一種單核苷酸多態(tài)性熔解曲線分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性熔解曲線分析方法。本發(fā)明的方法基于等位基因特異性擴(kuò)增法，針對已知SNP檢測位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩條特異性引物，其中一條特異性引物設(shè)計(jì)時(shí)加入一段無關(guān)序列，從而增加兩種不同PCR產(chǎn)物的Tm值的區(qū)分度，在一個(gè)體系中檢測已知SNP突變，明確區(qū)分野生型，雜合型和突變型，為臨床檢測提供一種結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用機(jī)型更廣的SNP分析方法。
【專利說明】一種單核苷酸多態(tài)性熔解曲線分析方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷核酸分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性熔解曲線分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphism, SNP),是指基因組 DNA 中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。SNP在人類基因組中廣泛存在，大概每1000個(gè)堿基就有一個(gè)SNP。SNP是人類遺傳學(xué)變異中最常見的一種，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生與環(huán)境因素和遺傳因素的綜合作用有關(guān)，通常認(rèn)為是在個(gè)體具有遺傳易感性的基礎(chǔ)上，環(huán)境有害因素作用而導(dǎo)致疾病。不同群體和個(gè)體對疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學(xué)性狀(如對藥物的反應(yīng)性等)有差別，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是SNP，占所有已知多態(tài)性的90%以上。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，人們愈來愈相信基因組中的SNP有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對疾病，特別是對復(fù)雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應(yīng)，尋找和研究SNP已成為人類基因組計(jì)劃的內(nèi)容和目標(biāo)之一。繼限制性片段長度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩個(gè)遺傳標(biāo)記之后，成為第三代分子標(biāo)記。
[0003]SNP具有數(shù)量多，分布廣及高度穩(wěn)定性，適于快速、規(guī)模化篩查，易于基因分型等特點(diǎn)，很適合對復(fù)雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識(shí)別等方面的研究。SNP檢測在分子診斷、臨床檢驗(yàn)、法醫(yī)學(xué)、病原檢測、遺傳疾病和新藥研發(fā)等方面凸顯出越來越重要的價(jià)值。
[0004]I) SNP檢測技術(shù) 發(fā)展很快，出現(xiàn)了許多SNP檢測技術(shù)。大致可以分為以下幾種:
(1)測序方法:Sanger雙脫氧測序，焦磷酸測序(Pyrosequencing),SNaPshot微測序；
(2)基于雜交的方法=Taqman探針法，DNA芯片法；(3)熔解曲線:高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melt, HRM) ； (4)引物延伸:基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption 1nization Time of Flight, MALD1-T0F)；
[5]變性高效液相色譜技術(shù)(DenaturingHighPerformance Liquid Chromatography,DHPLC) ；(6)以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法:限制性片段長度多態(tài)性分析法(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(Single StrandConformation Polymorphism, SSCP),變性梯度凝膠電泳法(Denaturing Gradient GelElectrophoresis, DGGE)。
[0005]各種不同的檢測方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)，以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法目前已很少使用，Sanger測序是SNP檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，能發(fā)現(xiàn)已知SNP，也能發(fā)現(xiàn)未知SNP ;缺點(diǎn)是每個(gè)樣本的每個(gè)位點(diǎn)均需要經(jīng)PCR擴(kuò)增，跑膠，然后切膠純化，再測序，步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，價(jià)格昂貴，不適合大樣本多位點(diǎn)檢測。微測序方法(SNaPshot)類似普通測序，10個(gè)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物同時(shí)引物延伸，通量增加；劣勢在于每個(gè)樣品的每個(gè)位點(diǎn)都需要PCR預(yù)先擴(kuò)增，跑膠，割膠，DNA純化。