專利名稱：一種小鼠毛囊干細(xì)胞體外向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種小鼠毛囊干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法，特別是涉及一種將小鼠毛囊干細(xì)胞采用體外培養(yǎng)方式，經(jīng)過形成擬胚體(EB)進(jìn)行誘導(dǎo)，然后以小鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層采用共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)形成原始生殖細(xì)胞的方法。屬于生殖醫(yī)學(xué)的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:從2003年開始，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組報(bào)導(dǎo)了他們將哺乳類干細(xì)胞，包括人類干細(xì)胞，誘導(dǎo)為各發(fā)育階段的生殖細(xì)胞。在以雄性配子為目標(biāo)的報(bào)導(dǎo)中，2003年Toyooka等首先以Vasa基因?yàn)镻GC報(bào)告系統(tǒng)(reporter system)及BMP4為誘導(dǎo)因子，將小鼠干細(xì)胞誘導(dǎo)為PGCs(原始生殖細(xì)胞primordial germ cells);并接著將分離出來的PGCs與睪丸細(xì)胞混合后移植到睪丸中產(chǎn)生精子。2004年，Geijsen等利用SSEAl為早期生殖細(xì)胞表面標(biāo)記，加上RA(retinoic acids)誘導(dǎo)小鼠干細(xì)胞,成功在體外獲得單倍體,並將其注射入小鼠卵子中，受精卵發(fā)育至囊胚期。德國研究小組Nayernia等同樣利用RA誘導(dǎo)小鼠干細(xì)胞，并以StraS及Prml為報(bào)告系統(tǒng)，獲得的類精細(xì)胞在注射入卵子后能獲得后代。此外，Nayernia等人也用小鼠骨髓干細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)分化出了原始生殖細(xì)胞以及精原細(xì)胞樣的細(xì)胞。2009年，我國研究小組Yu等報(bào)導(dǎo)成功將小鼠干細(xì)胞誘導(dǎo)為精子。這項(xiàng)研究值得關(guān)注的是首次將高表達(dá)DAZL基因做為誘導(dǎo)配子的方案。2011年日本Hayashi等利用小鼠胚胎干細(xì)胞，加上BMP4等誘導(dǎo)因子，分離出PGCs。在移植到睪丸后，獲得成熟精子，并獲得下一代小鼠。綜合最近研究進(jìn)展，大都采用胚胎干細(xì)胞(ESC)作為原材料，但是ESC處在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)育的早期，而且取材困難，因此采用成體干細(xì)胞代替ESC向生殖細(xì)胞分化可以更好地解決問題。毛囊干細(xì)胞是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的多能成體干細(xì)胞
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種小鼠毛囊干細(xì)胞體外向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法。本發(fā)明方法分離出生后7天小鼠觸須部毛囊，體外培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞，將傳代兩次的毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)形成擬胚體(EB);然后以小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)為飼養(yǎng)層，采用共培養(yǎng)的方式分化發(fā)育形成原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞，并具有與體內(nèi)正常發(fā)育的原始生殖細(xì)胞相類似的形態(tài)和特異基因表達(dá)特征。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明方法按照如下步驟操作:第一步，利用機(jī)械法分離小鼠觸須部毛囊:用手術(shù)鑷子將出生后7天小鼠毛囊從觸須部皮膚上取下，轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0) +10%胎牛血清(FCS)的操作液中，在操作液中清洗，并去除與毛囊連接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪等雜質(zhì)，在新鮮DMEM/F-12 (細(xì)胞培養(yǎng)液Dulbecco’sModified Eagle Medium, F-12 Nutrient Mixture)中將毛囊清洗；第二步，體外培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞:毛囊經(jīng)DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04% EDTA, 37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化， 于DMEM/F-12中清洗，過400目細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)入毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，每4天傳代一次；第三步，毛囊干細(xì)胞體外形成EB:當(dāng)毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)到第二代又3-4天時(shí)(即培養(yǎng)的11-12天)，離心收集細(xì)胞，棄上清，加入
