一種單核苷酸多態(tài)性分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性分析方法。揭示了一種測定已知單核苷酸多態(tài)性的新方法；針對待測基因模板，設(shè)計特異性引物分別向兩個不同的方向擴增，控制另外兩條分別與特異性引物配對的外圍引物擴增效率，使整個PCR反應(yīng)體系在野生型或者純合突變型標本檢測時只有一種型特異性PCR產(chǎn)物，在雜合標本檢測時有兩種PCR產(chǎn)物，明確區(qū)分野生型/雜合型/突變型。本發(fā)明為臨床檢測提供了一種結(jié)果穩(wěn)定、重復性好、適用機型廣的SNP分析方法。
【專利說明】一種單核苷酸多態(tài)性分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷核酸分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphism, SNP),是指基因組 DNA 中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。SNP在人類基因組中廣泛存在，大概每1000個堿基就有一個SNP。SNP是人類遺傳學變異中最常見的一種。絕大多數(shù)疾病的發(fā)生與環(huán)境因素和遺傳因素的綜合作用有關(guān)，通常認為是在個體具有遺傳易感性的基礎(chǔ)上，環(huán)境有害因素作用而導致疾 病。不同群體和個體對疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學性狀(如對藥物的反應(yīng)性等)有差別，其遺傳學基礎(chǔ)是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是SNP，占所有已知多態(tài)性的90%以上。隨著人類基因組計劃的進展，人們愈來愈相信基因組中的SNP有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對復雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應(yīng)。因此，尋找和研究SNP已成為人類基因組計劃的內(nèi)容和目標之一。繼限制性片段長度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩個遺傳標記之后，成為第三代分子標記。
[0003]SNP具有數(shù)量多，分布廣及高度穩(wěn)定性，適于快速、規(guī)?；Y查，易于基因分型等特點，很適合對復雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識別等方面的研究。SNP檢測在分子診斷、臨床檢驗、法醫(yī)學、病原檢測、遺傳疾病和新藥研發(fā)等方面凸顯出越來越重要的價值。
[0004]SNP檢測技術(shù)發(fā)展很快，出現(xiàn)了許多SNP檢測技術(shù)。大致可以分為以下幾種:
(1)測序方法:Sanger雙脫氧測序，焦磷酸測序(Pyrosequencing),SNaPshot微測序；
(2)基于雜交的方法:Taqman探針法，DNA芯片法；(3)熔解曲線:高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melt, HRM) ； (4)引物延伸:基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption 1nization Time of Flight, MALD1-T0F)；
[5]變性高效液相色譜技術(shù)(DenaturingHigh Performance Liquid Chromatography,DHPLC) ；(6)以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法:限制性片段長度多態(tài)性分析法(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(Single StrandConformation Polymorphism, SSCP),變性梯度凝膠電泳法(Denaturing Gradient GelElectrophoresis, DGGE)。
