專利名稱：腸桿菌及其在生物絮凝中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腸桿菌制備生物絮凝劑的方法及其用途。
背景技術(shù)：
我國是水資源短缺和污染比較嚴(yán)重的國家之一。要解決水資源短缺問題，除節(jié)約用水外，加強(qiáng)對污水的處理是目前亟待解決的問題。在水處理方法中，絮凝法是最常用的方法之一。在生活污水和各種工業(yè)廢水中，常含有不同種類和數(shù)量的懸浮體和膠體，通過在水處理中加入絮凝劑，使這些溶膠和懸浮體脫穩(wěn)，進(jìn)而凝聚成大顆粒快速沉淀出來。絮凝劑的種類很多。無機(jī)絮凝劑如聚合氯化鋁、聚合氯化鐵等運(yùn)行可靠，但耗資大，有一定危害，容易在消除一種污染的同時又帶來另一種污染。以聚丙烯酰胺為代表的有機(jī)合成絮凝劑投加量少、速度快、適用范圍廣，但其在水中殘留的單體不易被降解，具有強(qiáng)烈的“三致”效應(yīng)。天然高分子絮凝劑類微生物絮凝劑的應(yīng)用在20世紀(jì)60年代已有報道，70年代已有商品絮凝劑出售，如Allyn化學(xué)公司生產(chǎn)的Claron，Moglu公司生產(chǎn)的Moul-1aracel等。微生物絮凝劑可以分為:(I)直接利用微生物細(xì)胞的絮凝劑；(2)利用微生物細(xì)胞提取物的絮凝劑；(3)利用微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)物的絮凝劑。與常見的無機(jī)及有機(jī)合成絮凝劑相比，微生物具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):(1)無毒無害，安全性高，能用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)的發(fā)酵后處理；(2)易被降解，無二次污染；3)使用范圍廣，脫色效果獨(dú)特，曾被用于水冶礦漿澄清、無機(jī)質(zhì)懸濁液·分離、石油鉆井、污水脫色、污泥脫水等方面，經(jīng)微生物絮凝劑處理后的污水，更易于固液分離，沉淀物生成量少；(4)某些微生物絮凝劑的pH值穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性能好，用量??；(5)來源廣泛，生產(chǎn)周期短，而且還能利用某些廢水作為培養(yǎng)基，達(dá)到以廢治廢的目的。美國、日本、英國等是比較早對微生物絮凝劑進(jìn)行研究的國家，相較于國外，我國起步較晚，但近來來也取得了很大的進(jìn)展。也出現(xiàn)了大量的關(guān)于微生物絮凝劑的專利，如趙曉祥和夏莉莉申請的一種用于藍(lán)藻水華的復(fù)合型微生物絮凝劑對藍(lán)藻的絮凝效果可達(dá)92% ;李強(qiáng)申請的一種放射狀突然桿菌制備生物絮凝劑的方法中，該微生物絮凝劑耐熱性好，對PH6-12范圍的污水都有處理效果；何歡等申請的一種芽孢桿菌絮凝劑的制備方法中，該微生物絮凝劑對高嶺土的絮凝效果可達(dá)90%以上。篩選高效絮凝劑產(chǎn)生菌仍是目前微生物絮凝劑中的重要研究內(nèi)容，而且目前還未見到有關(guān)腸桿菌作為絮凝微生物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種日溝維腸桿菌的新應(yīng)用，該應(yīng)用為污水的處理提供了新思路。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:日溝維腸桿菌在制備微生物絮凝劑中的應(yīng)用。所述日溝維腸桿菌菌種的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。進(jìn)一步，所述的應(yīng)用中，所述日溝維腸桿菌的生物保藏號為CCTCC M2013042。
本發(fā)明的目的之二在于提供微生物絮凝劑的制備方法及其制備的產(chǎn)品，該方法成本低,工藝穩(wěn)定；所述產(chǎn)品pH值和溫度耐受性好。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:微生物絮凝劑的制備方法，具體為:將日溝維腸桿菌菌種用適合于日溝維腸桿菌培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，并分離，所述菌體或菌液為微生物絮凝劑。進(jìn)一步，所述的微生物絮凝劑的制備方法，具體包括以下步驟:A種子液的制備按下述比例制備種子培養(yǎng)基:葡萄糖，10.0g ;K2HP04，5.0g ;MgS04.7H20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl,0.1g ;尿素，0.5g ;酵母粉，0.5g ;蒸餾水IL ;挑取固體培養(yǎng)基上的日溝維腸桿菌接種到滅菌后的所述種子培養(yǎng)基中，30±2°C通氣培養(yǎng)24±6h，得種子液；B 發(fā)酵

