一種脂肪酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種脂肪酶，該脂肪酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?1，編碼該脂肪酶的基因組DNA，其序列為SEQ?ID?NO:2。本發(fā)明的脂肪酶為堿性低溫脂肪酶，在洗滌、皮革、食品、飼料等方向?qū)碛芯薮蟮氖袌?chǎng)前景。本發(fā)明脂肪酶在較高的堿性環(huán)境下仍有很高的酶活力，反應(yīng)最佳pH9.0。在應(yīng)用試驗(yàn)中檢測(cè)脂肪酶的去污效果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明未濃縮的脂肪酶發(fā)酵液樣品和諾維信6萬(wàn)單位的脂肪酶高濃縮樣品相比，其洗滌去污能力僅相差10倍，而其生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于諾維信脂肪酶的成本，有望通過(guò)進(jìn)一步的發(fā)酵優(yōu)化和產(chǎn)品濃縮達(dá)到相同去污效果，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
【專利說(shuō)明】一種脂肪酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶基因的分離和應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種脂肪酶及其應(yīng)用，即一種來(lái)源于黑葡萄穗霉(Stachybotrys chatarum)菌株的脂肪酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油?；饷福侵杆怍人岣视腿ブ絮ユI的酶。脂肪酶能催化甘油三酯來(lái)生成甘油二脂、單甘脂、脂肪酸和甘油。脂肪酶具有催化疏水性的油脂變成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在無(wú)機(jī)溶劑中能保持高催化活力和極強(qiáng)穩(wěn)定性。另外，脂肪酶對(duì)底物的廣譜性/特殊專一性，賦予了脂肪酶在食品油脂加工工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等工業(yè)的巨大應(yīng)用價(jià)值。脂肪酶已經(jīng)成為蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工業(yè)用酶。
[0003]脂肪酶是生物體內(nèi)一類重要的代謝酶，從催化特性看，它具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)性，且反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶的另外一個(gè)特征是可以在異相系統(tǒng)(如油、水界面)或有機(jī)相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反應(yīng)的進(jìn)行；而在有機(jī)相中，它卻能催化多種合成反應(yīng):如酯化、酯交換、酯的醇解、酯的酸解等。月旨肪酶的這些特性使其成為在手性化合物合成中重要的生物催化劑，多被用來(lái)催化一些酯類合成和轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在食品增香、脫脂加工、污水處理及化工產(chǎn)品中有著廣泛的應(yīng)用。然而，目前脂肪酶的生產(chǎn)效率仍然較低且生產(chǎn)成本也較高，因此需要對(duì)現(xiàn)有的脂肪酶的種類及生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。
[0004]脂肪酶廣泛存在 于動(dòng)物組織、植物種子和微生物體中。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，因此微生物來(lái)源的脂肪酶比動(dòng)植物來(lái)源的脂肪酶具有更廣的作用pH、作用溫度范圍；以及高穩(wěn)定性、高活性和底物專一性。而且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品。已經(jīng)公布的適用于甘油三酯加工的不同來(lái)源的脂肪酶有33種，其中18種來(lái)自霉菌，7種來(lái)自細(xì)菌。因此，從霉菌和細(xì)菌中篩選出具有更好效果的脂肪酶一直是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酶及其應(yīng)用，即提供一種新的脂肪酶，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明一個(gè)方面提供一種脂肪酶，該脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0007]用于編碼上述脂肪酶的基因組DNA，其序列為SEQ ID N0:2。
[0008]本發(fā)明另一個(gè)方面提供一種用于表達(dá)上述脂肪酶的重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒攜帶有用于表達(dá)上述脂肪酶的DNA片段，其序列為SEQ ID N0:3。
[0009]本發(fā)明的脂肪酶，是在曲霉細(xì)胞中生產(chǎn)的，是將用于表達(dá)脂肪酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入曲霉宿主細(xì)胞，所述的曲霉細(xì)胞為黑曲霉細(xì)胞；
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種酶組合物，包含有上述的脂肪酶；[0011]本發(fā)明的脂肪酶為堿性低溫脂肪酶，在洗滌、皮革、食品、飼料等方向?qū)碛芯薮蟮氖袌?chǎng)前景。本發(fā)明脂肪酶在較高的堿性環(huán)境下仍有很高的酶活力，反應(yīng)最佳PH9.0。在應(yīng)用試驗(yàn)中檢測(cè)脂肪酶的去污效果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明未濃縮的脂肪酶發(fā)酵液樣品和諾維信6萬(wàn)單位的脂肪酶高濃縮樣品相比，其洗滌去污能力僅相差10倍，而其生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于諾維信脂肪酶的成本，有望通過(guò)進(jìn)一步的發(fā)酵優(yōu)化和產(chǎn)品濃縮達(dá)到相同去污效果，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1:本發(fā)明所用的pGm質(zhì)粒的遺傳圖譜；
[0013]圖2:本發(fā)明所用的pGm_Lip3404質(zhì)粒的遺傳圖譜；