10個(gè)位點(diǎn)可以同時(shí)測序，提高了測序效率，但對延伸引物要求極高，如每個(gè)引物有4-6個(gè)堿基差異，不能有互補(bǔ)區(qū)段，還要相同條件延伸，除廠家已經(jīng)驗(yàn)證的少數(shù)位點(diǎn)外，很難自己設(shè)計(jì)針對新位點(diǎn)的檢測。多個(gè)分散步驟，費(fèi)錢費(fèi)時(shí)，易出錯(cuò)?；陔s交的方法包括實(shí)時(shí)熒光Taqman探針檢測和DNA芯片法，只能檢測已知SNP位點(diǎn)，不能同時(shí)發(fā)現(xiàn)未知SNP，Taqman探針法的通量低，DNA芯片法的準(zhǔn)確性低，需重復(fù)驗(yàn)證。MALD1-TOF和DHPLC優(yōu)點(diǎn)是快捷、所需樣標(biāo)本量極少，MALD1-TOF適宜于已經(jīng)優(yōu)化的特定SNP檢測，不適宜該服務(wù)從未做過的新SNP檢測。DHPLC可判斷有否突變，不能確定SNP的位置和類型，需用標(biāo)準(zhǔn)樣品或結(jié)合測序驗(yàn)證。
[0006]不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的,任何雙鏈DNA分子在加熱變性時(shí)都會(huì)有自己熔解曲線的形狀和位置。高分辨率熔解曲線分析(high resolutionmelting analysis, HRM)就是在PCR反應(yīng)體系中加入飽和染料，在PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行升溫變性，并在升溫過程中采集熒光信號(hào)，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強(qiáng)度也就下降了，儀器實(shí)時(shí)記錄溫度和熒光強(qiáng)度的變化，形成熔解曲線，根據(jù)熔解曲線的不同來對樣品來進(jìn)行區(qū)分。高分辨率熔解曲線-HRM技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn):高通量、簡單、快速、低成本、高靈敏度；閉管檢測，避免污染造成的假陽性；可檢測已知和未知SNP ;與傳統(tǒng)的擴(kuò)增后需借助額外的儀器進(jìn)行凝膠電泳的非均一性的突變檢測(例如dHPLC)相比，HRM提供了更高特異性和靈敏度的檢測，同時(shí)允許更高的樣本檢測通量，大大降低了成本。其缺點(diǎn)在于只能在如LightCycIer?480PCR儀,或LightScanner等少量儀器上使用。專業(yè)技術(shù)要求高，需要專業(yè)人員操作。
[0007]高分辨率熔解曲線對應(yīng)分析為圖像學(xué)分析，所有分析都基于野生型、突變型、雜合型參比品熔解曲線的結(jié)果，目前實(shí)驗(yàn)過程中，突變型多為質(zhì)粒，質(zhì)粒和標(biāo)本擴(kuò)增效率存在差異的，最后熔解曲線峰和實(shí)際的標(biāo)本擴(kuò)增結(jié)果有差異，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤判。另外HRM對標(biāo)本定量要求非常嚴(yán)格，如果標(biāo)本定量不準(zhǔn)，不同標(biāo)本之間擴(kuò)增效率會(huì)有差異，會(huì)影響后面的分析結(jié)果，兩種純合 狀態(tài)可能會(huì)誤判，在標(biāo)本定量較準(zhǔn)的情況下，也有可能因?yàn)椴煌瑯?biāo)本中存在的抑制PCR擴(kuò)增的因素不一樣，導(dǎo)致擴(kuò)增效率有所不同，同樣也會(huì)干擾最后的分析結(jié)果。在大量標(biāo)本檢測過程中，一部分標(biāo)本檢測會(huì)被判讀為未知突變，需要其它檢測方法驗(yàn)證。
[0008]針對高分辨率熔解曲線法的一些弊端，需要一種適用機(jī)型更廣，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用于臨床應(yīng)用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種單核苷酸多態(tài)性熔解曲線分析方法。
[0010]本發(fā)明提供一種基于等位基因特異性擴(kuò)增的SNP檢測方法，包括如下步驟:
[0011](I)以待測基因?yàn)槟０?，以針對SNP位點(diǎn)的特異性引物以及與特異性引物配對的公用引物為引物，以Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012]其中，所述的針對SNP位點(diǎn)的特異性引物包括針對野生型等位基因位點(diǎn)的引物I ;針對突變型等位基因位點(diǎn)的引物2，所述引物I和引物2具有如下序列:
[0013]A-B-C ;其中，A為與模板匹配的序列片段，B為針對SNP位點(diǎn)的堿基；B在引物I和引物2中不同，在一條引物中B與野生型SNP位點(diǎn)堿基匹配，在另一引物中B與突變型SNP位點(diǎn)堿基匹配；C為無或?yàn)?-2個(gè)堿基的與模板匹配的序列片段；[0014]且，引物I或引物2中一條引物的5’端還包括5-30個(gè)(較佳地6_20個(gè)；更佳地8-20個(gè)；如10個(gè))堿基的與野生型及突變型模板均不匹配的無關(guān)序列，使得引物I與引物2的Tm值差異大于2V (如2-8°C ;較佳地3-7°C ;更佳地4-6°C ;如5°C )；
[0015]所述的公用引物是遠(yuǎn)離SNP位點(diǎn)的引物，其與引物I或引物2構(gòu)成引物對；
[0016](2)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型(包括:野生型基因、突變型基因或雜合型基因)。