將步驟A所得生長穩(wěn)定期的種子液體按1-5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30±2°C通氣培養(yǎng)18±2h，離心分離，去除上清液，沉淀即為得到微生物絮凝劑，所述微生物絮凝劑的OD59tl為2.0-2.4 ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基是按如下比例配制:葡萄糖，8.0-12.0g ；Κ2ΗΡ04,
5.0g ；MgS04.7Η20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl,0.1g ;硝酸鈉，1.0-1.5g ;蒸餾水 IL0進(jìn)一步，所述的微生物絮凝劑的制備方法，步驟A中的種子培養(yǎng)基中的葡萄糖或步驟B中所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖可等重量替換為蔗糖、乳糖、甘露醇和淀粉中的任一種或多種；步驟A中的種子培養(yǎng)基中的硝酸鈉或步驟B中所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鈉可等重量替換為蛋白胨、尿素、牛肉膏和硫酸銨中的任一種或多種。進(jìn)一步，所述的制備方法，所述日溝維腸桿菌菌種的生物保藏號為CCTCCM2013042。所述的方法獲得的微生物絮凝劑。進(jìn)一步，所述微生物絮凝劑為菌體沉淀。其中，所述的微生物絮凝劑，所述日溝維腸桿菌菌種的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。本發(fā)明的目的之三在于提供污水中污泥沉淀的方法，該方法適用對象廣，效果明顯。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:運(yùn)用所述的微生物絮凝劑強(qiáng)化污水處理中污泥沉淀的方法，將所述微生物絮凝劑投放至待處理污水中，所述微生物絮凝劑與待處理污水的比例以體積計為2% -10%，處理不少于0.5分鐘。本發(fā)明的有益效果:1)在PH3-10范圍下，本微生物絮凝劑的絮凝率均能達(dá)到90%以上，具有良好的PH穩(wěn)定性；2)在20-70°C的溫度范圍內(nèi)，本微生物絮凝劑的絮凝活性無明顯差異；3)本微生物絮凝劑的絮凝時間短，效率高，且無需依賴金屬離子作為添加劑。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。圖1是日溝維腸桿菌在油鏡下的形態(tài)圖。圖2是不同活性成分的分布圖。
圖3是圖3不同碳源對日溝維腸桿菌絮凝活性的影響。圖4是不同氮源對日溝維腸桿菌絮凝活性的影響。圖5是不同pH環(huán)境下日溝維腸桿菌絮凝活性的變化。圖6不同作用溫度前處理對日溝維腸桿菌絮凝活性的影響。圖7不同靜置時間下日溝維腸桿菌絮凝活性的變化。圖8是不同用量對日溝維腸桿菌絮凝效果的影響。圖9不同金屬離子對日溝維腸桿菌絮凝效果的影響。圖10是在污水處理中的應(yīng)用效果圖片，左側(cè)試管為處理前，右側(cè)試管為處理后。本發(fā)明中，將日溝維腸桿菌eth_2 (Enterobacter gergoviae eth_2)送中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏編號為CCTCC M2013042，地址位于中國武漢武漢大學(xué)，收到日期為2013年I月23日。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。本發(fā)明中的接種量，是以體積作為比較單位，比如移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。實施例中，絮凝率測定方法具體為:在50ml量筒內(nèi)加入0.2g高嶺土(4g/L)，Iml質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為I %的CaCl2水溶液(終濃度為0.2mg/ml)，Iml所述微生物絮凝劑(OD59tl值為2.0-2.4)，然后加水至50ml，上下顛倒搖勻20次，靜置5min，同時以不加微生物絮凝劑的高嶺土懸液為對照。取2cm處上清液，用分光光度計在550nm波長下測定吸光度值。絮凝率RF計算公式為:RF = (A-B)/AX 100%。式中:A為對照上清液的吸光度；B為樣品上清液的吸光度。