專利名稱：黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCOR14及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物生長和作物產(chǎn)量會受各種不利的環(huán)境條件嚴(yán)重影響，熱帶植物特別容易受到低溫的傷害。培育耐逆的植物品種是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。然而，植物耐逆性是一個(gè)數(shù)量性狀，涉及至少幾百個(gè)基因的作用，因此從耐逆性強(qiáng)的植物中分離耐性基因是十分必要的。黃花苜猜(Medicago sativa subsp.falcata)是一種非常耐寒的豆科牧草種質(zhì)，在寒冷的西伯利亞也有分布，從中克隆抗寒基因，能為轉(zhuǎn)基因育種提供更為優(yōu)良的目的基因，而且對于農(nóng)林植物抗逆分子育種尤為重要和迫切。黃花苜蓿在冷馴化中mRNA和蛋白發(fā)生變化(Chinnusamy et al.2007),除了對少數(shù)幾個(gè)冷馴化特異基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析夕卜(Mohapatra et al.1989, Wolfraim et al.1993),利用黃花苜猜分離抗寒基因的研究很少。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的首要目的是提供一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpC0R14。 本發(fā)明的另一目的在于提供編碼所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的基因。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpC0R14,其氨基酸序列如下所示:MATMLTSNTLFQTSNSFPNVPSLTLPKPSRVFLASNWRNASEGTKNTSLSWAYTSSSTKTRRYADGTAGKAGETVNAGIDDIKQFGQDADEKTKDAASSIADKAKENTDKTVEAVGSAGDKAKDYAFDANDKAKEAIGSATDKAKEGFEAATKNTQEAAGSATEALKNA⑶QAKEAVEGALDAAKDAVAGKE ；編碼所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的核苷酸序列如下所示:ATGGCAACAATGTTGACAAGTAACACACTCTTCCAAACCTCAAACTCATTCCCTAATGTCCCTTCACTCACCCTTCCTAAACCCTCCAGGGTCTTCTTAGCTTCCAACTGGAGAAATGCATCAGAAGGAACAAAAAACACTTCACTCAGTTGGGCTTACACTTCTTCTTCTACAAAGACAAGAAGATATGCAGATGGAACAGCCGGCAAAGCCGGAGAAACGGTGAACGCAGGCATAGATGACATCAAACAATTCGGACAAGATGCAGATGAAAAGACAAAGGACGCTGCGAGTTCAATTGCGGATAAAGCAAAAGAAAACACAGACAAGACTGTAGAGGCAGTAGGAAGTGCTGGAGACAAGGCAAAAGATTATGCTTTTGATGCAAATGACAAAGCCAAGGAAGCAATAGGTTCTGCTACTGATAAGGCAAAAGAAGGATTTGAGGCAGCAACGAAGAACACACAGGAGGCTGCTGGGTCAGCGACAGAGGCTCTGAAGAATGCAGGAGATCAGGCAAAGGAGGCGGTGGAAGGAGCGTTGGACGCGGCCAAGGATGCCGTGGCTGGGAAGGAGTAA ；上述黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH在促進(jìn)植物生長及提高植物抗寒性和抗強(qiáng)光能力中的應(yīng)用:該應(yīng)用包括用本發(fā)明的MfcpCORH基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成轉(zhuǎn)基因植株。所述的用本發(fā)明的MfcpCORH基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體；所述植物表達(dá)載體包括但不限于雙元農(nóng)桿菌載體以及用于單子葉基因槍轉(zhuǎn)化的載體；所述的雙元農(nóng)桿菌載體包括pBI121，pCAMBIA系列載體；所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段；使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可使用任何一種強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子；這些啟動子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子和泛素(Ubiqutin)啟動子，它可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動子結(jié)合使用；此外使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域包括但不限于ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以使多種不同的來源，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或來自結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，包括加入或替換植物可選擇性標(biāo)記?？墒褂玫倪x擇性標(biāo)記包括編碼抗除草劑的酶的基因或具有抗性的抗生素標(biāo)記物；所述的除草劑包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、慶大霉素等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可以不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。含有MfcpCORH基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化，顯微注射、電穿孔等各種常規(guī)或特異的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可以是雙子葉植物或單子葉植物。所述的MfcpCORH基因片段的獲得和植物表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟:(I)引物設(shè)計(jì)①M(fèi)fcpCORH 擴(kuò)增上游引物 RT81:CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCA ；②MfcpCORH 擴(kuò)增下游引物 RT82:CTTACTCCTTCCCAGCCACG ；③弓丨入BamH I 酶切位點(diǎn)的上游引物 pMDl:GATCGGATCCGAGGATCTACTAGTCATATGG ；④突變原有BamH I酶切位點(diǎn)，引入Xba I酶切位點(diǎn)的下游引物pMD2:GTGATCTAGAGCTCGGTACCCGGAAATCCGA ；(2) MfcpCORH基因片段的獲得:以黃花苜蓿(Medicago falcata)的cDNA為模板，使用引物①和引物②擴(kuò)增MfcpCORH基因片段，并連接進(jìn)入pMD20-T載體中，構(gòu)建獲得pMD_MfcpC0R14載體；