[0005]各種不同的檢測方法，各有優(yōu)缺點，以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法目前已很少使用，Sanger測序是SNP檢測的金標準，能發(fā)現(xiàn)已知SNP，也能發(fā)現(xiàn)未知SNP ;缺點是每個樣本的每個位點均需要經(jīng)PCR擴增，跑膠，然后切膠純化，再測序，步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，價格昂貴，不適合大樣本多位點檢測。微測序方法(SNaPshot)類似普通測序，10個位點PCR產(chǎn)物同時引物延伸，通量增加；劣勢在于每個樣品的每個位點都需要PCR預(yù)先擴增，跑膠，割膠，DNA純化。10個位點可以同時測序，提高了測序效率，但對延伸引物要求極高，如每個引物有4-6個堿基差異，不能有互補區(qū)段，還要相同條件延伸，除廠家已經(jīng)驗證的少數(shù)位點外，很難自己設(shè)計針對新位點的檢測。多個分散步驟，費錢費時，易出錯?；陔s交的方法包括實時熒光Taqman探針檢測和DNA芯片法，只能檢測已知SNP位點，不能同時發(fā)現(xiàn)未知SNP，Taqman探針法的通量低，DNA芯片法的準確性低，需重復驗證。MALD1-TOF和DHPLC優(yōu)點是快捷、所需樣標本量極少，MALD1-TOF適宜于已經(jīng)優(yōu)化的特定SNP檢測，不適宜該服務(wù)從未做過的新SNP檢測。DHPLC可判斷有否突變，不能確定SNP的位置和類型，需用標準樣品或結(jié)合測序驗證。
[0006]不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的,任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。高分辨率熔解曲線分析(high resolutionmelting analysis, HRM)就是在PCR反應(yīng)體系中加入飽和染料，在PCR反應(yīng)完成后進行升溫變性，并在升溫過程中采集熒光信號，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強度也就下降了，儀器實時記錄溫度和熒光強度的變化，形成熔解曲線，根據(jù)熔解曲線的不同來對樣品來進行區(qū)分。高分辨率熔解曲線-HRM技術(shù)具有如下優(yōu)點:高通量、簡單、快速、低成本、高靈敏度；閉管檢測，避免污染造成的假陽性；可檢測已知和未知SNP ;與傳統(tǒng)的擴增后需借助額外的儀器進行凝膠電泳的非均一性的突變檢測(例如dHPLC)相比，HRM提供了更高特異性和靈敏度的檢測，同時允許更高的樣本檢測通量，大大降低了成本。
[0007]高分辨率熔解曲線對應(yīng)分析為圖像學分析，所有分析都基于野生型、突變型、雜合型參比品熔解曲線的結(jié)果，目前實驗過程中，突變型多為質(zhì)粒，質(zhì)粒和標本擴增效率還是存在差異的，最后熔解曲線峰和實際的標本擴增結(jié)果有差異，會導致實驗結(jié)果誤判。另外HRM對標本定量要求非常嚴格，如果標本定量不準，不同標本之間擴增效率會有差異，會影響后面的分析結(jié)果，兩種純合狀態(tài)可能會誤判，也可能會被判讀為未知突變。在標本定量較準的情況下，也有可能因為不同標本中存在的抑制PCR擴增的因素不一樣，導致擴增效率有所不同，同樣也會干擾 最后的分析結(jié)果。
[0008]針對高分辨率熔解曲線法的一些弊端，需要一種適用機型更廣，結(jié)果穩(wěn)定，重復性好，適用于臨床應(yīng)用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種新的單核苷酸多態(tài)性分析方法。
[0010]本發(fā)明提供一種基于等位基因特異性擴增的SNP檢測方法，包括如下步驟:
[0011](I)以待測基因為模板，以針對SNP位點的特異性引物以及與特異性引物配對的外圍引物為引物，以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增；
[0012]其中，所述的針對SNP位點的特異性引物包括:針對野生型等位基因位點的內(nèi)引物1，以其3’末端堿基起算第1-3位的堿基與野生型SNP位點堿基匹配；針對突變型等位基因位點的內(nèi)引物2，以其3’末端堿基起算第1-3位的堿基與突變型SNP位點堿基匹配而；
[0013]所述的外圍引物是遠離SNP位點的引物，包括:與內(nèi)引物I構(gòu)成引物對的外圍引物1，與內(nèi)引物2構(gòu)成引物對的外圍引物2 ;
[0014]并且，控制(抑制)外圍引物I和外圍引物2的擴增效率使之比內(nèi)引物I和內(nèi)引物2的擴增效率低；使外圍引物I和外圍引物2之間不形成擴增產(chǎn)物；
[0015](2)分析PCR擴增產(chǎn)物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型(包括:野生型基因、突變型基因或雜合型基因)。
[0016]在一個優(yōu)選例中，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I的Tm值，使之比內(nèi)引物I的Tm值低1-8°C (較佳地低2-7V ;更佳地低3_6°C ;如5°C );控制外圍引物2的Tm值，使之比內(nèi)引物2的Tm值低2_8 V (較佳地低2_7 V ；更佳地低3_6 V ；如5 0C )。
