突變型OsGBSS1酶及其制備方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種顆粒結合淀粉合成酶，該酶在對應于SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列的一個或多個選自下組的氨基酸位點中發(fā)生突變：H236、N265、Y268、N353、R408、E410、K413、C487、A114、EA314-315和T543，所述酶的比酶活性顯著降低。因此，本發(fā)明揭示特定氨基酸殘基與直鏈淀粉含量的關系，從而能調節(jié)水稻中直鏈淀粉含量，進而可用于改善稻米的食用品質。
【專利說明】突變型OsGBSSI酶及其制備方法與用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及酶學領域。具體地說，本發(fā)明涉及突變型OsGBSSI (顆粒結合淀粉合成酶1，2.4.1.242)以及利用該酶改善大米中直鏈淀粉含量的方法及其應用。
【背景技術】
[0002]禾谷類作物是我國的主要糧食作物。其中，水稻(Oryza sativa)是重要的禾谷類作物，有秈粳之分，秈包括秈稻和秈糯，粳包括粳稻和粳糯。稻米供人類食用的主要部分是胚乳中的淀粉，淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉。糯稻與非糯稻的區(qū)別在于胚乳的淀粉組成比例不同，非糯型的水稻直鏈淀粉含量較高，在10-30wt%之間；糯型的水稻直鏈淀粉含量則低于3wt%。在表觀上非糯 型的米粒色澤呈透明或淺透明狀，用碘-碘化鉀對米粒橫切面進行染色，呈蘭色；糯型的米粒色澤呈蠟質狀，用碘-碘化鉀染色，呈橙黃色。水稻胚乳中的直鏈淀粉含量和膠稠度是稻米品質評價中的重要指標。
[0003]直鏈淀粉是在ADP-Glc焦磷酸化酶(AGPase)和Wx基因編碼的OsGBSSI [I, 2]的作用下合成的。Wx基因的表達水平、OsGBSSI的活性與AC呈顯著正相關[1，3，4]。根據直鏈淀粉含量的不同一般將水稻分為四類:極低直鏈淀粉含量品種、低直鏈淀粉含量品種、中等直鏈淀粉含量品種和高直鏈淀粉含量品種[5]。
[0004]影響大米蒸煮和食用品質的關鍵因素包括:直鏈淀粉含量(AC)、膠稠度以及糊化溫度[6]。這其中膠稠度和糊化溫度兩項參數也與直鏈淀粉含量有一定的相關性，因為這兩項流變力學特征決定于支鏈淀粉結構，尤其是短支鏈與長支鏈的比例[7]。OsGBSSI同時負責支鏈淀粉中超長鏈的延伸[8]。所以，通過調節(jié)Wx基因的表達或活性水平可以在影響AC的同時，決定蒸煮和食用品質的不同。
[0005]一般而言，高直鏈淀粉含量的稻米其食用品質會降低，而這一現象也廣泛存在于在中國種植的雜交秈稻中。研究人員正努力在降低大米AC保證食用品質的同時保證其高產。目前有三種降低AC的方法。(I)通過引入反義鏈降低WxmRNA的表達量[9，10] ; (2)通過調節(jié)啟動子的活性。例如利用dsRNAi方法抑制一個可以結合到Wx基因啟動子上的一段特異31bp片段上的轉錄因子0sBP-5來達到降低OsGBSSI表達的目的[11] ； (3)降低Wx基因pre-mRNA的剪接效率。例如將剪接因子du_l或du_2突變后，由于Wx的異常剪接造成OSGBSSI成熟蛋白質含量降低，直接造成直鏈淀粉含量降低[12，13]。RNA介導的RNA沉默機制的發(fā)現并應用，為包括直鏈淀粉含量的控制提供了一種直接途徑。但通過dsRNAi對基因表達的抑制作用只能定性而并不能精確地對其產生的作用進行定量，這也在一定程度上阻礙了其在水稻育種品質改良上的應用。此外，上述方法都建立在Wx的表達在轉錄和轉錄后受到調控的理論基礎上，并沒有系統研究直接改變OsGBSSI酶活性的諸方面。
[0006]自然界的眾多水稻品種提供了一個很大的水稻品質庫，Wx基因在眾多水稻品種中也存在很多自然突變。Wx基因本身存在產生不同突變進而影響水稻淀粉品質的潛能[4]。由于這些水稻品種之間存在遺傳背景上的不同，因此這些自然突變是否就是造成它們之間AC不同的唯一原因就不得而知。[0007]因此，為本領域急需從OsGBSSI本身入手，系統研究如何改變其活性，例如通過突變其氨基酸序列改變其活性，進而改善水稻以及所得大米的品質。

【發(fā)明內容】
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種活性改變的顆粒結合淀粉合成酶并揭示特定氨基酸殘基與直鏈淀粉含量的關系，進而用于調節(jié)水稻中直鏈淀粉含量以及改善稻米的食用品質。
[0009]在第一方面，本發(fā)明提供一種顆粒結合淀粉合成酶，所述酶在對應于SEQ IDNOil所示氨基酸序列的一個或多個選自下組的氨基酸位點中發(fā)生突變:
[0010](a)H236、N265、Y268、N353、R408、E410、K413 或 C487 ；
[0011](b)A114、EA314-315 或 T543 ;或
[0012](c)上述(a)或(b)的任意組合。
[0013]在優(yōu)選的實施方式中，所述突變是選自下組的突變:(1)非極性氨基酸替代極性氨基酸，優(yōu)選以A替代；(2)改變主鏈的碳鏈長度；或(3)改變氨基酸上的R基團。