(3)植物表達(dá)載體pBI_MfcpC0R14的構(gòu)建以pMD20-MfcpC0R14載體為模板，使用引物③和引物④使MfcpCORH基因片段引Λ Xba I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pBI_MfcpC0R14 ；所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因煙草；所述的轉(zhuǎn)基因煙草的獲得，包括以下的步驟:(I)用電轉(zhuǎn)的方法將pBI_MfcpC0R14導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含表達(dá)載體pBI_MfcpC0R14農(nóng)桿菌陽性菌落；(2)將活化的含有表達(dá)載體pB1-MfcpC0R14的農(nóng)桿菌EHA105浸染煙草無菌苗葉
盤，經(jīng)共培養(yǎng)和抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)基因煙草。發(fā)明人從黃花苜蓿中克隆了一個(gè)新基因的cDNA序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫查不到與它同源性高的蛋白序列；該基因表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，而且它翻譯的蛋白預(yù)測定位于葉綠體基質(zhì)，成熟蛋白分子大小為14kDa,故將其命名為葉綠體冷響應(yīng)蛋白14 (chloroplastic coldresponsivel4kDa protein),基因名 MfcpC0R14。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:發(fā)明人已從黃花苜蓿中克隆了葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的cDNA序列MfcpCORHt5Mf cpC0R14基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，構(gòu)建了適合于雙子葉植物的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化雙子葉模式植物煙草，轉(zhuǎn)基因植株的生長優(yōu)于野生型植株，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株明顯提高了抗寒性和抗強(qiáng)光能力。


圖1是植物表達(dá)載體pBI_Mfc pC0R14的示意圖。圖2是本發(fā)明所述MfcpCORH基因開放閱讀框序列的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子；1是MfcpCORH基因的擴(kuò)增片段。圖3是MfcpCORH基因的植物表達(dá)載體的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子；1-8是陽性重組子；9是pMD-MfcpC0R14載體，為陽性對照；10是陰性對照。圖4是低溫誘導(dǎo)MfcpCORH基因表達(dá)的特征柱狀圖；柱上方的字母a、b和c表示不同處理之間的差異顯著(P ( 0.05)，即數(shù)據(jù)柱上方字母相同時(shí)表示沒有顯著差異，數(shù)據(jù)柱上方字母不同時(shí)表示存在顯著差異。圖5是導(dǎo)入MfcpCORH基因的轉(zhuǎn)基因煙草PCR鑒定結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子；W表示野生型煙草；6-3、11-2、13-2表示不同的轉(zhuǎn)MfcpCORH基因煙草。圖6是導(dǎo)入MfcpCORH基因的轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交和Northern雜交鑒定，其中，W表示野生型；6-3、11-2、13-2表示不同的轉(zhuǎn)MfcpCORH基因煙草；圖(a)是Southern雜交，圖(b)是Northern雜交。圖7是導(dǎo)入MfcpCORH基因的轉(zhuǎn)基因煙草的Western雜交鑒定，其中，W表示野生型；6-3、11-2、13-2表示不同的轉(zhuǎn)MfcpCORH基因煙草。圖8是導(dǎo)入MfcpCORH基因的轉(zhuǎn)基因煙草生長測定，其中，W表示野生型煙草；6-3、11-2、13-2表示不同的轉(zhuǎn)MfcpCORH基因煙草；圖(8)是4、5、6周齡苗地上部鮮重，圖(b)是4、5、6周齡苗根部鮮重，圖(c)是4、5、6周齡苗整株鮮重，圖(d)是10、14周齡苗地上部鮮重，圖(e)是10、14周齡苗根部鮮重，圖(f )是10、14周齡苗整株鮮重，圖(g)4、5、6、10、14周齡苗生長狀況；柱上方的字母a、b、c、d和e表示不同處理之間的差異顯著(PS0.05)，即數(shù)據(jù)柱上方字母相同時(shí)表示沒有顯著差異，數(shù)據(jù)柱上方字母不同時(shí)表示存在顯著差異。
圖9是導(dǎo)入MfcpCORH基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性和抗強(qiáng)光分析，其中，W表示野生型煙草；6-3、11-2、13-2表示不同的轉(zhuǎn)MfcpCORH基因煙草；圖(a)是冷處理(3°C)的凈光合速率，圖(b)是凍處理(_4°C 3小時(shí))的相對電導(dǎo)率及各株系照片，圖(c)是凍處理(系列零下低溫)的相對電導(dǎo)率，圖(d)是強(qiáng)光(1200 μ mo I.m 2S O處理的相對電導(dǎo)率，圖(e)是強(qiáng)光(1200 μ mo I.mH處理的最大光化學(xué)效率Fv/Fm ;柱上方的字母a、b、C、d、e、f、g和h表示不同處理之間的差異顯著(P ( 0.05)，即數(shù)據(jù)柱上方字母相同時(shí)表示沒有顯著差異，數(shù)據(jù)柱上方字母不同時(shí)表示存在顯著差異。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。黃花苜蓿或黃花苜蓿種子:品種為呼倫貝爾，中國農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)資源庫。大腸桿菌(Escherichia coli) DHlOB:購自上海超研生物科技有限公司。pBI121表達(dá)載體:購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105:購自北京天恩澤基因科技有限公司。煙草或煙草(Nicotiana tabacum L.)種子:品種為中煙90,廣東省農(nóng)科院作物研究所。實(shí)施例1MfcpCORH的克隆