[0017]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I濃度使之比內(nèi)引物I的濃度低5-20倍；控制外圍引物2濃度使之比內(nèi)引物2的濃度低5-20倍。
[0018]在另一優(yōu)選例中，一個PCR擴增體系中，所述的外圍引物與內(nèi)引物的濃度相同或相近。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)引物I和/或內(nèi)引物2中，以其3’末端堿基起算，第2-6個堿基處設(shè)置一與待測基因模板不匹配的堿基；和/或所述的內(nèi)引物2中，以其3’末端堿基起算，第2-6個堿基處設(shè)置一與待測基因模板不匹配的堿基。
[0020]在另一優(yōu)選例中，內(nèi)引物和外圍引物中，除了上述特別限定的不匹配堿基外，其它喊基與待測基因1?板相應(yīng)喊基互補。
[0021]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，確定待測樣品中待測基因的SNP類型的方法如下:
[0022]如生成單一的型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為野生型基因或突變型基因；
[0023]如同時生成兩種型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為雜合型基因。
[0024]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用熔解曲線分析的方法分析PCR擴增產(chǎn)物。
[0025]在另一優(yōu)選例中，以待測基因為模板，調(diào)整外圍引物I和外圍引物2的位置，使得內(nèi)引物I和外圍引物I擴增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm)與內(nèi)引物2和外圍引物2的擴增產(chǎn)物的熔解溫度差異顯著。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的熔解溫度差異顯著是應(yīng)用熔解曲線分析儀器足夠區(qū)分的差異(如擴增產(chǎn)物Tm值差異在2°C或以上；更佳地在3°C或以上；更佳地在4°C或以上)。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)引物I或內(nèi)引物2的長度為10_60bp(較佳地12_50bp ；更佳地18-30bp)。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的外圍引物I或外圍引物2的長度為10_60bp(較佳地12-50bp ;更佳地 18-30bp)。
[0029]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用Taqman分析的方法分析PCR擴增產(chǎn)物。
[0030]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1、特異性引物及突變的設(shè)計示意圖，其中，長實線表示核苷酸鏈，《]，，表示兩條核苷酸鏈中相應(yīng)堿基之間存在匹配關(guān)系，“,，，或+表示兩條核苷酸鏈中相應(yīng)堿基之

間不存在匹配關(guān)系。
[0032]圖2、對于野生型模板、突變型模板、雜合型模板，引物與模板結(jié)合擴增模式圖。其中PF1、PR2表示兩種特異性引物，PR1、RF2表示兩種普通引物。
[0033]圖3、本發(fā)明實施例中PCR擴增的流程示意圖。[0034]圖4、實施例1中各組PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。A:組別一 ；B:組別二 ；C:組別三；D:組別四。其中，P IO5表示參比品模擬的突變型標本(IO5拷貝)，P IO4表示參比品模擬的突變型標本(IO4拷貝)，P:H(1:1)表示突變型標本(IO4拷貝)與野生型標本(IO4拷貝)比例1:1混合模擬雜合標本(復孔)，HGD表示野生型標本，Blank表示空白對照。Marker為 DL2000，其條帶自下而上為 IOObp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
[0035]圖5、實施例2中組一 PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線圖。A、TPMT2_PR)1和TPMT2-PR01熔解曲線圖；B_C、TPMT2-PF01和TPMT2-PR01HRM分析結(jié)果。
[0036]圖6、實施例2中組二 PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線圖。A、PMT2-PF02和TPMT2-PR02熔解曲線圖；B_C、TPMT2-PF02和TPMT2-PR02HRM分析結(jié)果。