[0014]在另一優(yōu)選的實施方式中，所述突變是:H236Y、N265D、Y268F、Y268W、N353A、R408A、E410D、E410Q、C487A、K413A、A114S、EA314-315QT 或 T543A。
[0015]在優(yōu)選的實施方式中，所述顆粒結合淀粉合成酶的比酶活降低10%_100%。
[0016]在第二方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明第一方面所述顆粒結合淀粉合成酶的多核苷酸。
[0017]在第三方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第二方面所述多核苷酸的表達載體。
[0018]在第四方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第二方面所述多核苷酸或本發(fā)明第三方面所述表達載體的植物細胞。
[0019]在第五方面，本發(fā)明提供一種調節(jié)顆粒結合淀粉合成酶活性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0020](I)將待調節(jié)活性的顆粒結合淀粉合成酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作序列比對；
[0021](2)根據調節(jié)需要從下表中選擇相應的位點進行突變:
[0022]
【權利要求】
1.一種顆粒結合淀粉合成酶，其特征在于，所述酶在對應于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一個或多個選自下組的氨基酸位點中發(fā)生突變: (a)H236、N265、Y268、N353、R408、E410、K413或 C487 ； (b)A114、EA314-315或 T543 ;或 (c)上述(a)或(b)的任意組合。
2.如權利要求1所述的顆粒結合淀粉合成酶，其特征在于，所述突變是:H236Y、N26?、Y268F、Y268W、N353A、R408A、E410D、E410Q、C487A、K413A、A114S、EA314-315QT 或 T543A。
3.編碼權利要求1或2所述顆粒結合淀粉合成酶的多核苷酸。
4.包含權利要求3所述多核苷酸的表達載體。
5.包含權利要求3所述多核苷酸或權利要求4所述表達載體的植物細胞。
6.一種調節(jié)顆粒結合淀粉合成酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將待調節(jié)活性的顆粒結合淀粉合成酶的氨基酸序列與SEQID NO:1所示氨基酸序列作序列比對； (2)根據調節(jié)需要從下表中選擇相應的位點進行突變:
7.一種制備顆粒結合淀粉合成酶活性受調節(jié)的轉基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (I)將待調節(jié)活性的顆粒結合淀粉合成酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作序列比對； (2)根據調節(jié)需要從下表中選擇相應的位點進行突變:
8.調節(jié)水稻中直鏈淀粉含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將待調節(jié)直鏈淀粉含量的水稻植株的OsGBSSI的氨基酸序列與SEQID NO:1所示氨基酸序列作序列比對； (2)根據調節(jié)需要從下表中選擇相應的位點:
9.一種生產直鏈淀粉含量受調節(jié)的稻米的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)培養(yǎng)權利要求7所得的轉基因水稻；和 (2)獲得所述轉基因水稻產生的稻米。
10.如權利要求1所述的顆粒結合淀粉合成酶或權利要求3所述的編碼多核苷酸的用途，其特征在于，所述酶在對應于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一個或多個選自Α114、ΕΑ314-315或Τ543的氨基酸位點中發(fā)生突變，所述顆粒結合淀粉合成酶或其編碼多核苷酸作為分子標記用于制備通過特異性識別Α114、ΕΑ314-315或Τ543位點的氨基酸突變來鑒別水稻品種的試劑或試劑盒。
11.一種鑒別水稻品種的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)鑒定待鑒別水稻的GBSSl氨基酸序列中Α114、ΕΑ314-315或Τ543位點的氨基酸、GBSSl比酶活或該水稻的直鏈淀粉含量； (2)根據下表判斷所鑒別的水稻屬于下表中哪一品種。
【文檔編號】C12N5/10GK103695381SQ201310069961
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年3月5日 優(yōu)先權日:2013年3月5日
【發(fā)明者】蔡秀玲, 劉德瑞 申請人:中國科學院上海生命科學研究院