一、黃花苜蓿cDNA模板制備將黃花苜蓿(Medicago falcata)種子用60°C熱水浸泡5分鐘，于28°C黑暗條件下催芽，當(dāng)種子露白時(shí)，點(diǎn)播于盛有泥土的塑料盆(直徑15cm)中，于溫室內(nèi)培養(yǎng)，自然光照，溫度25-28°C。將苗齡8-10周的黃花苜蓿植株放入溫度為5°C的人工氣候箱(光照強(qiáng)度為200 μ mol -H1-2S-1)內(nèi)，光/暗周期為12小時(shí)光照，進(jìn)行5°C低溫處理，連續(xù)處理2天。取黃化苜蓿的成熟葉片，用TRE-Trizol方法提取總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega公司)反轉(zhuǎn)錄獲得反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA作為模板，_20°C保存?zhèn)溆?。二、設(shè)計(jì)擴(kuò)增MfcpCORH基因引物根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的黃花苜蓿冷誘導(dǎo)基因cDNA縮減文庫中發(fā)現(xiàn)的MfcpCORH基因cDNA片段的序列(ES323281)，在NCBI上進(jìn)行BLASTX比對，并下載相應(yīng)核苷酸序列一致性最高的序列，蒺藜苜蓿MTR2g014050。根據(jù)MfcpCORH基因cDNA片段的序列相應(yīng)于蒺藜苜蓿MTR2g014050開放閱讀框兩端的區(qū)域設(shè)計(jì)引物:MfcpCORH 擴(kuò)增上游引物 RT81:CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCA ；MfcpCORH 擴(kuò)增下游引物 RT82:CTTACTCCTTCCCAGCCACG ；三、擴(kuò)增獲得MfcpCORH基因并構(gòu)建載體用上述步驟一制備的模板和步驟二設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μ L):Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司，5U.μ O0.1 μ L，10XExTaq DNA 聚合酶緩沖液 2.5 μ L，dNTPs (IOmmol.171 )0.25 μ L，上游引物 RT81 (10 μ mo 1.171)0.8μ L，下游引物 RT82(10ymol.00.8 μ L，反轉(zhuǎn)錄第一鏈 cDNAl μ L，ddH20補(bǔ)足至 25 μ L。
PCR 反應(yīng)程序:94°C 3 分鐘；94°C 20 秒，57°C 30 秒，68°C 40 秒，35 個(gè)循環(huán)；68°C 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物以I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖2)。獲得與預(yù)期片段長度(605bp) —致的PCR片段(圖2)。將獲得的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒(東盛公司)回收后，用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將PCR回收片段與線性PMD20-T載體(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下:1 μ L10XT4連接酶緩沖液，PCR回收片段150ng, IuL T4DNA連接酶，1.5μ L線性pMD20-T載體(IOmmol.L—1)，加無菌水至總體積為10 μ L，16°C連接過夜。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:用接種環(huán)取保存于_70°C超低溫冰箱的大腸桿菌DHlOB菌液，在SOB固體培養(yǎng)基上劃板，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；挑取大腸桿菌DHlOB單菌落接種于ImL的SOB液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)6小時(shí)，接種于200mL SOB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)至OD55tl = 0.8。以2500rpm離心10分鐘收集菌體，加入預(yù)冷的10%甘油洗滌，離心收集細(xì)菌。重復(fù)用10%甘油洗滌，離心收集細(xì)菌。最后將細(xì)菌分裝，于_70°C保存?zhèn)溆谩＿B接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌:取20 μ L大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞至電擊杯(孔徑2mm)，加入14 1連接產(chǎn)物，用電擊儀(1^(^0 111861'，810-狀0公司)電擊轉(zhuǎn)化。電擊參數(shù)為:電阻200 Ω，1800V, 25 μ F。電擊后的菌體轉(zhuǎn)入ImL SOC液體中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。取100 μ L菌液涂布于含24mg.T1IPTG和40mg.L^X-gal的LB固體(含IOOmg.Γ1氨芐青霉素)培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)過夜。重組質(zhì)粒pMD_MfcpC0R14的篩選、純化及測序:呈藍(lán)斑的菌落不含插入片段,僅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR檢測。挑取PCR陽性菌落，接種于ImL含IOOmg噸―1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)5小時(shí)，以RT81/RT82為引物做菌液PCR檢測。吸取5 μ L陽性菌液，接種于3mL含IOOmg.L—1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。用堿裂解法抽提質(zhì)粒，4°C保存?zhèn)溆?。純化的重組質(zhì)粒命名為pMD-M fcpC0R14，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果反向互補(bǔ)鏈如下:CACAAACTCGAAAAACTTAAGAACCATGGCAACAATGTTGACAAGTAACACACTCTTCCAAACCTCAAACTCATTCCCTAATGTCCCTTCACTCACCCTTCCTAAACCCTCCAGGGTCTTCTTAGCTTCCAACTGGAGAAATGCATCAGAAGGAACAAAAAACACTTCACTCAGTTGGGCTTACACTTCTTCTTCTACAAAGACAAGAAGATATGCAGATGGAACAGCCGGCAAAGCCGGAGAAACGGTGAACGCAGGCATAGATGACATCAAACAATTCGGACAAGATGCAGATGAAAAGACAAAGGACGCTGCGAGTTCAATTGCGGATAAAGCAAAAGAAAACACAGACAAGACTGTAGAGGCAGTAGGAAGTGCTGGAGACAAGGCAAAAGATTATGCTTTTGATGCAAATGACAAAGCCAAGGAAGCAATAGGTTCTGCTACTGATAAGGCAAAAGAAGGATTTGAGGCAGCAACGAAGAACACACAGGAGGCTGCTGGGTCAGCGACAGAGGCTCTGAAGAATGCAGGAGATCAGGCAAAGGAGGCGGTGGAAGGAGCGTTGGACGCGGCCAAGGATGCCGTGGCTGGGAAGGAGTAAG測序結(jié)果與cDNA縮減文庫中MfcpCORH基因cDNA片段的序列(ES323281)進(jìn)行比對，證明所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為MfcpCORH基因，并且測序結(jié)果顯示MfcpCORH基因反向連接到PMD20-T上。