[0017]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的引物I與公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度小于IOObp ;和/或所述的引物2與公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度小于IOObp ;如40-80bp ;更特別如50bp，60bp，70bpo
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的引物I和引物2中，以其3’末端堿基起算，第3-8個(gè)堿基處設(shè)置一與待測基因模板不匹配的堿基。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述特異性引物中，除了所限定的不匹配堿基外，其它堿基與待測基因模板中相應(yīng)堿基匹配。
[0020]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，確定待測樣品中待測基因的SNP類型的方法如下:
[0021]如生成單一的型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為野生型基因或突變型基因；
[0022]如同時(shí)生成兩種型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為雜合型基因。
[0023]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用熔解曲線分析的方法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0024]在另一優(yōu)選例中，引物I和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物與引物2和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm)差異顯著。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的熔解溫度差異顯著是應(yīng)用熔解曲線分析儀器足夠區(qū)分的差異。
[0026]在另一優(yōu)選例中，根據(jù)A-B序列中G-C含量來設(shè)計(jì)無關(guān)序列中G-C含量，使得引物I與引物2的G-C含量差異顯著。
[0027]在另一優(yōu)選例中，引物I和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物與引物2和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm)差異在2°C或以上；更佳地在3°C或以上；更佳地在4°C或以上。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的引物I或引物2的長度為10_60bp ;較佳地12_50bp ;更佳地 15-40bp。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的公用引物的長度為10_60bp ;較佳地12_50bp ;更佳地15_40bpo [0030]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1、不同類型的特異性引物和模板結(jié)合的圖示，其中，長實(shí)線表示核苷酸鏈，?I，，表示兩條核苷酸鏈中相應(yīng)堿基之間存在匹配關(guān)系，“ ,?或+表示兩條核苷酸鏈
6i J_L，7“ I ” a _L，，
中相應(yīng)堿基之間不存在匹配關(guān)系。
[0032]圖2、對于野生型模板、突變型模板、雜合型模板，引物與模板結(jié)合擴(kuò)增模式圖。其中PFl表示與野生型模版特異性結(jié)合的引物、PF2表示與突變型模板特異性結(jié)合的引物，PR表示公用配對引物。
[0033]圖3、本發(fā)明實(shí)施例中PCR擴(kuò)增的流程示意圖。
[0034]圖4、實(shí)施例1中各組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。A:組別一 ；B:組別二 ；C:組別三；D:組別四。其中，IO5表示參比品模擬的突變型樣本IO5拷貝，P:HGD(1:1)表示參比品(IO4拷貝)與正常人基因組(IO4拷貝)比例1:1混合模擬雜合樣本(復(fù)孔)，HGD表示正常樣本，Blank表示空白對照。Marker為DL2000，其條帶自下而上為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp
[0035]圖5、實(shí)施例2中組一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析結(jié)果。A、TPMT2_PR)1和TPMT2-PR01熔解曲線圖；B-C、TPMT2-PF01和TPMT2-PR01HRM其它分析結(jié)果圖。
[0036]圖6、實(shí)施例2中組二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析結(jié)果。A、TPMT2_PF02和TPMT2-PR02熔解曲線圖；B_C、TPMT2-PF02和TPMT2-PR02HRM其它分析結(jié)果圖。
[0037]圖7、實(shí)施例3中組一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析結(jié)果。A、TP_2_ff_F3、TP_2_M_AF5與TPPR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線圖；B-C、TP_2_W_F3、TP_2_M_AF5與TPPR擴(kuò)增產(chǎn)物HRM其它分析結(jié)果圖。