0.25%Trypsin室溫消化5分鐘，然后輕輕吹打至單細(xì)胞，終止消化，Medium 199洗兩遍后轉(zhuǎn)入24孔板懸浮培養(yǎng)，置于EB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第四步，小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)培養(yǎng)及飼養(yǎng)層細(xì)胞的制作:將懷孕13.5天的母鼠殺死取出胎鼠，取出頭、四肢、內(nèi)臟、尾將軀干轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液清洗，置于0.25% Trypsin-0.04% EDTA，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后，力口入10%胎牛血清(FCS)終止，轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，細(xì)胞達(dá)90%匯合度時(shí)傳代；取1-3代成纖維細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，加入含有10 μ g絲裂霉素C的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中1.5-2小時(shí)，取出用磷酸鹽緩沖液清洗，用0.25% Trypsin將貼壁的成纖維細(xì)胞消化下來，終止后DMEM高糖清洗，轉(zhuǎn)入24孔板貼壁培養(yǎng)；第五步，EB培養(yǎng)后與飼養(yǎng)層共培養(yǎng)向原始 生殖細(xì)胞(PGC)分化:用0.25% Trypsir^WtEB,室溫消化過程中用槍吹打至單細(xì)胞，用血清終止消化，收集細(xì)胞，離心；棄上清，加入PGC培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋到細(xì)胞濃度為5 X IO4個(gè)/ml PGCs培養(yǎng)液里；向鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的24孔中加入0.5ml重懸的細(xì)胞，將培養(yǎng)板置于37°C、飽和濕度、5%C02中培養(yǎng)；培養(yǎng)液包括:DMEM 高糖，10% 胎牛血清(FCS)，0.23mM 丙酮酸鈉，0.1mM NEAA (Non-Essential AminoAcids,非必需氨基酸，Hyclone公司)，2mM L-谷氨酰胺,0.1mM β -巰基乙醇，20ng/ml表皮生長因子(EGF)，40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，40ng/ml干細(xì)胞生長因子(SCF)0本發(fā)明方法第二步所述毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)液包含DMEM/F12，2% B-27，20ng/ml表皮生長因子(EGF)，40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，1%青鏈霉素。本發(fā)明方法第三步所述EB培養(yǎng)基包括Medium 199 (pH 7.0)，3mg/ml牛血清蛋白(BSA)，lmg/ml胎球蛋白，5ul/ml胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉(ITS)，0.23mM丙酮酸鈉，Ing/ml表皮生長因子(EGF)，5mIU/ml促卵泡素(FSH)，3mIU/ml促黃體素(LH)。本發(fā)明方法第四步所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基包括:DMEM高糖、10%胎牛血清(FCS)，1%丙酮酸鈉，1%NEAA，1%青鏈霉素。本發(fā)明方法成功利用機(jī)械法分離出生后7天小鼠觸須部毛囊，體外培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞(HFSC)，利用HFSC體外形成EB的方法進(jìn)行分化，分化后與小鼠成纖維細(xì)胞采用共培養(yǎng)的方式進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得了與體內(nèi)正常原始生殖細(xì)胞(PGC)形態(tài)和特異分子標(biāo)記表達(dá)類似的PGC。


:圖1為出生后7天小鼠觸須部毛囊的分離顯微圖。圖2為小鼠毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)顯微圖。圖3為傳代兩次的毛囊干細(xì)胞體外誘導(dǎo)形成EB顯微圖。圖4為小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層制作。圖5為毛囊干細(xì)胞經(jīng)EB誘導(dǎo)后與MEF共培養(yǎng)向PGC分化的各時(shí)間段顯微圖。圖6為檢測(cè)毛囊干細(xì)胞分化的PGC是否表達(dá)正常PGC相關(guān)基因。圖7為毛囊干細(xì)胞分化的PGC進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色。
具體實(shí)施方式
:下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法做進(jìn)一步闡述。實(shí)施例1、1、小鼠毛囊的分離毛囊干細(xì)胞(HFSC)來源于出生后7天小鼠觸須部皮膚毛囊。用手術(shù)鑷子將出生后7天小鼠毛囊從觸須部皮膚上取下，見圖1中I，轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)+10%胎牛血清(FCS，Hyclone公司)的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手術(shù)鑷子去掉與毛囊連接在一起的皮脂腺，立毛肌，脂肪等雜質(zhì)，見圖1中2，在新鮮DMEM/F-12 (Hyclone公司)中將毛囊洗3次。2、毛囊干細(xì)胞的體 外培養(yǎng)毛囊經(jīng)DMEM/F-12 (Hyclone 公司)洗完 3 遍后，置于 0.25%Trypsin_0.04%EDTA(Hyclone公司)，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，于DMEM/F-12(Hyclone公司)中洗3遍，過400目細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)入毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)液包含 DMEM/F12(Hyc1ne 公司);2%B_27 (Gibco 公司);20ng/ml 表皮生長因子(EGF，Sigma公司)；40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF, Peprotech公司)；1%青鏈霉素(Hyclone公司)，以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，每4天傳代一次。圖2所示為小鼠毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)顯微圖。圖2中I為過細(xì)胞篩后單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)I天后有明顯細(xì)胞聚集物出現(xiàn)(圖2中2)，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，克隆球變大，邊界清晰(圖2中3)，傳代I次后克隆的邊緣非常光滑緊湊，克隆呈一個(gè)個(gè)的球狀(圖2中4-5)，傳代兩次后細(xì)胞的克隆球數(shù)進(jìn)一步增多(圖2中6)。