[0037]圖7、實施例 2 中組三:TP-2_W_F3，Set2_M R2, TP-2-F，TP-2-R2 PCR 擴增產(chǎn)物的熔解曲線圖。
[0038]圖8、實施例3中組一 PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。其中，PlO5表示參比品模擬的突變型標本(IO5拷貝)，P IO4表示參比品模擬的突變型標本(IO4拷貝)，P:H(1:1)表示突變型標本(IO4拷貝)與野生型標本(IO4拷貝)比例1:1混合模擬雜合標本(復孔)，HGD表示野生型標本，Blank表示空白對照。
[0039]圖9、實施例3中組二 PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。各泳道定義同圖8。
[0040]圖10、實施例3中組一的熔解曲線；其中，A、突變型熔解曲線如，B、雜合型熔解曲線，C、野生型熔解曲線。
[0041]圖11、實施例3中組二的熔解曲線；其中，A、突變型熔解曲線如，B、雜合型熔解曲線，C、野生型熔解曲線。
[0042]圖12、應(yīng)用Roche480進行熔解曲線繪制的結(jié)果；其中，A、野生型和突變型熔解曲線，B、雜合型熔解曲線。
[0043]圖13、應(yīng)用ABI7300進行熔解曲線繪制的結(jié)果；其中，A、野生型和突變型熔解曲線，B、雜合型熔解曲線。
【具體實施方式】
[0044]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，開發(fā)了一種測定已知SNP的新方法。針對待測基因模板，設(shè)計特異性引物分別向兩個不同的方向擴增，控制另外兩條分別與特異性引物配對的外圍引物擴增效率，使整個PCR反應(yīng)體系在野生型或者純合突變型標本檢測時，只有一種型特異性PCR產(chǎn)物，在雜合標本檢測時，有兩種PCR產(chǎn)物，明確區(qū)分野生型/雜合型/突變型。本發(fā)明為臨床檢測提供了一種結(jié)果穩(wěn)定、重復性好、適用機型廣的SNP分析方法。
[0045]如本文所用，所述的“內(nèi)引物”與“特異性引物”或“等位基因特異性引物”可互換使用，是指針對SNP位點的引物，所述內(nèi)引物3’末端堿基對應(yīng)于SNP位點，分別與野生型和突變型模板匹配的引物。
[0046]如本文所用，所述的“外圍引物”與“普通引物”可互換使用，是指
[0047]如本文所用，堿基的“匹配”或“配對”是指兩條核苷酸序列中相應(yīng)的堿基構(gòu)成了鍵(如氫鍵)的連接，例如“A”與“T”之間可形成鍵。兩條序列中足夠多(如多于60%的核苷酸是配對的)核苷酸的“匹配”使得兩條序列發(fā)生互補。
[0048] 如本文所用熔解曲線(Dissociation curve) ”指反映隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。
[0049]如本文所用，“熔解溫度(Tm) ”指總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半的溫度，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高則Tm值越高，成正比關(guān)系。
[0050]本發(fā)明的方法基于等位基因特異性PCR(allele specific PCR ;AS_PCR)，即將突變堿基設(shè)計于突變引物的3'端，利用引物與模板不能很好地匹配，延伸反應(yīng)受阻，擴增反應(yīng)后，根據(jù)電泳譜即可確定樣品的基因型。由于PCR過程中引物延伸是3’端開始的，所以3’末端的堿基對引物的延伸來說處于至關(guān)重要的位置。如果這個堿基與模板互補，則引物能從不間斷延伸，PCR可以正常進行，得到特定長度擴增帶；反之亦然。所以只要將突變與正常等位基因所不同的那個堿基安排在3’最末端，當用某一含突變序列的引物進行PCR時，如果得到特異擴增帶，表明被測基因含有該種突變。沒有特異擴增帶出現(xiàn)，則表示沒有這種突變。
[0051]本發(fā)明的方法中，通過設(shè)計兩條特異性引物(分別與兩條模板鏈互補，且涵蓋SNP位置)、兩條普通引物(分布在兩條特異性引物外圍)，通過引物設(shè)計和反應(yīng)體系中加入引物比例控制外圍引物的有效擴增，從而在反應(yīng)體系中，野生型和突變型標本檢測時，只生成單一的型特異性PCR產(chǎn)物，雜合標本檢測時，生成兩種型特異性PCR產(chǎn)物。