用0miga2.0軟件分析所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列，獲得了 MfcpCORH基因的開放閱讀框架(ORF)序列，如上述測序序列中下劃線標(biāo)注部分。編碼所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的基因由605個(gè)堿基組成，其中MfcpCORH的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(Sequence coding for amino acids in protein,CDs)由 26 位 604 位的 579 個(gè)喊基組成，編碼192個(gè)氨基酸。用ChloroP分析軟件預(yù)測MfcpCORH所編碼的蛋白具有55個(gè)氨基酸的葉綠體信號肽，對應(yīng)上述測序結(jié)果反向互補(bǔ)鏈的26位 190位堿基，葉綠體信號肽加工后預(yù)測的成熟蛋白分子大小為14kDa。實(shí)施例2MfcpC0R14基因的植物表達(dá)載體(pBI_MfcpC0R14)構(gòu)建由于MfcpCORH基因反向連接在pMD20_T載體上的，根據(jù)pMD20_T載體插入位點(diǎn)兩翼序列，設(shè)計(jì)帶有BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物:引入BamH I 酶切位點(diǎn)的上游引物 pMDl:GATCGGATCCGAGGATCTACTAGTCATATGG ；突變原有BamH I酶切位點(diǎn)，引入Xba I酶切位點(diǎn)的下游引物pMD2:GTGATCTAGAGCTCGGTACCCGGAAATCCGA ；以實(shí)施例1中構(gòu)建的克隆載體pMD-MfcpC0R14為模板，以pMDl和pMD2為上下游引物，進(jìn)行MfcpCORH基因PCR擴(kuò)增，純化回收擴(kuò)增獲得的MfcpCORH基因片段。將上述回收獲得的MfcpCORH基因片段和pBI121表達(dá)載體分別用限制性內(nèi)切酶Xba I (TaKaRa公司)和BamH I (TaKaRa公司)雙酶切，分別回收MfcpCORH基因目的片段和酶切后PBI121載體大片段，用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)連接后，將MfcpCORH基因插入到表達(dá)質(zhì)粒pBI121CaMV35S啟動子下游多克隆位點(diǎn)的Xba I和BamH I之間，構(gòu)建獲得重組表達(dá)載體，命名為pB1-MfcpC0R14。分別以RT81/RT82和pBI121載體CaMV35S序列上游引物ZG13 (CTCGGATTCCATTGCCCAGCT) /RT82為引物進(jìn)行菌液PCR檢測，證明獲得了重組子(圖3)。進(jìn)一步對插入片段測序，結(jié)果表明，插入片段的序列與MfcpCORH編碼區(qū)的序列完全一致，并且插入片段兩端的酶切位點(diǎn)也完全正確，從而證明構(gòu)建成了 pB1-MfcpC0R14表達(dá)載體，pB1-MfcpC0R14表達(dá)載體的示意圖如圖1。實(shí)施例3Mfcp C0R14受低溫誘導(dǎo)的表達(dá)情況一、獲得低溫條件下的黃花苜蓿模板將苗齡8-10周的黃花苜蓿植株放入溫度為5 °C的人工氣候箱(200 μ mo I.πΓΥ1)內(nèi)，光照和黑暗時(shí)間均設(shè)為12小時(shí)光照。連續(xù)處理4天，進(jìn)行5°C低溫處理。分別取低溫處理011、1211、2411、4811、9611的成熟葉片，加入液氮磨碎樣品，用了1 -1^201試劑提取葉片的總RNA,用PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄獲得反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為cDNA模板，_20°C保存?zhèn)溆谩６⒃O(shè)計(jì)特異檢測引物根據(jù)MfcpC0R14基因cDNA序列和截型首猜Actin(MTR3g095530)的序列，用BeaconDesigner7.0軟件設(shè)計(jì)出檢測用定量引物:MfcpCORH 基因的上游定量引物 ZG1861:ACGCAGGCATAGATGACAT ；MfcpC0R14 基因的下游定量引物 ZG1862:CAGAACCTATTGCTTCCTTGG ；Actin 基因的上游定量引物 ZG1613:ATTCACGAGACCACCTAC ；Actin 基因的下游定量引物 ZG1614:GAGCCACAACCTTAATCTTC 三、定量PCR檢測表達(dá)差異將實(shí)施例3中步驟一制備的模板cDNA稀釋到15ng.μ L—1用于定量PCR的模板。反應(yīng)體系為 10μ L:SYBR Premix Ex Taq (2X ) 5 μ L，上游和下游引物(10 μ mol.L—1)各0.5yL，cDNA模板lyL，無菌水3yL。使用儀器為Bio-Rad公司生產(chǎn)的Mini OptionReal-Time PCR System，PCR 反應(yīng)條件設(shè)置為:95°C 10 秒；94°C 5 秒，57°C 25 秒，40 個(gè)循環(huán)。以不加cDNA模板作為陰性對照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以Actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線分析，PCR擴(kuò)增效率在95%以上。利用Bio-Rad CFX Manager (versionl.6)軟件自動計(jì)算基因的相對表達(dá)量。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示，MfcpCORH表達(dá)在低溫處理12小時(shí)明顯受到誘導(dǎo)，在低溫處理48小時(shí)和96小時(shí)，表達(dá)量一直維持在最高水平(圖4)。結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)MfcpCORH基因的表達(dá)。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因煙草的產(chǎn)生及分子檢測一、轉(zhuǎn)基因煙草的產(chǎn)生農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:用接種環(huán)取保存于_70°C超低溫冰箱的根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105菌液在YEB平板上劃線，28°C培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落，接種于50mL液體SOB中，28 °C培養(yǎng)過夜，吸取0.5mL菌液，接種于500mL液體SOB中，28°C培養(yǎng)8小時(shí)，至0D_為0.6，冰浴冷卻10分鐘，倒入經(jīng)滅菌的200mL離心管中，平衡后4°C，4000rpm，離心10分鐘，收集菌體，倒去S0B，倒置于紙巾上，控干水分，加入50mL10%甘油，于冰上搖動，懸浮菌體，4°C，4000rpm，離心15分鐘,收集菌體,棄10%甘油，重復(fù)洗滌一次，加入2mL10%甘油，懸浮菌體，分裝，20 μ L/管，加液氮速凍后于_70°C冰箱保存。質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌:將I μ L pBI_MfcpC0R14質(zhì)粒(20ng.