[0014]圖3:本發(fā)明的Lip3404的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠圖，顯示了如實(shí)施例3所述的黑曲霉轉(zhuǎn)化子的Lip3404的表達(dá)情況；其中泳道I所示為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，由上至下% 116.0 kD，66.2 kD,45.0 kD，35.0kD，25.0kD，18.4kD 和 14.4kD ;泳道 2 所示為黑曲霉宿主在發(fā)酵5 d后的蛋白表達(dá)情況；泳道3所示為L(zhǎng)ip3404的脂肪酶表達(dá)情況，在34kD附近可以看到清晰蛋白條帶；
[0015]圖4:本發(fā)明的脂肪酶的相對(duì)酶活與溫度的曲線圖；
[0016]圖5:本發(fā)明的脂肪酶的相對(duì)酶活與pH的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR B1LOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖儭?br> [0018]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計(jì)數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICT1NARY OF MICROB1LOGY AND MOLECULARB1LOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和COLLINS DICT1NARY B1LOGY (Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般性解釋。
[0019]除非另作說(shuō)明，核酸是按5,至3,方向從左至右書(shū)寫(xiě)；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書(shū)寫(xiě)。
[0020]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酶”即三?；视王；饷?，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。其基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0021]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組”當(dāng)被用于指代細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過(guò)導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過(guò)改變天然核酸或蛋白而被修飾。因此，例如，重組細(xì)胞是表達(dá)在天然(非重組)形式的該細(xì)胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)天然基因。
[0022]術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母或三字母代碼。
[0023]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
[0024]術(shù)語(yǔ)“核酸”包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物。
[0025]術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。
[0026]術(shù)語(yǔ)“載體”指被設(shè)計(jì)用來(lái)將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0027]術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”表示包含DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列被可操縱的連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。
[0028]術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”表示參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的的調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。
[0029]與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比較這兩個(gè)序列時(shí)所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。
[0030]由于遺傳密碼是簡(jiǎn)并的，所以可以使用一種以上的密碼子來(lái)編碼特定的氨基酸，本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸 序列的多核苷酸。
[0031]術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼脂肪酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞核原生質(zhì)體。
[0032]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌”指所有絲狀形式的真菌亞門(mén)生物(參見(jiàn)INTRODUCTORY MY⑶LOGY, 4th Ed.(Alexopoulos, 2007)和 AINSWORTH AND BISBYDICT1NARY OF THE FUNGI, 10th Ed.(Kirk et al.，2008))。這些真菌的特征是帶有由幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營(yíng)養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明所述的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲的延伸來(lái)完成的，碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以使，但不限于，曲霉屬某種(Aspergillus sp.)(例如棒曲霉(A.clavatus)、煙曲霉(A.fumigatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黃曲霉(A.flavus), 土曲霉(A.terreus)和米曲霉(A.0ryzae))、青霉屬某種(Penicillium sp.)