[0038]圖8、實(shí)施例3中組二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析結(jié)果。A、TP_2_ff_F3、TP_2_M_AF5與TP-2-R熔解曲線圖；B-C、HRM其它分析結(jié)果。
[0039]圖9、實(shí)施例3中組三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析結(jié)果。A、TP_2_W_F3、TP_2_M_AF5與TP-2-R2熔解曲線圖；B-C、HRM其它分析結(jié)果。
[0040]圖10、實(shí)施例3中不同組別突變型和野生型Tm值比較圖。
[0041]圖11、應(yīng)用 ABI7300 進(jìn)行檢測的分析結(jié)果。A、TP_2_W_F3、TP_2_M_AF5 與 TPPR 的檢測結(jié)果；B、TP_2_W_F3、TP_2_M_AF5 與 TP-2-R 的檢測結(jié)果；C、TP_2_W_F3、TP_2_M_AF5 與TP-2-R2的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，開發(fā)了一種測定已知SNP的新方法。本發(fā)明的方法基于等位基因特異性擴(kuò)增法，針對已知SNP檢測位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩條特異性引物，其中一條特異性引物設(shè)計(jì)時(shí)加入一段無關(guān)序列，從而增加兩種不同PCR產(chǎn)物的Tm值的區(qū)分度，在一個(gè)體系中檢測已知SNP突變，明確區(qū)分野生型，雜合型和突變型，為臨床檢測提供一種結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用機(jī)型更廣的SNP分析方法。
[0043]如本文所用，所述的“特異性引物”或“等位基因特異性引物”可互換使用，是指針對SNP位點(diǎn)的引物，所述特異性引物3’末端堿基對應(yīng)于SNP位點(diǎn)，分別與突變型和野生型匹配的兩條特異性引物。
[0044]如本文所用，所述的“公用引物”是針對所述待測基于模板的且遠(yuǎn)離SNP位點(diǎn)的引物，與特異性引物構(gòu)成引物對。
[0045]如本文所用，堿基的“匹配”或“配對”是指兩條核苷酸序列中相應(yīng)的堿基構(gòu)成了鍵(如氫鍵)的連接，例如“A”與“T”之間可形成鍵。兩條序列中足夠多(如多于60%的核苷酸是配對的)核苷酸的“匹配”使得兩條序列發(fā)生互補(bǔ)。
[0046] 如本文所用熔解曲線(Dissociation curve) ”指反映隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。[0047]如本文所用，“熔解溫度(Tm) ”指總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半的溫度，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高則Tm值越高，成正比關(guān)系。
[0048]本發(fā)明的方法基于等位基因特異性PCR(allele specific PCR ;AS_PCR)，即將突變堿基設(shè)計(jì)于突變引物的3'端，利用引物與模板無法很好匹配延伸反應(yīng)受阻，擴(kuò)增反應(yīng)后，根據(jù)電泳譜即可確定樣品的基因型。由于PCR過程中引物延伸是3’端開始的，所以3’末端的堿基對引物的延伸來說處于至關(guān)重要的位置。如果這個(gè)堿基與模板互補(bǔ)，則引物能延伸，PCR可以正常進(jìn)行，得到特定長度擴(kuò)增帶；反之亦然。所以只要將突變與正常等位基因所不同的那個(gè)堿基設(shè)置在3’最末端，當(dāng)用某一含突變序列的引物進(jìn)行PCR時(shí)，如果得到特異擴(kuò)增帶，表明被測基因含有該種突變。沒有特異擴(kuò)增帶出現(xiàn)，則表示沒有這種突變。
[0049]不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何雙鏈DNA分子在加熱變性時(shí)都會(huì)有自己熔解曲線的形狀和位置。高分辨率熔解曲線HRM技術(shù)的基本原理就是在PCR反應(yīng)之前加入飽和染料，在PCR反應(yīng)之后進(jìn)行升溫變性，采集熒光信號(hào)，根據(jù)熔解曲線的不同即Tm值的不同來對樣品來進(jìn)行區(qū)分。而G-C突變和A-T突變Tm值差異非常小，采用HRM分析技術(shù)，區(qū)分突變尤為困難。本項(xiàng)發(fā)明針對HRM技術(shù)用于SNP檢測，采用一種全新的解決方案，尤其適用于G-C和A-T突變的檢測，采用多重特異性PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，能達(dá)到非常好的區(qū)分效果。
[0050]本發(fā)明的方法中，結(jié)合突變位點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)三條引物，其中包括兩條特異性擴(kuò)增引物(分別針對野生型和突變型)和一條公用引物，在其中一條特異性引物5’端人為引入一段無關(guān)序列，增加相應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度，從而有效提高產(chǎn)物的Tm值，增加兩種不同的型別(野生型和突變型)的區(qū)分能力。因?yàn)橐胍欢螣o關(guān)序列片段，增加了兩種不同擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值的差異，通過熔解曲線可以知道哪一種類型的PCR產(chǎn)物得到了有效擴(kuò)增，降低了對儀器硬件和軟件的要求。引物為特異性引物，特異性引物對應(yīng)的產(chǎn)物能夠有效擴(kuò)增，便說明存在相應(yīng)檢測類型，不能有效擴(kuò)增，則說明不存在相應(yīng)檢測類型，通過檢測結(jié)果能夠明確知道相應(yīng)型別是否存在。該方法可以明確判斷區(qū)分野生型，雜合型，突變型，對溫度控制沒有苛刻要求，采用這種設(shè)計(jì)方法進(jìn)行SNP分析，適用機(jī)型更廣，操作更加簡單，結(jié)果明確。
