專利名稱：一種防治作物土傳病害生防菌劑的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生防菌劑，特別是一種用于防治作物土傳病害的木霉菌生物農(nóng)藥的制備方法及其與化學(xué)殺菌劑惡霉靈的協(xié)同應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著越來越多有毒化學(xué)農(nóng)藥逐漸被限制使用，世界各國都在加大生物農(nóng)藥的研發(fā)力度，研制、開發(fā)微生物農(nóng)藥已成為勢在必行。木霉攝iTrichoderma ririofe)作為一類有重要生防價值的拮抗性真菌，早在20世紀(jì)30年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對植物病原真菌有拮抗作用，其作用機(jī)制包括產(chǎn)生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競爭作用等。木霉菌強(qiáng)烈的競爭及生存能力在抑制病原菌尤其是土傳病害的過程中起著重要作用，是一種很有開發(fā)利用價值的生防菌。目前國際上已開發(fā)注冊有木霉菌產(chǎn)品，但由于諸如產(chǎn)品性能不穩(wěn)定，孢子壽命短、生防活性低等各種技術(shù)原因，尤其是施入土壤后受到各種化學(xué)因子的影響使之不能在作物根部定植形成有效群體，影響了該類產(chǎn)品在生產(chǎn)上的應(yīng)用。近年韓國學(xué)者通過提取和分離土壤中有益微生物和在土壤中添加營養(yǎng)物質(zhì)以改善農(nóng)作物種植的土壤環(huán)鏡，抑制土壤中致病菌；加拿大學(xué)者利用多種化學(xué)和生物處理方法協(xié)同改善農(nóng)田土壤環(huán)境，防治土傳病害。國內(nèi)已有研究表明木霉菌與化學(xué)殺菌劑三唑酮配合使用可提高西瓜根際木霉菌的種群數(shù)量，并削弱根際尖孢鐮刀菌。本實(shí)驗(yàn)室多年的研究也表明木霉菌與某些低劑量殺菌劑如敵克松、五氯硝基苯結(jié)合使用，不僅有助于保持或增強(qiáng)生防菌的競爭活力，同時可削弱病菌的侵染活性，產(chǎn)生明顯的協(xié)同增效作用。殺菌劑惡霉靈高效、低毒、無公害，對人、畜、魚、鳥類均有較好的安全性，能抑制許多植物病原真菌菌絲體的正常生長或直接殺滅病菌，又能促進(jìn)植物生長。為目前生產(chǎn)上防治土傳病害的高效殺菌劑，對土壤真菌包括鐮刀菌、絲核菌、腐霉菌、柱孢菌、伏革菌等病原菌引起的多種作物枯萎病、立枯病、猝倒病、菌核病、爛秧及慪根等連作重茬障礙有特效。經(jīng)本發(fā)明多年試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，惡霉靈在正常田間使用濃度范圍內(nèi)對木霉菌具有刺激生長作用，且可促進(jìn)作物根系發(fā)育，利用惡霉靈對生防木霉菌的敏感性差異與木霉菌協(xié)同施用，將成為提高作物土傳病害防治效果的重要手段，可解決木霉菌生物防治作用不穩(wěn)定之不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于防治作物土傳病害的木霉菌生防菌劑的制備方法及其與殺菌劑的協(xié)同應(yīng)用技術(shù)。與其它發(fā)明不同的是，本發(fā)明木霉菌制劑除可直接用于防治作物土傳病害外，還可與殺菌劑惡霉靈協(xié)同應(yīng)用。本發(fā)明通過多年大量研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)木霉菌具有強(qiáng)烈的競爭生存能力及對土壤中病原菌的重寄生作用，而惡霉靈對大多數(shù)木霉菌具有刺激生長作用，木霉菌生防制劑與惡霉靈同時施用具有協(xié)同增效作用。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
所采用的生防菌取自作物根表土壤的木霉菌，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作母菌劑，在三角瓶內(nèi)振蕩培養(yǎng)為液體菌種，再與營養(yǎng)基質(zhì)草炭粉、秸桿粉、樹葉粉及孢子生長促進(jìn)劑進(jìn)行固體發(fā)酵使其產(chǎn)生分生孢子，將載有大量木霉菌孢子的發(fā)酵產(chǎn)物與載體混合后制成木霉菌生防制劑，在田間可與殺菌劑惡霉靈同時施用具有顯著協(xié)同增效作用。所述防治作物土傳病害生防菌劑按如下步驟制備而成:
1、斜面母菌種的制備:取作物根表土壤5-10克，加無菌水1000倍成稀釋液；