[0052]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在特異性引物設(shè)計，結(jié)合擴增目的片段，將SNP突變位點置于引物3’端，同時在靠近引物3’端其它堿基處引入一個錯配堿基，使之與另外一種模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸，而相對在靠近3’端存在錯配的引物則可以較好與該模板互補，相應(yīng)引物得以延伸并得到相應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物，達到選擇性擴增靶標序列的目的。
[0053]一種引物及突變的設(shè)計如圖1所示，其中①②分別為野生型和突變型特異性引物，③④分別為野生型和突變型模板，⑤⑥分別是①②引物中引入的突變。采用特異性引物針對SNP突變類型進行特異性擴增，野生型引物和突變型引物分別和模板的正義和反義鏈結(jié)合，分別向兩個不同的方向擴增，并分別設(shè)計相配對的另外一條引物。控制外圍引物的有效擴增，從而達到一個非常好的區(qū)分效果。結(jié)合SNP位點，引物和模板結(jié)合擴增模式圖如圖2。
[0054]采用雙向多重特異性PCR擴增，可以在一個反應(yīng)體系中對已知SNP進行檢測，如果采用熔解曲線分析的方法，需要調(diào)整相應(yīng)匹配的另外一條引物的位置，從而調(diào)整兩種不同型特異性PCR產(chǎn)物的Tm值，達到區(qū)分不同特異性產(chǎn)物的目的。如果采用Taqman的分析方法，則需要在兩種不同通道設(shè)計相關(guān)檢測探針，通過兩個不同通道的檢測，區(qū)分不同特異性PCR產(chǎn)物。
[0055]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用熔解曲線分析法。不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。高分辨率熔解曲線HRM技術(shù)的基本原理就是在PCR反應(yīng)之前加入飽和染料，在PCR反應(yīng)之后進行升溫變性，采集熒光信號，根據(jù)熔解曲線的不同即Tm值的不同來對樣品來進行區(qū)分。而G-C突變和A-T突變Tm值差異非常小，采用HRM分析技術(shù)，區(qū)分突變尤為困難。本項發(fā)明針對G-C和A-T突變采用一種全新的解決方案，采用多重特異性PCR擴增的方法進行設(shè)計，采用普通熔解曲線分析方法，即可達到非常好的區(qū)分效果，該方案也可以很方便地拓展至雙通道Taqman探針檢測。
[0056]熔解曲線和Taqman探針檢測法，雙向多重特異性PCR擴增設(shè)計方法一致，僅檢測手段不同；因此，雖然本發(fā)明的實施例僅圍繞熔解曲線分析的方法展開，但是其它下游檢測手段如Taqman探針檢測法也應(yīng)包含在本發(fā)明中。
[0057]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0058]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0059]實施例序列相關(guān)信息
[0060]野生型DNA 序列(SEQ ID NO:1)突變 GCA-CCA
[0061]tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc
[0062]ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa
[0063]acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggttt 2.Ca gaccgggg acacagtgta
[0064]gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct
[0065]tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat
[0066]突變型DNA 序列(SEQ ID NO: 2)
[0067]tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc
[0068]ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa
[0069]acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggttt C Ca gaccgggg acacagtgta
[0070]gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct
[0071]tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat
[0072]檢測相關(guān)操作步驟
[0073]1、野生型DNA序列樣本的制備
[0074]野生型樣本制備直接從正常人外周血液中抽提人基因組DNA，正常人外周血DNA抽提步驟如下:
