從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，用PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌的小RNA進(jìn)行檢測(cè)；步驟一：提取臨床標(biāo)本中的總RNA；步驟二：以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；步驟三：針對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物和步驟二中合成的cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中，常用的結(jié)核菌感染檢測(cè)方法包括CSF抗酸桿菌涂片法和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)法。CSF抗酸桿菌涂片法存在的不足之處在于陽(yáng)性率低，約10%，且需要檢材中的細(xì)菌> IOVmi才能找到，特異性差。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)法存在的不足之處在于操作復(fù)雜，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，需4~8周，且陽(yáng)性率低，多在20~30%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，陽(yáng)性率高。
[0004]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案:
[0005]一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，其特征在于:用PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌的小RNA進(jìn)行檢測(cè)。
[0006]步驟一:提取臨床標(biāo)本中的總RNA ；
[0007]步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；
[0008]步驟三:針對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物和步驟二中合成的cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。
[0009]優(yōu)選地，步驟三中PCR反應(yīng)體系包括2倍濃縮PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物、步驟二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。
[0010]優(yōu)選地，步驟三中PCR反應(yīng)條件為，98°C 10秒，68°C 30秒，重復(fù)45個(gè)循環(huán)；PCR結(jié)果經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，在紫外燈下顯色拍照，有陽(yáng)性條帶的標(biāo)本為結(jié)核感染患者。
[0011]優(yōu)選地，步驟三中PCR反應(yīng)體系為:2倍濃縮PCR反應(yīng)緩沖液25微升、dNTP0.4mM、結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物I微升、步驟二中合成的cDNA模板I微升、DNA聚合酶1.25單位，加去離子水補(bǔ)充體積至50微升。
[0012]結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物可以為以下各組引物其中的一組:[0013]第一組:正向引物 SEQ ID N0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'[0014]反向引物SEQ ID N0.2:5'-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3[0015]第二組:正向引物 SEQ ID N0.3:5'-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'[0016]反向引物SEQ ID N0.4:5'-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3[0017]第三組:正向引物 SEQ ID N0.5:5'-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'[0018]反向引物SEQ ID N0.6:5'-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3[0019]第四組:正向引物 SEQ ID N0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'[0020]反向引物SEQ ID N0.8:5'-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3[0021]第五組:正向引物 SEQ ID N0.9:5'-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'[0022]反向引物 SEQ ID N0.10:5'-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3'[0023]第六組:正向引物 SEQ ID N0.11:5'-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'[0024]反向引物 SEQ ID N0.12:5'-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3'[0025]第七組:正向引物 SEQ ID N0.13:5'-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'[0026]反向引物 SEQ ID N0.14:5'-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3'[0027]第八組:正向引物 SEQ ID N0.15:5'-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3'[0028]反向引物 SEQ ID N0.16:5'-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3'[0029]第九組:正向引物 SEQ ID N0.17:5'-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'[0030]反向引物 SEQ ID N0.18:5'-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3'[0031]本發(fā)明具有的有益效果:[0032]本發(fā)明用PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌的小RNA進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件、結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物進(jìn)行特有設(shè)計(jì)，檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、陽(yáng)性率高(可達(dá)60%-70%)，便于大規(guī)模篩查檢測(cè)。結(jié)核菌的小RNA游離存在于細(xì)菌外，標(biāo)本容易獲得，
無(wú)需結(jié)核菌培養(yǎng)，更安全、快速，大大縮短檢測(cè)時(shí)間；結(jié)核菌的小RNA可以抵抗RNA酶的降解作用，可穩(wěn)定存在，有效提高了檢測(cè)的敏感性。本發(fā)明對(duì)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的特有設(shè)計(jì)，可以高靈敏度的檢測(cè)標(biāo)本中低水平的結(jié)核菌小RNA。本發(fā)明根據(jù)結(jié)核菌的小RNA特點(diǎn)，對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，序列更加優(yōu)化。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為各組引物對(duì)結(jié)核桿菌感染患者血漿標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果圖；
[0034]圖2為不同來(lái)源的血漿使用同一組引物的檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]獲取臨床標(biāo)本:采集患者外周血3-5毫升，1000-1500轉(zhuǎn)/分，水平離心10分鐘。小心吸取上層血漿200微升至無(wú)菌1.5毫升離心管中。其他液體樣本經(jīng)13000轉(zhuǎn)/分’離心10分鐘，小心吸取上層液體200微升至無(wú)菌1.5毫升離心管中。
[0036]步驟一:提取臨床標(biāo)本的總RNA。
[0037]200微升臨床標(biāo)本中，加入500微升酚胍RNA提取液，充分混勻，室溫靜置5分鐘。加入300微升氯仿，混勻后12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。小心吸取上層澄清液體至一無(wú)菌2毫升離心管中。加入900微升丙酮，混勻后用硅膠膜吸附。蛋白洗液沖洗一次，100%乙醇和80 %乙醇依次沖洗一次，待乙醇揮發(fā)后，用TE或去離子水洗脫RNA，收集與無(wú)菌1.5毫升離心管中，即為臨床標(biāo)本中的總RNA。