(例如產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum))、新薩托菌屬某種(Neosartoryasp.)(例如費(fèi)希新薩托菌(N.fischeri))、粘帚霉菌屬某種(Gl1cladium sp.)(例如粉紅粘帚霉(G.roseum))、木霉屬某種(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T.viride)、康寧木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum))、腐質(zhì)霉屬某種(Humicola sp.)(例如特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens)和灰腐質(zhì)霉(H.grisea))、金孢霉屬某種(Chrysosporium sp.)、鐮刀菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢霉屬某種(Neurospora sp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)的細(xì)胞。
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0034]實(shí)施例1:克隆脂肪酶基因
[0035]使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從黑葡萄穗霉過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。
[0036]以黑葡萄穗霉基因組DNA為擴(kuò)增模板來(lái)擴(kuò)增黑葡萄穗霉中的脂肪酶基因，其中所用到的正向引物P3404-F序列為(下劃線所示序列為AflII酶切位點(diǎn))；
[0037]5' -AACTTAAGATCATGCTGGGCTACATCCTCCTCTC-3'
[0038]反向引物P3404-R序列為(下劃線所示序列為PacI酶切位點(diǎn)):
[0039]5' ~CCTTAATTAATTATTACGCTGCTGGTGC~3/ 。
[0040]將該基因用Phus1n DNA聚合酶(Thermo scientific)從黑葡萄穗霉基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)。
[0041 ] 使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性內(nèi)切酶AflII和PacI (Fermentas)對(duì)純化了的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶Af III和PacI對(duì)質(zhì)粒pGm進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4 DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序(Invitrogen)。
[0042]使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得I個(gè)質(zhì)粒為pGm- Lip3404，測(cè)序結(jié)果的DNA序列為SEQ ID N0:2，去掉內(nèi)含子的編碼區(qū)序列為SEQ ID NO: 3，其翻譯的脂肪酶的序列為SEQ ID NO:1 ;多個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果都—致。
[0043]通過(guò)NCBI中的BLAST進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的脂肪酶為一新的等位基因，與現(xiàn)有的脂肪酶序列有明顯的區(qū)別。
[0044]實(shí)施例2 PEG介導(dǎo) 的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化黑曲霉
[0045]吸取黑曲霉GAPl孢子懸浮液于CMA平板中心(9 cm培養(yǎng)皿)，待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200 mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200 rpm的條件培養(yǎng)11~16h0
[0046]用無(wú)菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無(wú)菌條件下將清洗過(guò)的菌絲體轉(zhuǎn)移到40 mL原生質(zhì)體化溶液，在30°C、200 rpm的條件下溫浴廣2 h，用顯微鏡觀察檢測(cè)原生質(zhì)體化進(jìn)展。
[0047]用無(wú)菌Miracloth濾布過(guò)濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生質(zhì)體溶液分裝于兩個(gè)50 mL無(wú)菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL，在4000 rpm條件下離心8 min以獲得沉淀并棄去上清液。用20 mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于10 mL溶液B中，并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目在IXlO7個(gè)/mL。
[0048]在冰上，將100 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無(wú)菌15 mL離心管中，每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)用I管。加入10 μ g DNA。加入12.5 μ L溶液C，溫和混勻后再冰上放置20 min。
[0049]將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15 mL離心管，并向管中加入I mL溶液C和2 mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì)體混合物。向3個(gè)頂層瓊脂試管中的每一個(gè)中加入I mL上述原生質(zhì)體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上，并將平板在30°C下培養(yǎng)疒10 d。