3、毛囊干細(xì)胞體外形成擬胚體(EB)當(dāng)毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)到第二代又3-4天時(shí)(即培養(yǎng)的11-12天)，1500rpm離心5min收集細(xì)胞，棄上清，加入0.25%Trypsin (Hyclone公司)室溫消化5分鐘，然后輕輕吹打至單細(xì)胞，終止消化，Medium 199洗兩遍后轉(zhuǎn)入24孔板(SARSTEDT公司)懸浮培養(yǎng)，置于EB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，EB培養(yǎng)基包括Medium 199 (Gibco公司，pH 7.0)，3mg/ml牛血清白蛋白(BSA, Sigma公司)，lmg/ml胎球蛋白(Fetuin,Merck公司)，5ul/ml ITS (胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉Gibco公司),0.23mM丙酮酸鈉(Hyclone公司)，lng/ml表皮生長因子(EGF, Sigma公司)，5mIU/ml促卵泡素(FSH，Sigma公司)，3mIU/ml促黃體素(LH，Sigma公司)。圖3所示為傳代兩次的毛囊干細(xì)胞體外誘導(dǎo)形成EB顯微圖。圖3中I是將毛囊干細(xì)胞消化為單細(xì)胞，圖3中2是培養(yǎng)I天后形成的EB前體，經(jīng)過2-3天后EB邊緣清晰并且變得光滑，呈不規(guī)則形狀(圖3中3-4)。4、小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)培養(yǎng)及飼養(yǎng)層細(xì)胞的制作將懷孕13.5天的母鼠殺死取出胎鼠，取出頭、四肢、內(nèi)臟、尾等將軀干轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液清洗3遍，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后，加入10%胎牛血清(FCS，Gibco公司)終止，轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成纖維培養(yǎng)基包括=DMEM高糖(Hyclone公司)、10%胎牛血清(FCS，Gibco公司)，1%丙酮酸鈉(Hyclone公司)，1%NEAA (Hyclone公司)，1%青鏈霉素(Hyclone公司)；以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，細(xì)胞達(dá)90%匯合度時(shí)傳代；取1-3代成纖維細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，加入4ml含有10 μ g絲裂霉素C(索來寶公司)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中1.5-2小時(shí)，取出用磷酸鹽緩沖液洗5遍，用0.25% Trypsin (Hyclone公司)將貼壁的成纖維細(xì)胞消化下來，終止后DMEM高糖洗3遍，轉(zhuǎn)入24孔板貼壁培養(yǎng)。圖4中I為轉(zhuǎn)入24孔板12小時(shí)后的飼養(yǎng)層，細(xì)胞匯合率達(dá)到50%左右，圖4中2表示成纖維細(xì)胞為GFP陰性(為了與GFP陽性的PGC區(qū)別開來)。5、EB培養(yǎng)后與飼養(yǎng)層共培養(yǎng)向原始生殖細(xì)胞(PGC)分化用0.25%Trypsin (Hyclone公司)消化EB,室溫消化過程中用槍吹打至單細(xì)胞，用10%胎牛血清(FCS，Gibco-BRL)終止消化，收集細(xì)胞，1500rpm離心5min ;棄上清，加入少量PGC培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋到細(xì)胞濃度為5 X IO4個(gè)/ml PGCs培養(yǎng)液里；向鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的24孔中加入0.5ml重懸的細(xì)胞，將培養(yǎng)板置于37°C、飽和濕度、5%C02中培養(yǎng)，培養(yǎng)液包括:DMEM高糖(Hyclone公司)，10%胎牛血清(FCS，Gibco公司)，0.23mM 丙麗酸納(Hyclone 公司)，0.1mM NEAA (Hyclone 公司)，2mM L-谷氛酸胺，
0.1mMβ -巰基乙醇(sigma公司)，20ng/ml表皮生長因子(EGF, sigma公司),40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF,Peprotech公司)，40ng/ml干細(xì)胞生長因子(SCF, sigma公司)。圖5中I為EB消化成的單細(xì)胞與底下鋪的飼養(yǎng)層共培養(yǎng)，圖5中2為I天后很多細(xì)胞貼壁，至IJ PGC分化的第5天，出現(xiàn)折光度大，“亮晶晶”的細(xì)胞(圖5中3)，這些細(xì)胞的數(shù)目隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，數(shù)目越來越多(圖5中4-6)。6、RT-PCR檢測(cè)分化的PGC生殖細(xì)胞特異基因表達(dá)定量PCR 運(yùn)用 SYBR Premix Ex TaqTM kit (TaKaRa 公司)和 ABI 7300real-time PCR儀(Applied Biosystems),米用β-actin作為內(nèi)參基因。檢測(cè)如下基因:Dazl, Fragllis, Stella, Figa, 0ct3/4, SCP3。圖 6 顯示在 PGC 分化過程中，PGC 特異基因Dazl, Blimpl, Stella在分化第4天表達(dá)較高，C_kit在第6天表達(dá)較高，vasa在第2天表達(dá)較高。體系如下:Mix 的配制:
權(quán)利要求
1.一種小鼠毛囊干細(xì)胞體外向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法，其特征在于按照如下步驟操作:第一步，分離小鼠觸須部毛囊:用手術(shù)鑷子將出生后7天小鼠毛囊從觸須部皮膚上取下，轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液PH7.0+10%胎牛血清的操作液中清洗，并去除與毛囊連接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪，在新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/F-12中將毛囊清洗；第二步，體外培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞:毛囊經(jīng)DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.0496EDTA，37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，于DMEM/F12中清洗，過400目細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)入毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，每4天傳代一次；第三步，毛囊干細(xì)胞體外形成擬胚體EB:當(dāng)毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)到第二代又3-4天時(shí)，離心收集細(xì)胞，棄上清，加入0.25%Trypsin室溫消化5分鐘,然后輕輕吹打至單細(xì)胞,終止消化,Medium 