[0038]步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0039]反應(yīng)體系:總RNA取10微升，9堿基隨即引物I微升，dNTPl微升，逆轉(zhuǎn)錄酶100單位，5倍濃縮反應(yīng)緩沖液4微升，0.1M 二硫蘇糖醇I微升，去離子水補(bǔ)充體積到20微升。
[0040]反應(yīng)條件:50°C—小時(shí)，75°C 15分鐘后，低溫保存，即為cDNA。
[0041]步驟三:針對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物和步驟二中合成的cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。
[0042]PCR反應(yīng)體系:2倍濃縮PCR反應(yīng)緩沖液25微升，dNTP0.4mM,結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物I微升，cDNA模板I微升，DNA聚合酶1.25單位，加去離子水補(bǔ)充體積至50微升。[0043]PCR反應(yīng)條件:98°C 10秒，68°C 30秒，重復(fù)45個(gè)循環(huán)。
[0044]結(jié)果判定:PCR結(jié)果經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，在紫外燈下顯色拍照，有陽(yáng)性條帶的標(biāo)本為結(jié)核感染患者。圖1中，M泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-9泳道為對(duì)應(yīng)第一組-第九組引物組的檢測(cè)結(jié)果。圖2中，M泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-11泳道為臨床結(jié)核患者，12泳道為正常人標(biāo)本。
[0045]結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物可以為以下各組引物其中的一組:
[0046]第一組:正向引物SEQIDN0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'[0047]反向引物SEQIDN0.2:5/-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3'[0048]第二組:正向引物SEQIDN0.3:5/-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'[0049]反向引物SEQIDN0.4:5,-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3'[0050]第三組:正向引物SEQIDN0.5:5/-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'[0051]反向引物SEQIDN0.6:5/-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3'[0052]第四組:正向引物SEQIDN0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'[0053]反向引物SEQIDN0.8:5/-CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3'[0054]第五組:正向引物SEQIDN0.9:5/-ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'[0055]反向引物SEQIDN0.10:5-AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-3[0056]第六組:正向引物SEQIDN0.11:5/-CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'[0057]反向引物SEQIDNO? 12:5-ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-3[0058]第七組:正向引物SEQIDN0.13:5/-AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'[0059]反向引物SEQIDN0.14:5-CGTGGGTATACCGAGGTCCA-3[0060]第八組:正向引物SEQIDN0.15:5/-CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3'[0061]反向引物SEQIDN0.16:5-AGGGACGACCCCCGCCAGGG-3[0062]第九組:正向引物SEQIDN0.17:5/-CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'[0063]反向 引物SEQIDN0.18:5-CGCACGTCAGCCCCACCCGT-3
【權(quán)利要求】
1.一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，其特征在于:用PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌的小RNA進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，其特征在于:步驟一:提取臨床標(biāo)本中的總RNA ；步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；步驟三:針對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物和步驟二中合成的cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，其特征在于:步驟三中PCR反應(yīng)體系包括2倍濃縮PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物、步驟二中合成的cDNA模板和DNA聚合酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，其特征在于:步驟三中PCR反應(yīng)條件為，98°C 10秒，68°C 30秒，重復(fù)45個(gè)循環(huán)；PCR結(jié)果經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色后，在紫外燈下顯色拍照，有陽(yáng)性條帶的標(biāo)本為結(jié)核感染患者。
5.根據(jù)權(quán)利要求所述4的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，其特征在于:步驟三中PCR反應(yīng)體系為'2倍濃縮PCR反應(yīng)緩沖液25微升、dNTP0.4mM、結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物I微升、步驟二中合成的cDNA模板I微升、DNA聚合酶1.25單位，加去離子水補(bǔ)充體積至50微升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任何一項(xiàng)所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，其特征在于:結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物可以為以下各組引物其中的一組:第一組第二組第三組第四組第五組第六組第七組第八組第九組正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQ正向引物SEQ反向引物SEQID N0.1:5/ -TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3'ID N0.2:5/ -TGGGTTGGACGACTCGACGT-3'ID N0.3:5/ -ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3'ID N0.4:5/ -AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3'ID N0.5:5/ -CGGCCTGCGTATGACCCATA-3'ID N0.6:5/ -AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3'ID N0.7:5/ -CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3'ID N0.8:5/ -CTGGGTCCCCTCCCACCAGC-3'ID N0.9:5/ -ATAGAGGACGGAGTCGGTGA-3'ID N0.10:5/ -AGAAACTTCGCCTCGAGGTA-31ID N0.11:5/ -CCACGTACTCGATCCCGTTG-3'ID N0.12:5/ -ACTTGGGGGGATTGGGAGGT-31IDN0.13:5/ -AACTCCCCCAGGGCTGGAAG-3'ID N0.14:5/ -CGTGGGTATACCGAGGTCCA-31ID N0.15:5/ -CTCGGCCATAGCCGAGGGTG-3;ID N0.16:5/ -AGGGACGACCCCCGCCAGGG-31ID N0.17:5/ -CGGGACTCCTGAGAAGGATC-3'ID N0.18:5/ -CGCACGTCAGCCCCACCCGT-31
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103571938SQ201310068037
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月25日
【發(fā)明者】張鳳民, 付英梅, 宋武琦, 錢均, 李玉軍, 李文靜 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)