實施案例I高效絮凝菌的篩選與鑒定絮凝菌株從活性污泥、垃圾滲濾液中篩選，將分離獲得的各菌株分別接入裝有50ml種子培養(yǎng)基(下參實施例3)的250ml廣口三角瓶中，置于搖床中于30°C、200rpm培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液進(jìn)行絮凝率測定方法。得到一株絮凝活性最高的日溝維腸桿菌菌株，其生物保藏號為CCTCC M2013042菌株，命名為eth-2。并將其用作后續(xù)實驗的作用對象。鑒定方法:eth-2如圖1所示，通過16S rRNA測序(測序結(jié)果如SEQ ID NO:1所不)并在 NCBI 中比對，與 Enterobacter.Gergoviae (AB682278.1)相似度達(dá)到 99% 實施例2培養(yǎng)基的配制—、培養(yǎng)基配制1、固體平板培養(yǎng)基:胰蛋白胨，10.0g ;酵母粉，5.0g ；NaCl, 10.0g ;瓊脂粉，20.0g ；蒸餾水，1L。 2、種子培養(yǎng)基:葡萄糖，10.0g ；K2HPO4, 5.0g ；MgS04.7H20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl’0.1g ;尿素，0.5g ;酵母粉，0.5g ;蒸懼水 1L。3、發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖，10.0g ；K2HPO4, 5.0g ；MgS04.7H20,0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl70.1g ;硝酸鈉，1.0g ;蒸懼水 1L。二、微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵條件:所述固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)條件:eth_2菌株接種于所述固體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)I天，培養(yǎng)成熟后放在4 C冰箱中保存。所述種子培養(yǎng)基培養(yǎng)條件:種子培養(yǎng)基在115°C滅菌20min，滅菌后接入所述種子平板培養(yǎng)基菌種，30°C通氣培養(yǎng)24h左右。所述發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基在115°C滅菌20min，滅菌后，按照1%的接種量將菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C通氣培養(yǎng)18h左右。三、微生物絮凝劑的制備:將生物保藏號為CCTCC M2013042為eth_2菌種接種到滅菌的種子培養(yǎng)基中，24h后取Iml種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為30°C條件下培養(yǎng)18h后發(fā)酵液離心分離，去除上清沉淀即為得到生物絮凝劑。eth-2菌落小，約0.5mm,淺黃色，不透明，圓形，邊緣及表面光滑，濕潤，隆起。實施案例3eth_2作微生物絮凝劑的制備1、將最終得到的一定體積的培養(yǎng)液8000rpm,5minl離心,分別收集上清和沉淀，且沉淀用蒸餾水洗3次后重懸于相當(dāng)體積的蒸餾水中，比較上清、沉淀懸液和發(fā)酵液分別對高嶺土的絮凝效果，以確定絮凝活性的分布。結(jié)果如圖2所示，發(fā)酵液、菌懸液和上清液的絮凝率分別為90.45%、94.36%和63.20%，表明eth_2的絮凝活性主要分布在菌體沉淀中，所以以下的實驗中均使用經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗3次后重懸于蒸餾水的菌體沉淀作為微生物絮凝劑。2、碳源對微生物絮凝劑活性的影響:選取葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、淀粉、檸檬酸，各10g，作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基的其它成分為:K2HP04，5.0g ；MgS04.7Η20，0.2g ;KH2P04，2.0g ；NaCl,0.1g ;尿素，0.5g ;酵母粉，0.5g ;蒸餾水IL0對比不同碳源對絮凝活性的影響。結(jié)果如圖3所示:eth_2除了檸檬酸不能利用外，其他碳源都能利用，其中利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖和甘露醇的絮凝率分別為86.17%,78.03%,55.67%,86.31%和81.48%。因為葡萄糖相較乳糖的成本較低，且兩者絮凝率差別較小，所以選擇葡萄糖作為后續(xù)實驗發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。