從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，用基因芯片檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測；步驟一：提取臨床標本中的總RNA；步驟二：以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA，并標記；步驟三：用基因芯片對步驟二中合成的標記cDNA進行檢測。
【專利說明】從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法。
【背景技術】
[0002]現(xiàn)有技術中，常用的結核菌感染檢測方法包括CSF抗酸桿菌涂片法和結核分枝桿菌培養(yǎng)檢測法。CSF抗酸桿菌涂片法存在的不足之處在于陽性率低，約10%，且需要檢材中的細菌> IOVmi才能找到，特異性差。結核分枝桿菌培養(yǎng)檢測法存在的不足之處在于操作復雜，培養(yǎng)時間較長，需4~8周，且陽性率低，多在20~30%。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，操作簡單，耗時短，陽性率高。
[0004]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案:
[0005]一種從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，其特征在于:用基因芯片檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測。
[0006]步驟一:提取臨床標本中的總RNA ；
[0007]步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA，并標記；
[0008]步驟三:用基因芯片對 步驟二中合成的標記cDNA進行檢測。
[0009]步驟三中的具體檢測方法為，取20微升步驟二中合成的標記cDNA，加入20微升2倍雜交緩沖液，65°C雜交過夜；室溫洗滌基因芯片3次，每次I分鐘；基因芯片掃描，以100%和10%功率各掃描一次，經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件分析后，得到雜交圖。
[0010]基因芯片包括與結核菌小RNA基因相關的探針序列、用于定量的陽性對照基因和用于陰性對照的基因。
[0011 ] 基因芯片具有9組探針序列，每組探針序列與結核囷小RNA的I個基因序列互補，每組探針序列具有4-8個探針。
[0012]本發(fā)明具有的有益效果:
[0013]本發(fā)明用基因芯片檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測，并對基因芯片進行特有設計，檢測操作簡單、耗時短、陽性率高(可達60% -70% )，便于大規(guī)模篩查檢測。結核菌的小RNA游離存在于細菌外，標本容易獲得，無需結核菌培養(yǎng)，更安全、快速，大大縮短檢測時間；結核菌的小RNA可以抵抗RNA酶的降解作用，可穩(wěn)定存在，有效提高了檢測的敏感性。本發(fā)明對基因芯片進行特有設計，結核菌小RNA包括9個基因，即Asl726、Asl890、Aspks、F6、Asdes、G2、C8、Bll和B559基因，基因芯片對應包括9組相關探針序列，可以高靈敏度的檢測標本中低水平的結核菌小RNA。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]附圖為檢測結果圖?！揪唧w實施方式】
[0015]基因芯片設計及制備:
[0016]1.基因芯片設計。結核菌小RNA基因(目的基因)包括Asl726、Asl890、Aspks、F6、Asdes、G2、C8、Bll和B55基因，前述基因為現(xiàn)有技術?；蛐酒?組與基因相關的探針序列，每組探針序列與結核菌小RNA的1個基因序列互補，基因芯片還包括1個用于定量的陽性對照基因U6和2個無關序列作為陰性對照。
[0017]2.基因芯片制備。根據(jù)目的基因的序列設計探針，每組探針序列具有4-8個探針，長度14-50bp，送試劑公司合成，每種探針20D。
[0018]將探針溶于Tiris-EDTA緩沖液中，終濃度為100 μ M。
[0019]將1OOuL探針與300uL的0.2M的PBS緩沖液混合，室溫震蕩混勻，以備點樣。
[0020]將設計好的探針通過接觸式點樣點載到尼龍膜、樹脂、硝酸纖維素、硅片或玻璃材質的固相載體材料上，室溫干燥備用。
[0021]用基因芯片檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測:
[0022]獲取臨床標本:采集患者外周血3-5毫升，1000-1500轉/分，水平離心10分鐘。小心吸取上層血漿200微升至無菌1.5毫升離心管中。其他液體樣本經(jīng)13000轉/分，離心10分鐘，小心吸取上層液體200微升至無菌1.5毫升離心管中。
[0023]步驟一:提取臨床標本的總RNA。
[0024]200微升臨床標本中，加入500微升酚胍RNA提取液，充分混勻，室溫靜置5分鐘。加入300微升氯仿，混勻后12000轉/分離心10分鐘。小心吸取上層澄清液體至一無菌2毫升離心管中。加入900微升丙酮，混勻后用硅膠膜吸附。蛋白洗液沖洗一次，100%乙醇和80 %乙醇依次沖洗一次，待乙醇揮發(fā)后，用TE或去離子水洗脫RNA，收集與無菌1.5毫升離心管中，即為臨床標本中的總RNA。
[0025]步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA，并標記。
[0026]反應體系:總RNA取10微升，9堿基隨即引物1微升，1OmM的dNTP1微升，2.5mM的Cy3-dUTPl微升，逆轉錄酶100單位，5倍濃縮反應緩沖液4微升，0.1M 二硫蘇糖醇1微升，去尚子水補充體積到20微升。
[0027]反應條件:50°C—小時，75°C 15分鐘后，低溫保存，即為Cy3標記的cDNA。
[0028]步驟三:用基因芯片對步驟二中合成的標記cDNA進行檢測。
[0029]取20微升標記cDNA，加入20微升2倍雜交緩沖液，65°C雜交過夜。室溫洗滌基因芯片3次，每次1分鐘。芯片掃描，以100%和10%功率各掃描一次，經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件分析后，得到雜交圖。如附圖所示，U6為定量陽性對照基因的對應結果、I為目的基因的對應結果、2為無關序列的對應結果、3為正常人的基因芯片檢測結果、4為結核菌感染者的基因芯片檢測結果。
【權利要求】
1.一種從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，其特征在于:用基因芯片檢測方法對臨床標本中結核菌的小RNA進行檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，其特征在于: 步驟一:提取臨床標本中的總RNA ； 步驟二:以步驟一中提取的總RNA為模板逆轉錄合成cDNA，并標記； 步驟三:用基因芯片對步驟二中合成的標記cDNA進行檢測。
3.根據(jù)權利要求2所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，其特征在于:步驟三中的具體檢測方法為，取20微升步驟二中合成的標記cDNA，加入20微升2倍雜交緩沖液，65°C雜交過夜；室溫洗滌基因芯片3次，每次I分鐘；基因芯片掃描，以100%和10%功率各掃描一次，經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件分析后，得到雜交圖。
4.根據(jù)權利要求1至3任何一項所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，其特征在于:基因芯片包括與結核菌小RNA基因相關的探針序列、用于定量的陽性對照基因和用于陰性對照的基因。
5.根據(jù)權利要求4所述的從臨床標本中檢測結核菌感染的基因芯片檢測方法，其特征在于:基因芯片具有9組探針序列，每組探針序列與結核囷小RNA的I個基因互補，每組探針序列具有4-8個探 針。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571940SQ201310068058
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年2月25日 優(yōu)先權日:2013年2月25日
【發(fā)明者】張鳳民, 李玉軍, 付英梅, 翟愛霞, 趙吉子, 李輝 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學