[0051]本發(fā)明的方法在一個(gè)反應(yīng)體系中即可實(shí)現(xiàn)SNP位點(diǎn)分析，野生型和突變型標(biāo)本檢測時(shí)，只生成單一的型特異性PCR產(chǎn)物，雜合標(biāo)本檢測時(shí)，生成兩種型特異性PCR產(chǎn)物。
[0052]一種引物及突變的設(shè)計(jì)如圖1所示。其中①②分別為野生型和突變型特異性引物，③④分別為野生型和突變型模板，⑤為突變型引物②中一段高GC含量的無關(guān)序列，⑥⑦分別是①②引物中設(shè)計(jì)引入的突變。結(jié)合SNP位點(diǎn)，引物和模板結(jié)合擴(kuò)增模式圖如圖2。
[0053]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0054]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0055]實(shí)施例序列相關(guān)信息[0056]野生型序列(SEQID NO:1)
[0057]tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc
[0058]ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa
[0059]acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggttt -S ca! gaccgggg acacagtgta
[0060]gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct
[0061]tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat
[0062]突變型序列(SEQID NO: 2)(突變 GCA — CCA)
[0063]tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc
[0064]ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa
[0065]acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggttt -c_ca； gaccgggg acacagtgta
[0066]gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct
[0067]tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat
[0068]檢測相關(guān)操作步驟 [0069]1、野生型樣本的制備
[0070]野生型樣本制備:直接從正常人外周血液中抽提人基因組DNA，經(jīng)測序驗(yàn)證，在待檢目標(biāo)區(qū)域無已知突變。正常人外周血DNA抽提步驟如下:
[0071 ] a.血液DNA抽提前，打開恒溫水浴槽，將溫度設(shè)定為70°C。
[0072]b.準(zhǔn)備血液DNA抽提時(shí)，將OB蛋白酶從_20°C冰箱取出來，置于室溫，解凍。
[0073]c.根據(jù)抽提標(biāo)本的數(shù)量(大約每個(gè)樣本250ul)，取出相應(yīng)數(shù)量DNA洗脫緩沖液置于70°C預(yù)熱。
[0074]d.取250ul標(biāo)本置于一干凈的小離心管，并做上標(biāo)記。
[0075]e.加入25ul的OB蛋白酶，振蕩均勻。加入250ul的XY緩沖液，劇烈振蕩10秒以使溶液和標(biāo)本混和均勻。
[0076]f.70°C水浴15min，水浴期間短時(shí)間內(nèi)顛倒混勻管子一次，如果抗凝血放置時(shí)間較長，建議延長水浴時(shí)間至30min。
[0077]g.加入260ul的無水乙醇，混勻。
[0078]h.把Mu-Pu基因組DNA分離柱置于一個(gè)2ml收集試管中(已提供)，將第五步得到的溶液轉(zhuǎn)入柱子中，1000Orpm離心2min，棄去該收集試管和流出液。
[0079]1.置柱子于另一收集試管，用700ul的乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌，1000Orpm再次離心2min，棄去該收集試管及流出液。
[0080]j.加入700ul的DNA洗滌緩沖液再洗滌一次并按上一步條件離心。棄去流出液。
[0081]k.用極速(12000rpm)離心4min以甩干柱子。
[0082]1.將柱子置于一 1.5ml滅菌離心管中，加入100ul70°C預(yù)熱的DNA洗脫緩沖液。將離心管置于室溫3min。
[0083]m.將柱子以1000Orpm離心5min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液，棄去柱子，洗脫 DNA。
[0084]η.將得到的DNA用HITCH分光光度儀檢測0D260、0D280數(shù)值，平行測量三次，計(jì)算檢測DNA濃度，純度檢定參考比值0D260/0D280為:1.5~2.0。
[0085]ο.將測定的濃度歸一化到IO4拷貝，進(jìn)行小量分裝，_20°C保存?zhèn)溆?。[0086]2、突變型樣本制備(突變參比品)
[0087]突變型標(biāo)本比較難以獲得，采用合成的方式，合成相應(yīng)片段，裝入pGEM-Teasy載體(Promega),轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，抗性LB培養(yǎng)基體外培養(yǎng),抽提質(zhì)粒并測序驗(yàn)證，得到的質(zhì)粒重新定量，并稀釋至IO5拷貝，IO4拷貝，并小量分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0088]3、雜合樣本制備(雜合參比品)