μ Γ1)加至20 μ L解凍的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻，冰浴90秒后，轉(zhuǎn)移至電擊杯(孔徑2_)中，置于電擊儀(MicroPulser, Bio-RAD公司)的電極間，選定程序Agr,進(jìn)行電擊。電擊結(jié)束后,迅速將ImL YEB液體培養(yǎng)基倒入電擊杯，再用移液槍轉(zhuǎn)移至搖菌管中，28°C輕柔振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。吸取0.3mL菌液，涂布在YEB平板(含35mg -Γ1的氯霉素和50mg -Γ1的卡那霉素)上。28°C培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)36小時(shí)。陽性菌落的鑒定:挑取平板上的單菌落，分別以RT81/RT82和pBI 121載體CaMV35S序列上游引物ZG13 (CTCGGATTCCATTGCCCAGCT) /RT82為引物進(jìn)行菌液PCR檢測。進(jìn)一步吸取PCR陽性菌液至3mL YEB液體培養(yǎng)基(含35mg -Γ1的氯霉素和50mg -Γ1的卡那霉素)中，28°C振蕩培養(yǎng)36小時(shí)。取2mL菌液用堿裂解法抽提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Xba I(TaKaRa公司)和BamH I (TaKaRa公司)進(jìn)行酶切檢測，確定陽性克隆中含有植物表達(dá)載體pB1-MfcpC0R14。取0.8mL農(nóng)桿菌液，加0.2mL80%甘油，混勻后保存于_70°C超低溫冰箱備用。農(nóng)桿菌的活化與懸浮:取含有表達(dá)載體pB1-MfcpC0R14的農(nóng)桿菌EHA105貯存液，在YEB平板(含35mg.Γ1的氯霉素和50mg.Γ1的卡那霉素)上劃線，28°C培養(yǎng)。挑分離良好的單菌落，接種于2mL液體YEB (含35mg *L_1的氯霉素和50mg *L_1的卡那霉素)中，28°C振蕩暗培養(yǎng)24小時(shí)。吸取菌液50 μ L，涂布于YEB平板(含35mg.L—1的氯霉素和50mg.L—1的卡那霉素)上，28°C倒置暗培養(yǎng)36小時(shí)。將新長出的農(nóng)桿菌刮下來，用MS液體培養(yǎng)基懸浮稀釋，使OD6tltl為0.8，制成農(nóng)桿菌菌液。轉(zhuǎn)基因煙草的產(chǎn)生:煙草(Nicotiana tabacum L.)種子經(jīng)70%的酒精和2%次氯酸鈉消毒后，接種于MS培養(yǎng)基上，28°C光照培養(yǎng)約I個(gè)月。待展開5-7片真葉時(shí)，即可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。取煙草無菌苗的葉片，用剪刀剪成Icm2大小的葉盤，并用尖嘴鑷子在表面戳小孔，制造傷口，轉(zhuǎn)入上述制備的農(nóng)桿菌菌液中浸泡，其間不時(shí)搖勻。浸泡15分鐘后，用無菌吸水紙吸去葉盤表面多余菌液，稍吹干，置于墊了濾紙的共培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基添加0.1mg.Γ1萘乙酸和Img.Γ1芐基腺嘌呤，ρΗ5.8)上，28°C黑暗共培養(yǎng)2天。將經(jīng)過共培養(yǎng)的材料轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基添加0.1mg.Γ1萘乙酸，Img.Γ1芐基腺嘌呤，250mg.Γ1頭孢霉素和IOOmg.Γ1卡那霉素，pH5.8)，28°C光照培養(yǎng)。20天繼代一次。將成功分化的苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基添加250mg.Γ1頭孢霉素和IOOmg.Γ1卡那霉素，pH5.8)上生根，待長出5-7片真葉時(shí)，開瓶煉苗，移栽到土中。轉(zhuǎn)基因煙草的生長:將移栽的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗培養(yǎng)在溫室內(nèi)，初期給予一定的遮陰，存活后的幼苗逐漸轉(zhuǎn)移到自然光照下生長。在生長過程中，定期澆水、施肥。采用自交收種，即在花瓣張開前，對花序套袋；在果實(shí)形成后，再除去套袋。果實(shí)成熟后收種，即獲得轉(zhuǎn)基因煙草種子。二、轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測微量法快速提取DNA:用1.5mL離心管蓋取轉(zhuǎn)基因煙草及其野生型植株的葉圓片，加入 400 μ L 預(yù)熱至Ij 800C 的提取液(200mmol.L^1Tris-HCl ρΗ8.0,250mmol.L-1NaCl,25mmol.PEDTA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的SDS)，用小研錘在1.5mL離心管中充分研磨，70°C干熱浴10分鐘后，移到冰浴放置2分鐘。13000rpm離心I分鐘，取300 μ L上清液至新的離心管中，加等量異丙醇，混勻，室溫靜置5分鐘。13000rpm離心2分鐘，棄凈上清液，將DNA沉淀風(fēng)干后溶于 50 μ L TE 溶液(Imol.L-1NaCl, IOmmol.L^1Tris-HCl ρΗ8.0, Immol.L-1EDTA),保存于_20°C，備用。PCR檢測:根據(jù)pBI121載體上CaMV35S啟動子序列設(shè)計(jì)上游引物:pBI121載體CaMV35S 序列上游引物 ZG13:CTCGGATTCCATTGCCCAGCT ；與MfcpCORH擴(kuò)增下游引物RT82配對。以上述微量法快速提取的DNA為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20μ L)為:Taq DNA 聚合酶 0.1 μ L，IOX buff er2 μ L，dNTPs(IOmmol.171 )0.25 μ L，上游引物 ZG13 和下游引物 RT82(10ymol O各 0.5 μ L, DNAl μ L,ddH20 補(bǔ)足至 20 μ L。PCR 反應(yīng)程序:94°C 3 分鐘；94°C 20 秒，55°C 30 秒，72°C 40 秒，35 個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘。以I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。三、轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交和Northern雜交基因組DNA的提取:采用CTAB法提取DNA，具體方法如下:取Ig煙草(野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草)葉片，用液氮快速研磨成粉末，加入4mL預(yù)熱到70°C的1.5 X CTAB提取液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.5% 的 CTAB,75mmol.L-1Tris-HCl ρΗ8.0, Imol.L-1NaCl, 15mmol.L-1EDTA),研磨成漿后轉(zhuǎn)移至50mL離心管，再用3mLl.5 X CTAB提取液洗凈研缽，轉(zhuǎn)至50mL離心管，混勻。65°C水浴I小時(shí)，間斷混勻。水浴結(jié)束后，加入5mL氯仿，旋緊管蓋，上下顛倒混勻10分鐘，5000rpm離心15分鐘。