[0075]a.血液DNA抽提前，打開恒溫水浴槽，將溫度設(shè)定為70°C。
[0076]b.準備血液DNA抽提時，將OB蛋白酶從_20°C冰箱取出來，置于室溫，解凍。
[0077]c.根據(jù)抽提標本的數(shù)量(大約每個樣本250ul)，取出相應(yīng)數(shù)量DNA洗脫緩沖液置于70°C預(yù)熱。
[0078]d.取250ul標本置于一干凈的小離心管，并做上標記。
[0079]e.加入25ul的OB蛋白酶，振蕩均勻。加入250ul的XY緩沖液，劇烈振蕩10秒以使溶液和標本混和均勻。
[0080]f.70°C水浴15min，水浴期間短時間內(nèi)顛倒混勻管子一次，如果抗凝血放置時間較長，建議延長水浴時間至30min。
[0081]g.加入260ul的無水乙醇，混勻。
[0082]h.把Mu-Pu基因組DNA分離柱置于一個2ml收集試管中(已提供)，將第五步得到的溶液轉(zhuǎn)入柱子中，1000Orpm離心2min，棄去該收集試管和流出液。
[0083]1.置柱子于另一收集試管，用700ul的乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌，1000Orpm再次離心2min，棄去該收集試管及流出液。
[0084]j.加入700ul的DNA洗滌緩沖液再洗滌一次并按上一步條件離心。棄去流出液。
[0085]k.用極速(12000rpm)離心4min以甩干柱子。
[0086]1.將柱子置于一 1.5ml滅菌離心管中，加入100ul70°C預(yù)熱的DNA洗脫緩沖液。將離心管置于室溫3min。
[0087]m.將柱子以1000Orpm離心5min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液，棄去柱子，洗脫 DNA。
[0088]η.將得到的DNA用HITCH分光光度儀檢測0D260、0D280數(shù)值，平行測量三次，計算檢測DNA濃度，純度檢定參考比值0D260/0D280為:1.5~2.0。
[0089]ο.將測定的濃度歸一化到IO4拷貝，進行小量分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0090]2、突變型DNA序列樣本的制備(突變參比品)
[0091]突變型標本比較難以獲得，采用合成的方式，合成相應(yīng)片段，裝入pGEM-Teasy載體(Promega),轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α?？剐訪B培養(yǎng)基體外培養(yǎng),抽提質(zhì)粒，得到的質(zhì)粒重新定量，并稀釋至IO5拷貝、IO4拷貝，并小量分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0092]3、雜合型DNA序列樣本制備(雜合參比品)
[0093]將歸一化至 IO4拷貝的野生型DNA序列樣本和稀釋至IO4拷貝的突變DNA序列樣本等量混合，并小量分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0094]4、PCR 擴增
[0095]4.1引物的工作液的配制
[0096]a.由于引物為很輕的干粉附在管壁上，打開極易散失，在打開管蓋前，將裝有待稀釋引物的離心管以15000rpm的轉(zhuǎn)速，離心5分鐘；
[0097]b.從離心機取出離心管后，小心打開管蓋，加入相應(yīng)體積的滅菌水(引物儲存液濃度IOOuM),然后將管蓋蓋緊；
[0098]c.將離心管置于渦旋儀漩渦振蕩30s，然后以15000rpm的轉(zhuǎn)速離心I分鐘，室溫靜置30分鐘；
[0099]d.將取出的引物液體稀釋，用分光光度儀檢測0D260、0D280數(shù)值，計算檢測引物。參照定量結(jié)果，取少量儲存液稀釋至10uM。
[0100]4.3PCR 擴增
[0101]流程如圖3。
[0102]實施例1、特異性引物篩選實驗
[0103]實驗?zāi)康?引入突變，調(diào)整SNP位點和引入突變位點的位置及堿基，篩選特異性引物。
[0104]1、實驗材料
[0105]采用野生型，突變型和雜合樣本篩選引物，分析引物靈敏度和特異性。
[0106]2、實驗分組
[0107]組別一:引物組TPPF_WT_1 (特異性引物，簡稱“特”)和TP-2-R2 (普通引物，簡稱“普，，);
[0108]組別二:引物組TPPF_WT_2 (特)和 TP-2-R2 (普)；
[0109]組別三:弓I 物組 TP_2_W_F3 (特)和 TP-2-R2 (普)；[0110]組別四:引物組TP-2_ff_F4 (特)和 TP-2-R2 (普)。
[0111]3、引物序列及PCR產(chǎn)物相關(guān)信息
[0112]TPPF_WT_1:5’ -TGTATGATTTTATGCAGG ￡ TT β C-3’ (SEQ ID NO:3)；