[0089]將歸一化至IO4拷貝的野生型DNA序列樣本和稀釋至IO4拷貝的突變DNA序列樣本等量混合，并小量分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0090]4、PCR 擴(kuò)增
[0091]4.1引物的工作液的配制
[0092]a.由于引物為很輕的干粉附在管壁上，打開極易散失，在打開管蓋前，將裝有待稀釋引物的離心管以15000rpm的轉(zhuǎn)速，離心5分鐘；
[0093]b.從離心機(jī)取出離心管后，小心打開管蓋，加入相應(yīng)體積的滅菌水(引物儲(chǔ)存液濃度IOOuM),然后將管蓋蓋緊；
[0094]c.將離心管置于渦旋儀漩渦振蕩30s，然后以15000rpm的轉(zhuǎn)速離心I分鐘，室溫靜置30分鐘；
[0095]d.將取出的引物液體稀釋，用分光光度儀檢測0D260、0D280數(shù)值，計(jì)算檢測引物。參照定量結(jié)果，取少量儲(chǔ)存 液稀釋至10uM。
[0096]4.2PCR反應(yīng)體系配制
[0097]雙引物反應(yīng)體系:

PCR 緩沖液(5 X，含 Mg2+) 4ul
dNTP(2mM)2.5ul
Evagreen(20x)1.5ul
PF (IOuM)0.5ul
[0098]PR (IOuM)0.5ul
Taq0.5ul
模板2.5ul
ddH20_IM
總25 u I
[0099]三引物反應(yīng)體系:

PCR 緩沖液(5X，含 Mg2+) 4ul
dNTP(2mM)2.5ul
[0100]

Evagreen(20><)?.5ul
PFl ( IOuM)0.5ul
【權(quán)利要求】
1.一種基于等位基因特異性擴(kuò)增的SNP檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以待測基因?yàn)槟０?，以針對SNP位點(diǎn)的特異性引物以及與特異性引物配對的公用引物為引物對，以Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 其中，所述的針對SNP位點(diǎn)的特異性引物包括針對野生型等位基因位點(diǎn)的引物I ;針對突變型等位基因位點(diǎn)的引物2，所述引物I和引物2具有如下序列: A-B-C ;其中，A為與模板匹配的序列片段，B為針對SNP位點(diǎn)的堿基；B在引物I和引物2中不同，在一條引物中B與野生型SNP位點(diǎn)堿基匹配，在另一引物中B與突變型SNP位點(diǎn)堿基匹配；C為無或?yàn)?-2個(gè)堿基的與模板匹配的序列片段； 且，引物I或引物2中一條引物的5’端還包括5-20個(gè)堿基的與野生型及突變型模板均不匹配的無關(guān)序列，使得引物I與引物2對應(yīng)的特異性PCR產(chǎn)物Tm值差異大于2V ； 所述的公用引物是遠(yuǎn)離SNP位點(diǎn)的引物，其與引物I或引物2構(gòu)成引物對； (2)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物I與公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度小于IOObp ;和/或所述的引物2與公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度小于lOObp。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物I和引物2中，以其3’末端堿基起算，第3-8個(gè)堿基處設(shè)置一與待測基因模板不匹配的堿基。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述特異性引物中，除了所限定的不匹配堿基外，其它堿基與待測基因模板中相應(yīng)堿基匹配。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，確定待測樣品中待測基因的SNP類型的方法如下: 如生成單一的型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為野生型基因或突變型基因； 如同時(shí)生成兩種型特異性PCR產(chǎn)物，則判斷為雜合型基因。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用熔解曲線分析的方法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，引物I和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物與引物2和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度差異顯著。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，引物I和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物與引物2和公用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度差異在2°C或以上。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物I或引物2的長度為10-60bp。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的公用引物的長度為10-60bp。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004823SQ201310062601
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月27日
【發(fā)明者】郭安亮, 姚見兒, 劉榴 申請人:上海透景生命科技有限公司