小心吸取上清至新的50mL離心管,并記錄體積,加入1/10體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的CTAB溶液，搖勻。加入4/5體積的氯仿，上下顛倒混勻10分鐘。5000rpm離心15分鐘。小心吸取上清至50mL離心管，并記錄體積，加入等量的沉淀液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% CTAB，50mmol.T1Tris-HCl ρΗ8.0, IOmmol.I^EDTA)，輕柔上下顛倒混勻，室溫放置 15分鐘，沉淀DNA。5000rpm離心10分鐘，小心倒掉上清，用移液槍吸盡上清。向沉淀加入2mL高鹽 TE (Imol.L 1NaCl, 10mmol.L 1Tris-HCl pH8.0, Immol.L 1EDTA)和 5 μ LlOmg.mL 1的 RNAase (用 IOmmol.L 1Tris-HCl pH7.5 和 15mmol.L 1NaCl 溶液配制，經(jīng)過 IOCTC水浴15分鐘滅活DNA酶)，在55°C搖床中輕搖至沉淀完全溶解(30-40分鐘)。加入2倍體積的無水乙醇，輕柔地上下顛倒混勻。用槍頭鉤出絮狀DNA，在70%乙醇中漂洗，然后移至1.5mL離心管。短暫離心，吸盡上清，適當(dāng)風(fēng)干沉淀，用0.1-0.2mL TE (IOmmol.L^1Tris-HCl pH8.0,lmmol.L-1EDTA)溶解沉淀。取2 μ L稀釋10倍的DNA溶液，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的質(zhì)量,測OD26tlnm和OD28tlnm,確定DNA的純度和濃度。總RNA的提取:取0.1g煙草(野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草)葉片，用液氮快速研磨成粉末，用TRE-Trizol試劑提取葉片的總RNA，并確定總RNA的濃度與純度?；蚪MDNA的酶切和轉(zhuǎn)膜:取15 μ g基因組DNA，加入用無菌的去離子水至總體積33yL,2uL EcoRI(或者XbaI )，4 μ LlOX酶切緩沖液，37°C酶切過夜。加入點(diǎn)樣緩沖液，點(diǎn)樣到0.8%瓊脂糖凝膠，以4V.CnT1電泳5小時(shí)，直至指示染料溴酚蘭泳至凝膠長度2/3距離處。用毛細(xì)管法將DNA轉(zhuǎn)移至Hybond XL尼龍膜(Amersham)上。具體方法如下:將膠平放在用NaOH浸透的濾紙上，濾紙兩端浸入轉(zhuǎn)移池的0.4mol.T1NaOH溶液中。蓋上尼龍膜后用保鮮膜封起尼龍膜的四周，以防轉(zhuǎn)移系統(tǒng)短路。蓋上濾紙，并趕氣泡，鋪上約7cm厚的吸水紙，并壓上200g的重物，持續(xù)轉(zhuǎn)膜16小時(shí)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，用2XSSC (300mmol.L—1氯化鈉，30mmol -T1檸檬酸鈉，pH7.0)簡單漂洗后，再用煮沸的0.5X SSC (含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%SDS)溶液浸泡幾分鐘。自然風(fēng)干5分鐘，用保鮮膜包好，做好標(biāo)記，保存于4°C備用?？俁NA的變性電泳和轉(zhuǎn)膜:用常規(guī)的甲醛變性電泳法將不同大小的RNA分子分離開，用毛細(xì)管法轉(zhuǎn)到Hybond N+尼龍膜(Amersham)上。具體如下:稱取1.2g瓊脂糖,加熱溶于85mL DEPC處理過的水中，冷卻后加入IOmLlO XMOPS溶液，5mL37%甲醛，4 μ L GoldView充分混勻后，制備成1.2%的甲醛變性凝膠。取30μ g RNA樣品，依次加入2 μ LlO X MOPS溶液，2.5 μ L37%甲醛，7.5 μ L甲酰胺，加DEPC處理水，使得總體積至50 μ L，混勻后于65°C保溫10分鐘，使RNA變性。然后置于冰上冷卻5分鐘，加入電泳載樣緩沖液。將各個(gè)變性的RNA樣品上樣至變性凝膠上，以4V.cm-1電泳3h，直至指示染料溴酚蘭泳至凝膠長度2/3距離處。電泳結(jié)束后，用無菌去離子水洗凝膠兩次，每次10分鐘，再用IOXSSC溶液洗10分鐘。將凝膠平放在轉(zhuǎn)移橋的濾紙上，趕走 氣泡。將一張大小與凝膠相近的Hybond N+(Amersham)尼龍膜鋪在膠上，趕氣泡。在尼龍膜上鋪2張與尼龍膜大小一樣并用IOXSSC充分潤濕的濾紙，用保鮮膜封起尼龍膜的四周，以防轉(zhuǎn)移系統(tǒng)短路。在濾紙上鋪上約7cm厚的吸水紙，并壓上200g的重物，持續(xù)轉(zhuǎn)膜16小時(shí)。完成RNA轉(zhuǎn)移后，將尼龍膜放置2XSSC濕潤的濾紙上，置于紫外交聯(lián)儀內(nèi)將有RNA的面朝上進(jìn)行紫外交聯(lián)，采用的紫外光總能量為800kJ。再將尼龍膜放在DEPC處理水中漂洗，自然風(fēng)干5分鐘，用保鮮膜包好，做好標(biāo)記，保存于4°C備用。探針標(biāo)記:以實(shí)施例1步驟中克隆獲得的MfcpCORH片段(即以引物對RT81和RT82和模板黃花苜蓿cDNA獲得的PCR產(chǎn)物)50ng (25 μ L反應(yīng)體系)作為探針標(biāo)記的模板，采用Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0 (TaKaRa)參照說明書的方法來標(biāo)記探針。每25 μ L反應(yīng)體系含5 μ L[ a -32P] dCTP同位素(北京福瑞公司)進(jìn)行標(biāo)記,反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積的0.8mol.L4NaOH溶液，使探針分子變性，用于雜交分析。雜交:將尼龍膜放入雜交管中，加入適量預(yù)雜交液(每Icm2膜面積加入0.1mL預(yù)雜交液)，42°C預(yù)雜交4小時(shí)，把標(biāo)記好的探針加入雜交管中，42°C雜交16小時(shí)。雜交完畢，倒出雜交液，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5%SDS 的 2 X SSPE (300mmol.LlaC I, 2 Ommo I.L^1Na2HPO4,2mmol.L^iEDTA, pH7.4)在42 °C和65 V各洗一次，每次15分鐘，第三次用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)
0.2%SDS的0.2X SSPE在65V洗15分鐘。洗膜結(jié)束后，用計(jì)數(shù)器檢測放射性強(qiáng)度，用保鮮膜包膜，壓膜顯影I天后，用FX自動成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)掃描分析雜交結(jié)果。采用PCR法檢測(使用引物對ZG13和RT82)轉(zhuǎn)基因煙草，陽性植株能擴(kuò)增出900bp左右的特異帶，而野生型對照植物不能擴(kuò)出該特異帶(圖5)，證明MfcpC0R14基因已導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因煙草中。Southern雜交結(jié)果顯示(如圖6a)，在野生型煙草中沒有MfcpCORH基因的特異雜交信號，轉(zhuǎn)基因煙草植株中有MfcpCORH基因的特異雜交信號，表明MfcpCORH基因已整合到轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中。