取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈霉素0.03-0.04克、惡霉靈0.1-0.2克、瓊脂17-20克、水1000毫升制成菌種培養(yǎng)液；將稀釋液與菌種培養(yǎng)液按1: 9的重量比例一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，25-28°C下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
2、二級菌種的制備:取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-20克、水1000毫升，配制成二級發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)PH值為6-8，分裝在250-500毫升三角瓶中，裝液量為100-200毫升，在121°C下滅菌30-40分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26-30°C，發(fā)酵時間為2-4天，得到大量發(fā)散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種；
3、固體發(fā)酵:所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:培養(yǎng)料草炭或秸桿粉或樹葉粉28-40克、稻殼10-12克、水50-60克、磷酸二氫鉀0.1-0.2克、硫酸鎂0.1-0.2克、硫酸鈣0.1-0.2克；先將無機(jī)鹽溶入水中，再將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，固體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入耐高溫塑料袋或發(fā)酵瓶中，在120°C下滅菌70-90分鐘，接入重量比例5-10%的二級菌種，控制發(fā)酵溫度為25-30°C，發(fā)酵時間4-6天，至培養(yǎng)料變成綠色即木霉菌分生孢子；
4、作物土傳病害生防菌劑的制備:將滿載木霉菌孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬能粉碎機(jī)粉碎成高濃度木霉菌孢子粉，取重量比例為30-49.99%孢子粉與重量比例為50-69.99%輕質(zhì)碳酸鈣或硅藻土，再加入重量比例為0.01%的惡霉靈作為增效劑，充分混合后制成木霉囷 制劑。5.生防菌劑的應(yīng)用:將木霉菌生防菌劑200-400倍用于防治作物土傳病害，并可與殺菌劑惡霉靈4000-5000倍協(xié)同施用。施用方法為床面拌土或浸蘸種苗或生長期灌根。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1.從作物根表得到木霉菌菌株經(jīng)發(fā)酵制成孢子制劑，制作方法簡單，
適合于不同規(guī)模生產(chǎn)。2.木霉菌固體發(fā)酵原料為草炭粉、秸桿粉和樹葉粉，來源豐富，價格低廉，同時又是設(shè)施蔬菜栽培及防治由尖孢鐮刀菌為主的土傳病害引起的連作障礙的土壤改良劑，與木霉菌混合培養(yǎng)制成生防制劑施入土壤，既有利于改善土壤環(huán)境，又有利于菌絲在土壤中的伸展蔓延，在木霉菌大量繁殖的過程中抑制土壤致病菌的生長，同時解決土傳病和連作障礙問題。3.本發(fā)明制備的木霉菌生防制劑可與殺菌劑惡霉靈復(fù)合施用，二者具有顯著協(xié)同增效作用，可防治多種作物土傳病害。惡霉靈是一種內(nèi)吸性殺菌劑、同時又是一種土壤處理齊U、植物生長調(diào)節(jié)劑，其作用機(jī)理獨(dú)特，并具有促進(jìn)作物根系生長發(fā)育、生根壯苗作用。木霉菌與惡霉靈結(jié)合既能抑制病原菌萌發(fā)，又能促進(jìn)根系生長，有利于木霉菌在作物根系的繁衍，具有防病增產(chǎn)的雙重功能。按照本發(fā)明提供的木霉菌，通過人工培養(yǎng)后又施入于作物根圍，并隨著根系的生長在土壤進(jìn)一步繁衍，形成有益木霉菌在土壤中的良性循環(huán)，與惡霉靈一起達(dá)到對土傳病害的持續(xù)控制，無殘留，無污染，對大棚黃瓜、西瓜、甜瓜及棚下人參、西洋參等土傳病害防治效果達(dá)78%以上。本發(fā)明適用于大多數(shù)木霉菌株，制作方法簡單，省水省電，適合于不同規(guī)模生產(chǎn)，市場前景廣闊。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1