3、氮源對微生物絮凝劑活性的影響:選取單一的物質(zhì)包括蛋白胨、尿素、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨，各0.lg，及混合物質(zhì)0.5g尿素和0.5g酵母粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分為:葡萄糖，IOg ;Κ2ΗΡ04，5.0g ； MgSO4.7Η20，0.2g ；KH2PO4, 2.0g ；NaCl,0.lg;蒸餾水1L。對比不同氮源各1.0g對絮凝活性的影響。結(jié)果(圖4)說明eth-2能利用以上全部氮源，利用胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、NaNOjP (NH4)2SCU乍為氮源的絮凝率分別為95.03%,98.04%,53.63%,92.40%,98.00%和96.50%。其中利用酵母粉和NaNO3的絮凝率都能達(dá)到98%以上，考慮到NaNO3的成本低于酵母粉，且兩者絮凝率相差較小，所以選擇NaNO3作為后續(xù)實驗發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。實施案例4eth_2微生物絮凝劑的穩(wěn)定性1、eth-2微生物絮凝劑的pH穩(wěn)定性將實施案例3中制備的微生物絮凝劑加入到pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的高嶺土懸液中，按照上述絮凝率測定方法測試。絮凝結(jié)果(圖5)表明，在PH3-10范圍下，eth-2 的絮凝率分別為 95.80%,90.28%,93.63%,91.85%,94.10%,93.97%,92.32%和94.70%，都能達(dá)到90%以上，具有良好的pH穩(wěn)定性。2、eth-2 微生物絮凝劑的溫度穩(wěn)定性
將實施案例3中制備的微生物絮凝劑分別置于20°C、30°C、50°C、7(rC和90°C水浴30min，按照上述絮凝率測定方法測試，絮凝結(jié)果如圖6，處理后的絮凝率分別為87.89%,90.02%,82.58%、82.63%和 60.69%，除了 90°C處理后絮凝率有明顯降低外，20°C、30°C、50°C和70°C水浴30min處理對絮凝活性影響不大。3、靜置時間對微生物絮凝劑活性的影響將實施案例3中制備的微生物絮凝劑按照上述絮凝率測定方法測試，靜置時間分別為0.5min、2min、5min、10min和15min,并以相應(yīng)時間點(diǎn)的不加微生物絮凝劑的高嶺土懸液的吸光度作為對照。結(jié)果(圖7)表明eth-2在作用時間為0.5min時的絮凝率即可達(dá)到 97.82%，之后 2min、5min、IOmin 和 15min 絮凝率分別為 96.10%,94.35%,92.39%和93.33%，說明eth-2微生物絮凝劑的絮凝時間短，實際應(yīng)用中有助于縮短絮凝時間。4、微生物絮凝劑用量對絮凝效果的影響將實施案例3中制備的微生物絮凝劑以0.05ml,0.1ml,0.5ml、1.0ml和2.0ml (OD59tl為2.0)不同用量做絮凝測試，測試結(jié)果如圖8，以上用量的絮凝率分別為10.54%、42.25%、87.81%、95.08%和94.61。以上結(jié)果(圖 8)表明用量為 0.5ml (OD59tl 為
2.0)時即可得到較好的絮凝效果，使得絮凝率達(dá)到87%以上。5、金屬離子添加對微生物絮凝劑活性的影響配制金屬離子濃度為0.09mol/L的下列溶液:NaCl、KCl> MgCl2> CaCl2、AlCl3和FeCl3。將以上溶液分別添加Iml到量筒中，再設(shè)置一組未添加任何離子的空白，將實施案例3中制備的微生物絮凝劑按照上述絮凝率測定方法測試。測試結(jié)果如圖9所示，NaCl、KCl、MgCl2' CaCl2' A lCl3, FeCl3 和空白的絮凝率分別為 94.31%,94.83%,95.94%,97.35%,66.88%,20.16%和95.13%。結(jié)果(圖9)表明金屬離子的添加并沒有顯著提高eth_2的絮凝率。未添加金屬離子情況下，eth-2的絮凝率仍可達(dá)到95%以上。實施案例5實際應(yīng)用測試取瀘州老窖污水處理過程中進(jìn)入CASS池前的水48ml加入50ml量筒中，加入Iml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的CaCl2溶液和Iml的_eth_2懸液(OD59tl為2.4)，常溫下上下顛倒搖勻20次，靜置沉淀5min，同時以不加絮凝劑的污水為對照。取2cm處上清液，用分光光度計在550nm波長下測定吸光度值。經(jīng)測定，eth-2微生物絮凝劑對污水的絮凝率可達(dá)90%。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.日溝維腸桿菌在制備微生物絮凝劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述日溝維腸桿菌的生物保藏號為CCTCCM 2013042。