Northern雜交結(jié)果顯示(如圖6b)，在野生型煙草中沒有MfCPCORH基因的特異雜交信號，轉(zhuǎn)基因煙草中有MfCPCORH基因的特異雜交信號，表明MfCPCORH基因能在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)。四、轉(zhuǎn)基因煙草的Western雜交多克隆抗體的制備:以由MfcpCORH蛋白57位 156位的100個(gè)氨基酸的肽段為抗原，將對應(yīng)實(shí)施例1中測序結(jié)果反向互補(bǔ)鏈的194位 493位堿基重組肽段純化并免疫兔子，經(jīng)過4次免疫后取全血純化，獲得MfcpCORH多克隆抗體(由艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司制備)?？偟鞍椎奶崛?取0.1g煙草(野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草)葉片，用液氮快速研磨成粉末，用 0.1mL RIPA 蛋白抽提液(1 SOmmoI.L 1NaCl, 5OmmoI.L 1Tris, SmmoI.L 1EDTA,1%ΝΡ-40，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%脫氧膽酸鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.l%SDS，pH7.5)提取葉片的總蛋白，并用考馬斯亮藍(lán)法(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%考馬斯亮藍(lán)G250，5%乙醇，10%磷酸)于595nm波長下測定蛋白含量。

總蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)移:用常規(guī)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法將不同大小的蛋白分離開，用水浴式電轉(zhuǎn)移到BioTraCeTMNT尼龍膜(Pall)上。具體如下:使用Min1-PROTEAN# system Casting stand凝膠模具配制15%丙烯酰胺分離膠和5%丙烯酰胺濃縮膠。取100 μ g蛋白樣品，加入10 μ L樣品緩沖液(0.5mmol.L^lTris-HClpH6.8，25%甘油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%SDS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%溴酚藍(lán)，5%巰基乙醇)，加雙蒸水使得總體積至20 μ L，混勻后于95°C保溫5分鐘，使蛋白變性。然后冷卻至室溫，12000rpm離心10分鐘以去除可能干擾電泳的不溶物。將各個(gè)變性的蛋白樣品上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠，先在70V恒壓下電泳至溴酚藍(lán)染料從濃縮膠進(jìn)入分離膠，再以100V恒壓繼續(xù)電泳至溴酹藍(lán)遷移至分離膠底部。取出凝膠于轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmol.L^1Tris, 192mmol.L—1甘氨酸，20%甲醇)平衡20分鐘，剪I張大小與凝膠相近的BioTraCeTMNT尼龍膜(Pall)在轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡15分鐘。濕潤海綿墊及大小與凝膠相近的濾紙后，在轉(zhuǎn)移夾依次鋪放海綿墊、濾紙、凝膠、尼龍膜、濾紙、海綿墊，關(guān)上轉(zhuǎn)移夾，放入轉(zhuǎn)移槽中在冷卻條件下200mA恒流電轉(zhuǎn)2小時(shí)。免疫檢測:電轉(zhuǎn)移后取出尼龍膜，將尼龍膜置于封閉液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉，0.05%Tween20, 20mmol.L^1Tris, 500mmo I.L-1NaCl, ρΗ7.5)室溫?fù)u蕩封閉 I 小時(shí)后，轉(zhuǎn)至以 TBST (0.05%Tween20, 20mmol.L^1Tris, 500mmoI.L-1NaCl, ρΗ7.5) 1:500 稀釋的MfcpCORH多克隆抗體中，室溫振搖2小時(shí)。用TBST洗5次，每次振搖5分鐘后，轉(zhuǎn)至以TBST (0.05%Tween20, 20mmol.L^1Tris, 500mmoI.L-1NaCl, ρΗ7.5) 1:10000 稀釋的辣根過氧化物酶共軛的羊抗兔IgG 二抗(Kirkegaard and Perry Laboratories)中，室溫振搖1.5小時(shí)。用TBST洗5次,每次振搖5分鐘后，使用化學(xué)發(fā)光底物SuperSingaP West PicoChemiluminescent Substrate (Thermo)反應(yīng) 5 分鐘后壓 X-膠片曝光顯影。Western雜交結(jié)果見圖7，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草6-3，11-2, 13-2中MfcpCORH蛋白表達(dá)，對應(yīng)的野生型植株W沒有MfcpCORH表達(dá)。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因煙草的生長、抗寒性和抗強(qiáng)光鑒定一、生長測定將轉(zhuǎn)基因煙草及其野生型種子播種在盛有泥土的塑料盆(直徑15cm)中，于溫室內(nèi)覆膜培養(yǎng)，自然光照，溫度25-30°C。I周后將煙草幼苗移栽到盛有泥土的育苗盆(每格邊長6cm)中，每格I株,于溫室內(nèi)培養(yǎng)，自然光照，溫度25-30°C。分別于4、5、6周苗齡時(shí),小心地將植株取出，將泥土洗干凈，擦干后分別稱量每株地上部、地下部及整株重量。同時(shí)，播種I周后將煙草幼苗移栽到盛有泥土的塑料盆(直徑15cm)中，每盆I株，于溫室內(nèi)培養(yǎng)，自然光照，溫度25-30°C。分別于10、14周苗齡時(shí)，小心地將植株取出，將泥土洗干凈，擦干后分別稱量每株地上部、地下部及整株鮮重。對正常環(huán)境下轉(zhuǎn)基因煙草的生長狀況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其長勢明顯優(yōu)于野生型(圖Sg)。對4周、5周、6周、10周和14周齡煙草植株鮮重稱量結(jié)果顯示，4周苗齡期轉(zhuǎn)基因煙草鮮重跟野生型沒差異，而5周、6周、10周和14周苗齡期轉(zhuǎn)基因煙草鮮重則顯著高于野生型(圖8a-f)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草的生長優(yōu)于野生型。二、抗冷性測定

