一種利用its序列鑒定當(dāng)歸及其混偽品的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種利用ITS序列鑒定當(dāng)歸及其混偽品的方法。包括以下步驟：1）中藥當(dāng)歸及其混偽品總DNA的提??；2）以步驟1）中提取的DNA為模板，使用SEQ?ID?NO.1和2所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3）PCR產(chǎn)物直接測(cè)序；4）序列拼接、對(duì)比，建立NJ樹(shù)，鑒別中藥當(dāng)歸及其混偽品。本發(fā)明首次運(yùn)用ITS序列鑒別中藥當(dāng)歸及其混偽品，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果顯著、實(shí)用性強(qiáng)，可以快速、準(zhǔn)確的鑒別開(kāi)中當(dāng)歸及其混偽品，適于廣泛推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種利用ITS序列鑒定當(dāng)歸及其混偽品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥材來(lái)源品種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種利用ITS序列鑒定當(dāng)歸及其混偽品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)歸，2010版藥典記載為傘形科植物當(dāng)歸(Angelica sinensis (Oliv.) Diels.)的干燥根，具有補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤(rùn)腸通便。用于血虛萎黃，眩暈心悸，月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，虛寒腹痛，風(fēng)濕痹痛，跌撲損傷，癰疽瘡瘍，腸燥便秘的功效?，F(xiàn)代藥理也研究表明，當(dāng)歸在促進(jìn)造血與抗貧血、抑制血小板聚集、抗血栓、抗凝血、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、提高免疫因子活性、神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)，以及對(duì)心腦血管系統(tǒng)的保護(hù)都能起到重要的作用。
[0003]當(dāng)歸為常用中藥材，在臨床方面有廣泛的用途。當(dāng)歸屬物種分布廣泛，種類(lèi)繁多，但由于臨床需求量大，經(jīng)常出現(xiàn)供不應(yīng)求的狀況。市場(chǎng)上關(guān)于當(dāng)歸的混偽品主要有重齒毛當(dāng)歸、土當(dāng)歸、藁本、紫花前胡等，其形態(tài)類(lèi)似，參雜在正品當(dāng)歸中很難鑒別。條形碼技術(shù)是一種分子鑒定技術(shù)，它利用一段特定的DNA片段，即可實(shí)現(xiàn)物種間的鑒別。本發(fā)明以ITS序列為條形碼，運(yùn)用生物信息學(xué)的方法準(zhǔn)確鑒別中藥當(dāng)歸及其混偽品，為條形碼技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種利用ITS序列鑒別中藥當(dāng)歸及其混偽品的分子鑒定方法。
[0005]具體步驟如下:1)中藥當(dāng)歸及其混偽品總DNA的提??；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用ITS4R和ITS5F引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3) PCR產(chǎn)物直接測(cè)序；4)序列拼接、對(duì)比，建立NeighborJoining Tree (NJ樹(shù)),鑒別中藥當(dāng)歸及其混偽品。
[0006]其中，PCR反應(yīng)體系以25 μ I計(jì)為:
[0007]ddH20:8.5 μ I
[0008]2XTaq PCR Mix: 12.5μ I
[0009]ITS4R/5F 引物:1/1 μ I
[0010]DNA 模板:2μ1
[0011]pCR 反應(yīng)條件為:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；
[0012]建立NJ樹(shù)后，可以看到當(dāng)歸與其混偽品分在不同的支上，通過(guò)觀察NJ樹(shù)，可以很明顯的把中藥當(dāng)歸與其混偽品鑒別開(kāi)。
[0013]本發(fā)明首次運(yùn)用ITS序列鑒別中藥當(dāng)歸及其混偽品，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果顯著、實(shí)用性強(qiáng)，可以快速、準(zhǔn)確的鑒別開(kāi)中當(dāng)歸及其混偽品，適于廣泛推廣應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明提取樣品DNA、ITS序列-PCR擴(kuò)增、測(cè)序，對(duì)序列進(jìn)行拼接、比對(duì)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)基于K2P模型對(duì)中藥當(dāng)歸及其混偽品的ITS序列建立Neighbor-Joining Tree (NJ樹(shù))。通過(guò)對(duì)NJ樹(shù)的分析，可以很好的鑒別開(kāi)中藥當(dāng)歸及其混偽品。【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為使用ITS 4R/5F引物PCR擴(kuò)增當(dāng)歸及其混偽品的電泳檢測(cè)圖。其中，DG1-DG15為當(dāng)歸，D1-D6為獨(dú)活，XJ1-XJ2為新疆藁本，ZH為紫花前胡，TDG1-TDG4為土當(dāng)歸，LGB1-LGB6 為遼藁本，XG1-XG8 為西歸；QG1_QG16 為秦歸，QH1-QH7 為羌活，M 為 DNA Marker,CK為空白陰性對(duì)照；
[0016]圖2為基于K2P距離法建立中藥當(dāng)歸及其混偽品Neighbor Joining Tree (NJ樹(shù))；樣品編號(hào)同圖1。
[0017]圖3為市售中藥當(dāng)歸10樣品的ITS 4R/5F引物PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖；
[0018]圖4為基于K2P距離法建立市售當(dāng)歸樣品Neighbor Joining Tree (NJ樹(shù));樣品編號(hào)同圖3。
[0019]圖5為基于K2P距離法建立當(dāng)歸及其偽品GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)ITS序列的NeighborJoining Tree (NJ樹(shù)),命名方式為樣品編號(hào)+種拉丁名+ITS序列GenBank登錄號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0021]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。 [0022]實(shí)施例1當(dāng)歸及其混偽品GenBank數(shù)據(jù)分析