199洗兩遍后轉(zhuǎn)入24孔板懸浮培養(yǎng)，置于EB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第四步，小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及飼養(yǎng)層細(xì)胞的制作:將懷孕13.5天的母鼠殺死取出胎鼠，取出頭、四肢、內(nèi)臟、尾將軀干轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液清洗，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA, 37°C消化10分鐘，輕輕吹打混勻后，加入10%胎牛血清終止，轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，細(xì)胞達(dá)90%匯合度時(shí)傳代；取1-3代成纖維細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，加入含有10 μ g絲裂霉素C的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中1.5-2小時(shí)，取出用磷酸鹽緩沖液清洗，用0.25%Trypsin將貼壁的成纖維細(xì)胞消化下來，終止后DMEM高糖清洗，轉(zhuǎn)入24孔板貼壁培養(yǎng)；第五步，EB培養(yǎng)后與飼養(yǎng)層共培養(yǎng)向原始生殖細(xì)胞PGC分化:用0.25% Trypsin消化EB，室溫消化過程中用槍吹打至單細(xì)胞，用血清終止消化，收集細(xì)胞，離心 ；棄上清，加入PGC培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋到細(xì)胞濃度為5 X IO4個(gè)/ml PGCs培養(yǎng)液里；向鋪有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的24孔中加入0.5ml重懸的細(xì)胞，將培養(yǎng)板置于37°C、飽和濕度、5%C02中培養(yǎng)；培養(yǎng)液包括:DMEM高糖，10%胎牛血清，0.23mM 丙酮酸鈉,0.1mM Non-Essential Amino Acids, 2mM L-谷氨酸胺,0.1mM β-疏基乙醇，20ng/ml表皮生長因子，40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，40ng/ml干細(xì)胞生長因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠毛囊干細(xì)胞體外向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法，其特征在于第二步所述毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)液包含DMEM/F12，2% B_27，20ng/ml表皮生長因子，40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，1%青鏈霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠毛囊干細(xì)胞體外向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法，其特征在于第三步所述EB培養(yǎng)基包括pH 7.0的Medium 199，3mg/ml牛血清蛋白，Img/ml胎球蛋白，5ul/ml胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉，0.23mM丙酮酸鈉，lng/ml表皮生長因子，5mIU/ml促卵泡素，3mIU/ml促黃體素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠毛囊干細(xì)胞體外向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法，其特征在于第四步所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基包括:DMEM高糖、10%胎牛血清，1%丙酮酸鈉，l%Non-Essential Amino Acids, 1% 青鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小鼠毛囊干細(xì)胞體外向原始生殖細(xì)胞分化的技術(shù)方法，按照如下步驟操作第一步，利用機(jī)械法分離出生后7天小鼠觸須部毛囊；第二步，體外培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞毛囊經(jīng)DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA，37℃消化10分鐘，輕輕吹打混勻后加入10%血清終止消化，于DMEM/F-12中清洗，過400目細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)入毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；第三步，將傳代兩次的毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)形成擬胚體EB；第四步，制作小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及飼養(yǎng)層細(xì)胞；第五步，EB培養(yǎng)后與飼養(yǎng)層共培養(yǎng)向原始生殖細(xì)胞分化。本發(fā)明方法獲得了與體內(nèi)正常原始生殖細(xì)胞形態(tài)和特異分子標(biāo)記表達(dá)類似的原始生殖細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/076GK103146644SQ20131006066
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月27日
發(fā)明者孫源超, 陳波, 陳春雷, 沈偉 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)