[0113]TPPF_WT_2:5，-TGTATGATTTTATGCAGG G TT G C_3，(SEQ ID NO:4)；
[0114]TP-2_W_F3:5’ -AATGTATGATTTTATGCAGGT ▲ T β._3’ (SEQ ID NO:5)；
[0115]TP-2_W_F4:5’ -AAATGTATGATTTTATGCAGGT β T _3’ (SEQ ID NO:6)；
[0116]TP-2-R2:5’ -CTTCTGAGTAAGAAAGATTCTGC-3’ (SEQ ID NO:7)。
[0117]注:雙下劃線加粗堿某為SNP位點，單下劃線加粗堿基是設(shè)計引入的突變位點。
[0118]4、野生型標本制備，突變型樣本制備，雜合樣本制備，PCR擴增，具體操作如前面提供的相應(yīng)序列信息及操作步驟。
[0119]PCR體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種基于等位基因特異性擴增的SNP檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以待測基因為模板，以針對SNP位點的特異性引物以及與特異性引物配對的外圍引物為引物，以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增； 其中，所述的針對SNP位點的特異性引物包括:針對野生型等位基因位點的內(nèi)引物1，以其3’末端堿基起算第1-3位的堿基與野生型SNP位點堿基匹配；針對突變型等位基因位點的內(nèi)引物2，以其3’末端堿基起算第1-3位的堿基與突變型SNP位點堿基匹配而； 所述的外圍引物是遠離SNP位點的引物，包括:與內(nèi)引物I構(gòu)成引物對的外圍引物1，與內(nèi)引物2構(gòu)成引物對的外圍引物2 ； 并且，控制 外圍引物I和外圍引物2的擴增效率使之比內(nèi)引物I和內(nèi)引物2的擴增效率低；使外圍引物I和外圍引物2之間不形成擴增產(chǎn)物； (2)分析PCR擴增產(chǎn)物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I的Tm值，使之比內(nèi)引物I的Tm值低1_8°C ;控制外圍引物2的Tm值，使之比內(nèi)引物2的Tm值低1-8°C。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，控制擴增效率的方法是:控制外圍引物I濃度使之比內(nèi)引物I的濃度低5-20倍；控制外圍引物2濃度使之比內(nèi)引物2的濃度低5-20倍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內(nèi)引物I和/或內(nèi)引物2中，以其3’末端堿基起算，第2-6個堿基處設(shè)置一與待測基因模板不匹配的堿基；和/或 所述的內(nèi)引物2中，以其3’末端堿基起算，第2-6個堿基處設(shè)置一與待測基因模板不匹配的堿基。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，確定待測樣品中待測基因的SNP類型的方法如下: 如生成單一的型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為野生型基因或突變型基因； 如同時生成兩種型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為雜合型基因。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用熔解曲線分析的方法分析PCR擴增產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，以待測基因為模板，調(diào)整外圍引物I和外圍引物2的位置，使得內(nèi)引物I和外圍引物I擴增產(chǎn)物的熔解溫度與內(nèi)引物2和外圍引物2的擴增產(chǎn)物的熔解溫度差異顯著。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的熔解溫度差異顯著是應(yīng)用熔解曲線分析儀器足夠區(qū)分的差異。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內(nèi)引物I或內(nèi)引物2的長度為10_60bp。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外圍引物I或外圍引物2的長度為10_60bp。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004821SQ201310062203
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月27日
【發(fā)明者】郭安亮, 姚見兒, 王方金, 劉榴 申請人:上海透景生命科技有限公司