1.斜面母菌種的制備:取作物根表土壤5克，加無菌水5千克制成稀釋液；取馬鈴薯150克、葡萄糖20克、孟加拉紅0.04克、硫酸鏈霉素0.03克、惡霉靈0.1克、瓊脂20克、水1000毫升制成菌種培養(yǎng)液；將稀釋液與菌種培養(yǎng)液按1: 9的重量比例一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，25°C培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
2.二級菌種的制備:取馬鈴薯150克、葡萄糖或蔗糖20克、水1000毫升，配制成二級發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)PH值為6，分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121 °C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26°C，發(fā)酵時間為4天，得到大量發(fā)散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種；
3.固體發(fā)酵:所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:培養(yǎng)料為草炭或秸桿粉或樹葉粉40克、稻殼10克、水50克、磷酸二氫鉀0.1克、硫酸鎂0.2克、硫酸鈣0.15克；制作方法是先將無機(jī)鹽溶入水中，再將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基，裝入耐高溫塑料袋或發(fā)酵瓶中，在120°C下滅菌70分鐘，接入重量百分比為5%的二級菌種，控制發(fā)酵溫度為25°C，發(fā)酵時間6天，至培養(yǎng)料變成綠色即木霉菌分生孢子；
4.生防菌劑的制備:將滿載 木霉菌孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬能粉碎機(jī)粉碎成高濃度木霉菌孢子粉，取重量比例為30%孢子粉與重量比例為69.99%硅藻土，再加入重量比例為0.01%的惡霉靈作為增效劑，充分混合后制成木霉菌制劑。用于黃瓜枯萎病防治結(jié)果表明:在黃瓜播種時以木霉菌制劑200倍拌土、與惡霉靈4000倍拌土同時施用，裝營養(yǎng)缽育苗，4葉期再以木霉菌制劑200倍兌水、與惡霉靈4000倍兌水同時施用灌根一次，并分別以單用木霉菌制劑和惡霉靈做對照，其防治效果分別為94.23%,79.34%和76.6%,復(fù)合處理比單獨(dú)處理增加防效14.89%和17.63%。用于西瓜枯委病防治結(jié)果表明:在西瓜播種時以木霉囷制劑200倍祥土與惡霉靈4000倍拌土同時施用，裝營養(yǎng)缽育苗，4葉期再以木霉菌制劑200倍兌水、與惡霉靈4000倍兌水同時施用灌根一次，并分別以單用木霉菌制劑和惡霉靈做對照，其防治效果分別為88.45%,76.67%和79.53%,復(fù)合處理比單獨(dú)處理增加防效11.78%和8.92%。實(shí)施例2
1.斜面母菌種的制備:取作物根表土壤7.5克，加無菌水7.5千克，制成稀釋液；取馬鈴薯175克、葡萄糖17.5克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈霉素0.035克、惡霉靈0.15克、瓊脂18克、水1000毫升制成菌種培養(yǎng)液；將稀釋液與菌種培養(yǎng)液按1: 9的重量比例一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種。
2.二級菌種的制備:取馬鈴薯170克、葡萄糖或蔗糖18克、水1000毫升，配制成二級發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)PH值為7，分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為150毫升，在121 °C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵時間為3天，得到大量發(fā)散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種。