[0023]從GenBank上下載當(dāng)歸及其混偽品ITS序列數(shù)據(jù),運(yùn)用生物信息學(xué)軟件CodonCodeAligner和MEGA5進(jìn)行對(duì)比分析,建立Neighbor Joining Tree (NJ樹(shù))，結(jié)果如圖5所示，ITS序列可以很好的把當(dāng)歸及其混偽品分開(kāi)；
[0024]實(shí)施例2運(yùn)用ITS序列鑒別當(dāng)歸及其混偽品
[0025]1、樣品來(lái)源
[0026]采用的當(dāng)歸及其混偽品包括當(dāng)歸、秦歸、獨(dú)活、遼藁本、新疆藁本、土當(dāng)歸、紫花前胡等，分別收集自甘肅、四川、云南、陜西、湖南、北京等地。紫花前胡(Peucedanumdecursiva(Miq.)Franch.&Sav.)> 土當(dāng) 歸(Levisticum officinale ff.D.J.Koch)>遼藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitag.)、新疆藁本(Conioselinumvaginatum(Spreng.) Thell.)、重齒毛當(dāng)歸(Angelica pubescens Maxim, f.biserrata Shanet Yuan)。
[0027]2、DNA 提取
[0028]將上述樣品，每個(gè)樣品取約30mg，加入滅菌小鋼珠，用磨樣機(jī)磨成粉末，利用試劑盒法提取DNA。試劑盒購(gòu)自TianGen公司，型號(hào)為植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)200preps。
[0029]3、PCR 擴(kuò)增
[0030]引物:ITS4R:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，；
[0031]ITS 5F:5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，；
[0032]PCR反應(yīng)體系以25 μ I計(jì)為:
[0033]ddH20:8.5 μ I[0034]2XTaq PCR Mix: 12.5μ I
[0035]ITS4R/5F 引物:1/1 μ I
[0036]DNA 模板:2 μ I
[0037]PCR 反應(yīng)條件為:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；
[0038]4、測(cè)序
[0039]運(yùn)用ABI3730測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。
[0040]5、序列拼接、比對(duì)、處理
[0041]運(yùn)用生物信息學(xué)軟件CodonCode Aligener進(jìn)行序列拼接,MEGA 5進(jìn)行序列比對(duì)、建立NJ樹(shù)；
[0042]結(jié)果如圖所示，圖1為當(dāng)歸及其混偽品ITS序列PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖，顯示DNA擴(kuò)增成功，可以測(cè)序；圖2為基于K2P距離法建立的當(dāng)歸及其混偽品ITS序列NeighborJoining Tree (NJ樹(shù))，由圖可明顯看出當(dāng)歸與其混偽品都分在不同的支上,可以明顯的鑒別開(kāi)。
[0043]實(shí)施例3運(yùn)用 ITS序列鑒別市售當(dāng)歸樣品
[0044]1、樣品來(lái)源
[0045]采用的10份當(dāng)歸樣品搜集自從市場(chǎng)上銷(xiāo)售的中藥當(dāng)歸。
[0046]2、DNA 提取
[0047]將上述樣品，每個(gè)樣品取約30mg，加入滅菌小鋼珠，用磨樣機(jī)磨成粉末，利用試劑盒法提取DNA。試劑盒購(gòu)自TianGen公司，型號(hào)為植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)200prepso
[0048]3、PCR 擴(kuò)增
[0049]PCR反應(yīng)體系以25 μ I計(jì)為:
[0050]ddH20:8.5 μ I
[0051]2XTaq PCR Mix: 12.5μ I
[0052]ITS4R/5F 引物: 1/1 μ I
[0053]DNA 模板:2 μ I
[0054]PCR 反應(yīng)條件為:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；
[0055]4、測(cè)序
[0056]運(yùn)用ABI3730測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。
[0057]5、序列拼接、比對(duì)、處理
[0058]運(yùn)用生物信息學(xué)軟件CodonCode Aligener進(jìn)行序列拼接，MEGA5進(jìn)行序列比對(duì)、建立NJ樹(shù)；
[0059]結(jié)果如圖所示，圖3為市售當(dāng)歸樣品ITS序列PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖，顯示DNA擴(kuò)增成功，可以測(cè)序；圖4為基于K2P距離法建立的市售當(dāng)歸樣品ITS序列Neighbor JoiningTree (NJ樹(shù))，由圖可看出，樣品1、5、8單聚在一支，與其他樣品分開(kāi)，經(jīng)鑒定樣品1、5、8為重齒毛當(dāng)歸、土當(dāng)歸、藁本，其余樣品為正品中藥當(dāng)歸。由此可證明基于ITS序列可以準(zhǔn)確的鑒別出中藥當(dāng)歸及其混偽品。[0060]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以 對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定當(dāng)歸及其混偽品的方法，包括以下步驟: 1)提取中藥當(dāng)歸及其混偽品的總DNA；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用SEQID N0.1和2所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序； 4)序列拼接、對(duì)比，建立NJ樹(shù)，鑒別中藥當(dāng)歸及其混偽品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系以25μ I計(jì)為: ddH20: 8.5 μ I 2XTaq PCR Mix:12.5μ I ITS4R/5F 引物:1/1 μ I DNA 模板:2 μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為:94°C5min；94°C lmin>50°C lmin>72°C 1.5min+3s/cycle, 30cycles ；72°C 7min。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述方法在鑒定當(dāng)歸及其混偽品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004818SQ201310060181
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月26日
【發(fā)明者】黃林芳, 鄭司浩, 林余霖, 陳士林 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所