從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌的小RNA進(jìn)行檢測(cè)；步驟一：提取臨床標(biāo)本中的總RNA；步驟二：以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；步驟三：針對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物和步驟二中合成的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
【專利說明】從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中，常用的結(jié)核菌感染檢測(cè)方法CSF抗酸桿菌涂片法和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)法。CSF抗酸桿菌涂片法存在的不足之處在于陽性率低，約10%，且需要檢材中的細(xì)菌> 104/ml才能找到，特異性差。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)法存在的不足之處在于操作復(fù)雜，培養(yǎng)時(shí)間較長，需4~8周，且陽性率低，多在20~30%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，操作簡單，耗時(shí)短，陽性率高。
[0004]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案:
[0005]一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，其特征在于:用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌的小RNA進(jìn)行檢測(cè)。
[0006]步驟一:提取臨床標(biāo)本中的總RNA ；
[0007]步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；
[0008]步驟三:針對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物和步驟二中合成的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
[0009]優(yōu)選地，步驟三中熒光定量PCR反應(yīng)體系包括2倍濃縮熒光PCR反應(yīng)緩沖液、結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物、步驟二中合成的cDNA模板。
[0010]優(yōu)選地，步驟三中熒光定量PCR反應(yīng)條件為，95°C 10秒，60°C 20秒，重復(fù)50個(gè)循環(huán)；60°C延伸反應(yīng)時(shí)采集熒光亮度值，產(chǎn)物經(jīng)65°C _95°C緩慢升溫，同時(shí)檢測(cè)熒光亮度，繪制溶解曲線；根據(jù)溶解曲線與標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)，判定樣本反應(yīng)產(chǎn)物是否正確，與正常人標(biāo)本對(duì)比，小RNA含量明顯升高的臨床標(biāo)本為結(jié)核感染患者。
[0011]優(yōu)選地，步驟三中熒光定量PCR反應(yīng)體系為:2倍濃縮熒光定量PCR反應(yīng)混合液10微升，結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物I微升，步驟二中合成的cDNA模板I微升，加去離子水補(bǔ)充體積至20微升。
[0012]結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物可以為以下各組引物其中的一組:
[0013]第一組:正向引物SEQIDN0.1:5'-TCGTCGTCGACGCTTAGGTA-3[0014]反向引物SEQIDN0.2:5/-TGGGTTGGACGACTCGACGT-3[0015]第二二組:正向引物SEQIDN0.3:5/-ATCGGTGCCGGACCAGTTCA-3[0016]反向引物SEQIDN0.4:5'-AGCTGGTACTTCGCACCGGA-3[0017]第三 三組:正向引物SEQIDN0.5:5/-CGGCCTGCGTATGACCCATA-3[0018]反向引物SEQIDN0.6:5'-AGGCGTTGTTGGCCACTTAT-3[0019]第四組:正向引物SEQIDN0.7:5'-CGGATAGCCCCGTGTTGTTG-3
【權(quán)利要求】
1.一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，其特征在于:用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床標(biāo)本中結(jié)核菌的小RNA進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，其特征在于:步驟一:提取臨床標(biāo)本中的總RNA ；步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；步驟三:針對(duì)結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物和步驟二中合成的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，其特征在于:步驟三中熒光定量PCR反應(yīng)體系包括2倍濃縮熒光PCR反應(yīng)緩沖液、結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物、步驟二中合成的cDNA模板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，其特征在于:步驟三中熒光定量PCR反應(yīng)條件為，95°C 10秒，60°C 20秒，重復(fù)50個(gè)循環(huán)；60°C延伸反應(yīng)時(shí)采集熒光亮度值，產(chǎn)物經(jīng)65°C _95°C緩慢升溫，同時(shí)檢測(cè)熒光亮度，繪制溶解曲線；根據(jù)溶解曲線與標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)，判定樣本反應(yīng)產(chǎn)物是否正確，與正常人標(biāo)本對(duì)比，小RNA含量明顯升高的臨床標(biāo)本為結(jié)核感染患者。
5.根據(jù)權(quán)利要求所述4的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，其特征在于:步驟三中熒光定量PCR反應(yīng)體系為:2倍濃縮熒光定量PCR反應(yīng)混合液10微升，結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物I微升，步驟二中合成的cDNA模板I微升，加去離子水補(bǔ)充體積至20微升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任何一項(xiàng)所述的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，其特征在于:結(jié)核菌小RNA檢測(cè)引物可以為以下各組引物其中的一組:
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571939SQ201310068046
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月25日
【發(fā)明者】張鳳民, 宋武琦, 黃穎, 陳小貝, 李愛梅, 錢均 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)