3.微生物絮凝劑的制備方法，其特征在于，具體為:將日溝維腸桿菌菌種用適合于日溝維腸桿菌的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，并分離，所述菌體或菌液為微生物絮凝劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物絮凝劑的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: A種子液的制備 按下述比例制備種子培養(yǎng)基:葡萄糖，10.0g ;Κ2ΗΡ04，5.0g ；MgS04.7Η20，0.2g ；KH2PO4,.2.0g ；NaCl,0.1g ;尿素,0.5g ;酵母粉,0.5g ;蒸懼水IL ;挑取固體培養(yǎng)基上的日溝維腸桿菌接種到滅菌后的所述種子培養(yǎng)基中，30±2°C通氣培養(yǎng)24±6h，得種子液； B發(fā)酵 將步驟A所得生長穩(wěn)定期的種子液體按1-5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30±2°C通氣培養(yǎng)18±2h，離心分離，去除上清液，沉淀即為得到微生物絮凝劑，所述微生物絮凝劑的OD59tl為2.0-2.4 ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基是按如下比例配制:葡萄糖，8.0-12.0g ；K2HP04, 5.0g ；MgSO4.7Η20，0.2g ；KH2P04, 2.0g ；NaCl,0.1g ;硝酸鈉，1.0-1.5g ;蒸餾水 IL0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生物絮凝劑的制備方法，其特征在于，步驟B中所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行等重量替換為蔗糖、乳糖、甘露醇和淀粉中的任一種或多種；步驟B中所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鈉進(jìn)行等重量替換為蛋白胨、尿素、牛肉膏和硫酸銨中的任一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的制備方法，其特征在于，所述日溝維腸桿菌菌種的生物保藏號為CCTCC M 2013042。
7.權(quán)利要求3所述的方法獲得的微生物絮凝劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物絮凝劑，其特征在于，所述微生物絮凝劑為菌體沉淀。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物絮凝劑，其特征在于，所述日溝維腸桿菌菌種的16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
10.運(yùn)用權(quán)利要求7所述的微生物絮凝劑強(qiáng)化污水處理中污泥沉淀的方法，其特征在于，將所述微生物絮凝劑投放至待處理污水中，所述微生物絮凝劑與待處理污水的比例以體積計為2% -10%，處理不少于0.5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腸桿菌制備生物絮凝劑的方法及其用途，具體為日溝維腸桿菌在制備微生物絮凝劑中的應(yīng)用，其作為微生物絮凝劑的制備方法為將菌種接種到滅菌的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后取種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)18h后發(fā)酵液離心分離，去除上清沉淀即為得到生物絮凝劑；本發(fā)明工藝簡單，成本低；制得的絮凝劑活性高、耐熱性強(qiáng)、pH耐受性好、無二次污染，在污水處理中可強(qiáng)化污泥的沉降性，絮凝率可達(dá)到90％，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/20GK103232951SQ20131006187
公開日2013年8月7日 申請日期2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月27日
發(fā)明者宋立巖, 唐薇, 喬婧, 黃亦存, 尹雅潔, 李斗 申請人:重慶綠色智能技術(shù)研究院