將轉(zhuǎn)基因煙草及其野生型植株幼苗在溫室內(nèi)生長12周后，移到溫度為3°C的人工氣候箱(光強(qiáng)500 μ mo I photon.m_2s_1)內(nèi)，人工氣候箱每天光照和黑暗時(shí)間各為12小時(shí)。連續(xù)低溫處理4天，測定凈光合速率，評價(jià)抗冷性。具體如下，使用L1-Cor6400P便攜式光合作用系統(tǒng)(美國L1-Cor公司生產(chǎn))測定植株頂端以下第3片葉的光合速率，測定光強(qiáng)為700 μ mo I.n^s—1,適應(yīng)30分鐘后測定,每個(gè)株系植株重復(fù)3株,計(jì)算平均值。在冷處理后，轉(zhuǎn)基因煙草的凈光合速率明顯高于野生型煙草。3°C處理4天后野生型煙草葉片凈光合速率降至處理前的28%，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片凈光合速率分別降至處理前47.5%,45.9%和46.6%(圖9a)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草在低溫下比野生型煙草具有較高的光合速率，提高了抗冷性。三、抗凍性測定將轉(zhuǎn)基因煙草及其野生型種子經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液消毒20分鐘，再用無菌水清洗4次，播種于MS培養(yǎng)基上，28°C光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為200 μ mo I.IrT2iT1,光周期為12小時(shí)。待植株長出真葉后，轉(zhuǎn)到新的MS培養(yǎng)基中，每皿12株，每編號3皿。將培養(yǎng)5周的幼苗放到人工氣候箱(200 μ mol ^nT2s-1)中適應(yīng)低溫，15°C培養(yǎng)12小時(shí)，8°C培養(yǎng)8小時(shí)，4°C培養(yǎng)4小時(shí)后，置于_4°C處理3小時(shí)。剪取植株地上部放進(jìn)裝有25mL去離子水的三角瓶中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，于搖床輕搖2小時(shí)后用DDS-1lA型電導(dǎo)儀測電導(dǎo)Rl。沸水浴20分鐘后冷卻至室溫，測電導(dǎo)R2。相對電導(dǎo)率的計(jì)算公式為(R1/R2) X 100%。取溫室內(nèi)生長12周的轉(zhuǎn)基因煙草及其野生型植株頂端以下第3片葉直徑為Icm的葉圓片3片放入試管，葉片不能重疊，置于冰水混合物中平衡I小時(shí)后往試管中加入一塊小冰塊，盡量讓葉圓片貼住冰塊，移至冷凍循環(huán)儀中處理。分別測定0°C、-2°C、-4°C、-6°C、-8°C、-10°C處理的相對電導(dǎo)率。具體處理如下:0°C平衡I小時(shí)，取出0°C樣品；以每小時(shí)降2°C的速率降溫，于相應(yīng)溫度處理I小時(shí)后取樣。取樣后待管內(nèi)冰塊溶解后移入三角瓶中，加入去離子水至25mL，于搖床輕搖2小時(shí)后用DDS-1IA型電導(dǎo)儀測電導(dǎo)Rl ;沸水浴20分鐘后冷卻至室溫，測電導(dǎo)R2。相對電導(dǎo)率的計(jì)算公式為(R1/R2) X 100%。每次試驗(yàn)每個(gè)株系植株3株，試驗(yàn)重復(fù)3次。凍處理后，煙草葉片膜系統(tǒng)受到傷害，相對電導(dǎo)率明顯升高。對5周齡幼苗進(jìn)行_4°C處理3小時(shí)后，野生型相對電導(dǎo)率為27.8%，轉(zhuǎn)基因煙草相對電導(dǎo)率分別為15.5%、17.1%、16%，明顯低于野生型(圖％)。對葉圓片進(jìn)行一系列零下低溫處理，野生型相對電導(dǎo)率顯著高于轉(zhuǎn)基因煙草(圖9c)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草比野生型受凍害程度較輕，提高了抗凍性。四、抗強(qiáng)光鑒定取溫室內(nèi)生長12周的轉(zhuǎn)基因煙草及野生型植株，成熟展開葉第3位葉，用打孔器取直徑為Icm的葉圓片，葉面正面朝上置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用兩支1000W的鹵鎢燈照光，光源與葉面之間隔一層流動水層以保持葉表溫度于室溫，葉表面光強(qiáng)為1200 μ mol W2s'分別于照光O、1.5、3小時(shí)取樣，測定相對電導(dǎo)率及Fv/Fm。取樣后，將5個(gè)葉圓片放進(jìn)裝有25mL去離子水的三角瓶中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，于搖床輕搖2小時(shí)后用DDS-1lA型電導(dǎo)儀測電導(dǎo)Rl ;沸水浴20分鐘后冷卻至室溫，測電導(dǎo)R2 ;相對電導(dǎo)率的計(jì)算公式為(R1/R2) X 100%。同時(shí)，取樣后使用葉夾將葉圓片暗適應(yīng)20分鐘，5個(gè)重復(fù)，使用FMS-2便攜調(diào)制式突光儀(英國Hansatech公司)照射檢測光(〈0.05 μ mol.m_2s_1)測得初始突光(initial fluorescence yield,Fo),然后照射飽和脈沖光(3000 μ mol ^nTiV1)測得最大突光(maximal fluorescence yield,Fm),最大突光與初始突光的差值為可變突光(variablefluorescence, Fv),從而計(jì)算出最大光化學(xué)效率(maximal photochemical efficiency,Fv/Fm)，所有測定值由儀器計(jì)算。強(qiáng)光處理后野生型煙草相對電導(dǎo)率急速增加，處理1.5小時(shí)升至16%，3小時(shí)則升至30.7% ;而轉(zhuǎn)基因煙草相對電導(dǎo)率的增加較和緩，處理3小時(shí)后分別為17.5%、15.2%和19.2%(圖9d)。相應(yīng)地，野生 型煙草Fv/Fm強(qiáng)光處理后急速下降，而轉(zhuǎn)基因煙草Fv/Fm的下降較和緩，強(qiáng)光處理后轉(zhuǎn)基因煙草Fv/Fm顯著高于野生型(圖9e)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草受強(qiáng)光傷害較野生型輕，抗強(qiáng)光能力提高。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpC0R14，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
3.權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH在促進(jìn)植物生長及提高植物抗寒性和抗強(qiáng)光能力中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCORH的應(yīng)用，其特征在于:該應(yīng)用包括用本發(fā)明獲得的MfcpCORH基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組 織培育成轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃花苜蓿葉綠體冷響應(yīng)蛋白MfcpCOR14及其編碼基因及應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過獲得MfcpCOR14基因，并將獲得的MfcpCOR14基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織，然后培育成轉(zhuǎn)基因植株。MfcpCOR14基因受低溫的誘導(dǎo)；本發(fā)明提供了利用MfcpCOR14基因培育耐寒、耐強(qiáng)光植物的方法，將該基因在植物過量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株的生長優(yōu)于野生型植株，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株明顯提高了抗寒性和抗強(qiáng)光能力。
文檔編號C12N15/82GK103145817SQ201310064020
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者郭振飛, 卓春柳 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)