轉(zhuǎn)染后的IfepG2細(xì)胞抽提總RNA，2 μ g RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。新克隆IncRNA引物為5’ -GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3’(序列表中SEQID NO:23)和 5’ -ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:24)用于對(duì)照的18S 引物為 5’ -TCTTAGCTGAGTGTCCCGCG-3’(序列表中 SEQ ID NO:25)和 5’ -ATCATGGCCTCAGTTCCGAA-3’(序列表中 SEQ ID NO:26),熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因的應(yīng)用方法，其特征在于，根據(jù)該基因制備用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑；該基因轉(zhuǎn)錄本序列為序列表中SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸序列中的任一條；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑包括原位雜交檢測(cè)試劑和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，根據(jù)該基因設(shè)計(jì)并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，用于原位雜交的寡核苷酸探針序列包括:5’ -CATTGTTTTAATGCTTCCAGATGAGTTTGTATC-3’.5’-CTTTGGAAATAGTGCAGACACAAAACTAGGG-3，.5’-GTGTGTTTTGCAGTCTCCTTGTTTGTTTCTTC-3’ 。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，根據(jù)該基因設(shè)計(jì)并合成出用于實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法，其特征在于，用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的上、下游引物分別為:.5，-GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3'和 5，-ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)新克隆的長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因的應(yīng)用方法，根據(jù)該基因序列，設(shè)計(jì)并合成實(shí)時(shí)定量PCR引物和原位雜交探針，制備用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑。利用該制劑，在肝癌臨床病例標(biāo)本中檢測(cè)該長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝癌中表達(dá)顯著上調(diào)，且該長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)高的肝癌患者預(yù)后較差。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103160580SQ20131005986
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者熊煒, 李桂源, 曾朝陽(yáng), 李小玲, 張文玲, 范松青, 石磊, 李夏雨, 向波, 肖凱, 向娟娟, 彭淑平, 周艷宏, 肖嵐, 李征, 曹利 申請(qǐng)人:中南大學(xué)