3.固體發(fā)酵:所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:培養(yǎng)料草炭或秸桿粉或樹葉粉28克、稻殼12克、水60克、磷酸二氫鉀0.2克、硫酸鎂0.15克、硫酸鈣0.1克。制作方法是先將無機(jī)鹽溶入水中，再將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基，裝入耐高溫塑料袋或發(fā)酵瓶中，在120°C下滅菌80分鐘，按重量百分比接入8%的二級菌種，控制發(fā)酵溫度為27°C，發(fā)酵時間5天，至培養(yǎng)料變成綠色即木霉菌分生孢子。4.生防菌劑的制備:將滿載木霉菌孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬能粉碎機(jī)粉碎成高濃度木霉菌孢子粉，取重量比例為40%孢子粉與重量比例為59.99%輕質(zhì)碳酸鈣，再加入重量比例為0.01%的惡霉靈作為增效劑，充分混合后制成木霉菌制劑。用于甜瓜枯萎病防治結(jié)果表明:在甜瓜播種時以木霉菌制劑200倍拌土與惡霉靈4000倍拌土同時施用，裝營養(yǎng)缽育苗，4葉期再以木霉菌制劑200倍兌水、與惡霉靈4000倍兌水同時施用灌根一次，并分別以單用木霉菌制劑和惡霉靈做對照，其防治效果分別為88.27%,74.34%和83.41%,復(fù)合處理比單獨(dú)處理增加防效13.93%和4.86%。用于辣椒枯萎病防治結(jié)果表明:在辣椒移栽時用木霉菌制劑300倍拌土與惡霉靈5000倍拌土同時施用，采用上鋪下墊辦法穴施，一個月后再以木霉菌制劑300倍兌水、與惡霉靈5000倍兌水同時施用灌根一次，并分別以單用木霉菌制劑和惡霉靈做對照，其防治效果分別為78.36%,69.76%和76.23%,復(fù)合處理比單獨(dú)處理增加防效8.6%和2.13%。實(shí)施例3 1.斜面母菌種的制備:取作物根表土壤10克，加無菌水10千克，制成稀釋液；取馬鈴薯200克、葡萄糖15克、孟加拉紅0.07克、硫酸鏈霉素0.04克、惡霉靈0.2克、瓊脂17克、水1000毫升制成菌種培養(yǎng)液；將稀釋液與菌種培養(yǎng)液按1: 9的重量比例一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，28°C下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種。2.二級菌種的制備:取馬鈴薯200克、葡萄糖或蔗糖15克、水1000毫升，配制成二級發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)PH值為8，分裝在500毫升三角瓶中，裝液量為200毫升，在121 °C下滅菌40分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度30°C，發(fā)酵時間為2天，得到大量發(fā)散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種。
3.固體發(fā)酵:所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:培養(yǎng)料草炭或秸桿粉或樹葉粉34克、稻殼11克、水55克、磷酸二氫鉀0.15克、硫酸鎂0.1克、硫酸鈣0.2克。制作方法是先將無機(jī)鹽溶入水中，再將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體培養(yǎng)基，裝入耐高溫塑料袋或發(fā)酵瓶中，在120°C下滅菌90分鐘，按重量百分比接入10%的二級菌種，控制發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時間4天，至培養(yǎng)料變成綠色即木霉菌分生孢子。4.生防菌劑的制備:將滿載木霉菌孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬能粉碎機(jī)粉碎成高濃度木霉菌孢子粉，取重量比例為49.99%孢子粉與重量比例為50%輕質(zhì)碳酸鈣，再加入重量比例為0.01%惡霉靈作為增效劑，充分混合后制成木霉菌制劑。用于人參銹腐病防治結(jié)果表明:在2年苗移栽時先用木霉菌制劑每簾(10平方米)200克均勻混入?yún)⒋哺鲗?，展葉后再以木霉菌制劑200倍加惡霉靈5000倍兌水灌根一次，以單用木霉菌制劑做對照，其防治效果分別為87.97%和71.15%，復(fù)合處理比單獨(dú)處理增加防效16.82%，優(yōu)質(zhì)人參比率提高27.22%。用于人參根腐病防治結(jié)果表明:在2年苗移栽時先用木霉菌制劑每簾(10平方米)250克均勻混入?yún)⒋?，展葉后再以木霉菌制劑400倍加惡霉靈5000倍兌水灌根一次，以單用惡霉靈制劑做對照，其防治效果分別為91.43%和81.89%，復(fù)合處理比單獨(dú)處理增加防效