[0050]溶液A:2.5 mL IM K2HPO4, 2.5 mL IM KH2PO4,48.156 g MgSO4,加入 dlH20 至終體積500 mL，用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0051]溶液B:5 mL IM Tris (pH 7.5)，2.77 g CaCl2,109.32 g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500 mL，用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0052]溶液C:250 g PEG 4000,2.77 g CaCl2, 5 mL IM Tris (pH 7.5)，加入 dlH20 至終體積500 mL，用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0053]原生質(zhì)體化溶液:將0.6 g 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichodermaharzianum, Sigma)溶解于40 mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0054]MMSA 平板:0.59 g 乙酰胺(Sigma)，3.4 g CsCl (Sigma) ,0.52 g KCl, 1.52 gKH2PO4, 218.5 g山梨醇，I ml痕量元素(見(jiàn)下)，20 g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5 mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除菌的25 mL 40%葡萄糖和2.5 mL 20%MgSO4。
[0055]MMSA 頂層瓊脂試管:0.59 g 乙酰胺(Sigma), 3.4 g CsCl (Sigma), 0.52 g KCl,
1.52 g KH2PO4, 218.5 g山梨醇，I ml痕量元素(見(jiàn)下)，10 g低熔點(diǎn)瓊脂糖，加入dlH20至終體積972.5 mL,高壓蒸汽滅菌后，在培養(yǎng)基未凝固時(shí)，加入用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除菌的25 mL 40%葡萄糖和2.5 mL 20% MgSO4,之后立即分裝于無(wú)菌試管中，每管10 mL。
[0056]痕量兀素:在250 mL dlH20 中加入 I g FeSO4.7H20,8.8 g ZnSO4.7H20,0.4 gCuSO4.5Η20，0.15 g MnSO4.4Η20，0.1 g Na2B4O7.1OH2O, 50 mg (NH4)6 Mo7O24.4Η20，0.2 mL濃HCl，完全溶解后用dlH20定容至I L，用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除菌。 [0057]CMA平板:20 g葡萄糖，20 g麥芽浸出物，I g蛋白胨，15 g瓊脂，加入dlH20至終體積1000 mL,高壓蒸氣滅菌。
[0058]CMA液體培養(yǎng)基:20 g葡萄糖，20 g麥芽浸出物，I g蛋白胨，加入dlH20至終體積1000 mL,高壓蒸氣滅菌。
[0059]實(shí)施例3:表達(dá)黑葡萄穗霉脂肪酶Lip3404的黑曲霉的發(fā)酵和酶的表達(dá)
[0060]將表達(dá)本發(fā)明脂肪酶的黑曲霉Lip3404轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液接種于30 mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200 rpm的條件下培養(yǎng)5 d。所得發(fā)酵液用8層紗布過(guò)濾，濾液在14000Xg條件下離心10 min，收集上清液。所得上清液即為L(zhǎng)ip3404脂肪酶酶液。將酶液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳(圖3)。
[0061]TSB 發(fā)酵培養(yǎng)基:12 g NaNO3,0.5 g KCl, 1.5 g KH2PO4, 2.05 g MgSO4.7Η20，3.5 gNaH2PO4.H20,45 g胰蛋白大豆肉湯，70 g檸檬酸鈉，I g吐溫80，I mL痕量元素(見(jiàn)下)，加入dlH20至終體積700 mL,高壓蒸氣滅菌后加入300 mL用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除
菌的40%麥芽糖。
[0062]痕量元素:在250 mL dlH20 中加入 I g FeSO4.7H20，8.8 g ZnSO4.7H20，0.4 gCuSO4.5Η20，0.15 g MnSO4.4Η20，0.1 g Na2B4O7.1OH2O, 50 mg (NH4)6 Mo7O24.4Η20，0.2 mL濃HCl，完全溶解后用dlH20定容至I L，用0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0063]實(shí)施例4:本發(fā)明脂肪酶的應(yīng)用效果測(cè)試
[0064]一、實(shí)驗(yàn)樣品
[0065]㈠脂肪酶樣品及酶活
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪酶，所述的脂肪酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.用于編碼權(quán)利要求1所述的脂肪酶的基因，其序列為SEQID N0:2。
3.一種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒攜帶序列為SEQ ID NO: 3 的 DNA 片段。
4.權(quán)利要求1所述的脂肪酶的生產(chǎn)方法，是在曲霉細(xì)胞中生產(chǎn)的。
5.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，是將權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)曲霉宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)的。
6.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的曲霉細(xì)胞為黑曲霉細(xì)胞。
7.—種酶組 合物，所述的酶組合物包含有權(quán)利要求1所述的脂肪酶。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK104031899SQ201310069500
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月5日
【發(fā)明者】王華明, 訾禎禎, 陳志兵 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所, 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司