9.54%ο木霉菌與惡霉靈同時施用具有顯著協(xié)同增效作用。除了本發(fā)明的木霉菌制劑外，還可采用其他多種木霉菌制劑與殺菌劑惡霉靈協(xié)同施用。木霉菌制劑中還可采用多種其他固體培養(yǎng)基，只要能夠提供木霉菌生長并同時具有改良土壤作用即可。參考文獻(xiàn):
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4.五種殺菌劑對木 霉菌及尖孢鐮刀菌的毒力測定.植物保護(hù).2005(3)
權(quán)利要求
1.一種防治作物土傳病害生防菌劑的制備方法，其特征在于包括如下具體步驟: (1)斜面母菌種的制備:取作物根表土壤5-10克，加無菌水1000倍成稀釋液； 取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈霉素0.03-0.04克、惡霉靈0.1-0.2克、瓊脂17-20克、水1000毫升制成菌種培養(yǎng)液；將稀釋液與菌種培養(yǎng)液按1: 9的重量比例一起倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，25-28°C下培養(yǎng)48小時，經(jīng)分離獲得木霉菌菌株，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種； (2)二級菌種的制備:取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-20克、水1000毫升，配制成二級發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)PH值為6-8，分裝在250-500毫升三角瓶中，裝液量為100-200毫升，在121°C下滅菌30-40分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26-30°C，發(fā)酵時間為2-4天，得到大量發(fā)散的絮狀菌絲及分散的分生孢子二級菌種； (3)固體發(fā)酵:所采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:培養(yǎng)料草炭或秸桿粉或樹葉粉28-40克、稻殼10-12克、水50-60克、磷酸二氫鉀0.1-0.2克、硫酸鎂0.1-0.2克、硫酸鈣0.1-0.2克；先將無機(jī)鹽溶入水中，再將培養(yǎng)料與水充分混合后制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，固體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入耐高溫塑料袋或發(fā)酵瓶中，在120°C下滅菌70-90分鐘，接入重量比例5-10%的二級菌種，控制發(fā)酵溫度為25-30°C，發(fā)酵時間4-6天，至培養(yǎng)料變成綠色即木霉菌分生孢子； (4)作物土傳病害生防菌劑的制備:將滿載木霉菌孢子的固體培養(yǎng)料經(jīng)常溫干燥后，用萬能粉碎機(jī)粉碎成高濃度木霉菌孢子粉，取重量比例為30-49.99%孢子粉與重量比例為50-69.99%輕質(zhì)碳酸鈣或硅藻土，再加入重量比例為0.01%的惡霉靈作為增效劑，充分混合后制成木霉囷制劑。
2.一種如權(quán)利要求1所 述的防治作物土傳病害生防菌劑的應(yīng)用，其特征在于將權(quán)利要求I制備的木霉菌生防菌劑200-400倍用于防治作物土傳病害，并可與殺菌劑惡霉靈4000-5000倍協(xié)同施用，其施用方法為床面拌土或浸蘸種苗或生長期灌根。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于防治作物土傳病害的生防菌劑的制備方法及其應(yīng)用。采用木霉菌株(Trichodermaviride)為母菌劑，以草炭粉、秸稈粉和樹葉粉，硅藻土和輕質(zhì)碳酸鈣為載體制成生防菌制劑，并以微量殺菌劑惡霉靈作為增效劑。用于防治由鐮孢菌等病原真菌引起的作物土傳病害。本發(fā)明的特征在于利用木霉菌對惡霉靈的敏感性差異將木霉菌生防菌劑與惡霉靈協(xié)同施用，具有既能抑制土壤中病原菌萌發(fā)，又能促進(jìn)木霉菌的繁殖，同時促進(jìn)作物根系生長的多重協(xié)同功效。
文檔編號C12R1/885GK103141519SQ201310066268
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者鄭雅楠, 魏漢蓮, 楊長成, 高增貴, 李可強(qiáng), 關(guān)昕, 莊敬華 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)