具有高木糖消耗率的分離酵母菌株和使用所述菌株產(chǎn)生乙醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明利用克隆和轉(zhuǎn)化技術(shù)結(jié)合突變和菌株馴化技術(shù)來獲得具有高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的酵母。用于本發(fā)明中的所述克隆和轉(zhuǎn)化可將木糖代謝基因轉(zhuǎn)化到酵母中以解決一些酵母菌株無法利用木糖產(chǎn)生乙醇的問題。用于本發(fā)明中的所述突變和菌株馴化可提高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率以解決低消耗率和產(chǎn)率的問題。通過組合上文所提及的技術(shù)手段，本發(fā)明意外地獲得具有高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的突變體。
【專利說明】具有高木糖消耗率的分離酵母菌株和使用所述菌株產(chǎn)生乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及具有高木糖消耗率的分離酵母菌株和產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵方法。具體來說，本發(fā)明提供具有高木糖消耗率的酵母屬(Saccharomyces)菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]過去數(shù)十年間對傳統(tǒng)石化燃料(以石油為主的燃料)的大規(guī)模消費已付出了很高的代價并造成大量污染。而且，人們已認識到世界石油儲量并非無窮無盡，且隨著環(huán)境意識逐漸成長，已刺激人們開始研究替代性燃料的可行性，例如纖維乙醇，其可降低CO2產(chǎn)生。
[0003]目前用于產(chǎn)生乙醇的方法包括以下操作階段:(a)使適當(dāng)原材料發(fā)酵以獲得發(fā)酵產(chǎn)物和(b)蒸餾通過發(fā)酵獲得的產(chǎn)物，藉此產(chǎn)生乙醇。目前主要使用屬于酵母屬的酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為乙醇發(fā)酵的種菌。釀酒酵母細胞為圓形到卵形，直徑為5 - 10微米且可有效利用己糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖等。上文所提及的發(fā)酵方法包括在含有氮源、碳源和微量元素等的培養(yǎng)基中接種釀酒酵母且在適當(dāng)條件下執(zhí)行發(fā)酵，且其涉及化學(xué)反應(yīng)=C6H12O6 — 2CH3CH20H+2C02。
[0004]可使用各種生質(zhì)原料進行酒精生產(chǎn)。用于通過發(fā)酵制造乙醇的多種多樣的原材料可方便地分類為三種類型的農(nóng)業(yè)原材料:糖、淀粉和木質(zhì)纖維素材料。盡管生質(zhì)乙醇可通過多種不同來源獲得的糖或淀粉發(fā)酵來產(chǎn)生，但迄今為止，用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)燃料酒精的底物是蔗糖和玉米淀粉。使用糖或淀 粉來生產(chǎn)乙醇的技術(shù)已發(fā)展成熟；然而，所述底物成本高，其可能與食品供應(yīng)競爭且從所述來源生產(chǎn)乙醇不足以滿足未來對燃料工業(yè)的需求。因此，業(yè)內(nèi)對從木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的興趣逐漸增加。由于木質(zhì)纖維素可再生，資源豐富，不與食品供應(yīng)競爭且可以相對較低的成本獲得，所以木質(zhì)纖維素是諸如玉米粒等其它乙醇原料的合意替代品。擴大燃料乙醇生產(chǎn)要求能使用較低成本的原料。目前，只有木質(zhì)纖維素原料可從植物生物質(zhì)獲得足夠數(shù)量來代替用于生產(chǎn)乙醇的作物。木質(zhì)纖維素材料中的主要可發(fā)酵糖是葡萄糖和木糖，其分別占木質(zhì)纖維素的約40%和25%。
[0005]然而，大多數(shù)能進行酒精發(fā)酵的酵母(如釀酒酵母)不能使用木糖作為碳源。工業(yè)為了能從木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇，需要具有這些特性的生物體?？茖W(xué)家利用遺傳技術(shù)或菌株馴化來改良用于產(chǎn)生乙醇的酵母或細菌的木糖發(fā)酵。US5789210提供能有效使單獨的木糖發(fā)酵或同時使木糖與葡萄糖發(fā)酵的酵母菌株，其可使用重組DNA和基因克隆技術(shù)來產(chǎn)生,且所述技術(shù)已用于產(chǎn)生含有克隆木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XD)和木酮糖激酶(XK)基因的重組酵母，所述基因與不受葡萄糖的存在抑制的啟動子融合。US6582944涉及經(jīng)木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的新穎重組酵母菌株，其能將木糖還原為木糖醇并因此能在活體內(nèi)產(chǎn)生木糖醇。伯恩(Bjorn)等人提供酵母菌株TMB3001，其通過用木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化來解決不能代謝木糖以產(chǎn)生乙醇的問題(伯恩J(Biorn J)、巴貝HH(Barbel HH).非氧化性磷酸戊糖途徑控制木糖的發(fā)酵速率但不控制 TMB3001 中的木糖(The non-oxidative pentose phosphate pathway controls thefermentation rate of xylose but not of xylose in TMB3001), 2002,歐洲微生物學(xué)會聯(lián)合會酵母研究(FEMS Yeast Research) 2:227-282)。然而，其仍具有以下問題:木糖消耗率低(0.13g木糖/g生物質(zhì)/小時)和乙醇產(chǎn)率低(0.15g產(chǎn)物/g所消耗木糖)。為解決這些問題，約翰松(Johansson)等人另外將轉(zhuǎn)醛醇酶基因轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中以獲得新菌株TMB3026，其可將木糖消耗率從0.12提高到0.23。(伯恩J，巴貝HH.非氧化性磷酸戊糖途徑控制木糖的發(fā)酵速率但不控制TMB3001中的木糖，2002，歐洲微生物學(xué)會聯(lián)合會酵母研究2:227-282);然而，仍未滿足對工業(yè)生產(chǎn)的要求。凱撒(Kaisa)等人另外產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母TMB3057，其改良木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶以及缺失的醛糖還原酶基因(GR3)的基因表達，從而提高乙醇產(chǎn)率并降低木糖醇副產(chǎn)物的形成(凱撒K、羅曼F (Romain F)、巴貝HH、瑪麗GG (Marie GG).木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的高活性通過重組釀酒酵母改良木糖發(fā)酵(High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improvesxylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae), 2007,應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.73:1039-1046))。然而，此菌株仍具有木糖消耗率低(0.25g木糖/g生物質(zhì)/小時)和乙醇產(chǎn)率低(0.27g產(chǎn)物/g所消耗木糖)的問題。此外，伊麗莎白(Elizebath)等人使用基因經(jīng)修飾的酵母424A(LNH-ST)，其經(jīng)粗糙鏈孢霉(N.crassa)和近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)的木糖還原酶基因以及樹干畢赤酵母(P.stipitis)的木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化且具有三個氨基酸的優(yōu)化密碼子(伊麗莎白C、米洛斯拉夫 S.(Miroslav S.)、南希 W YH (Nancy W YH)、內(nèi)森 SM (Nathan SM),乙酸和 pH 對葡萄糖與木糖通過遺傳改造的釀酒酵母菌株共發(fā)酵為乙醇的效應(yīng)(Effect of acetic acidand pH on the cofermentation of glucose and xylose to ethanol by a geneticallyengineered strain of Saccharomyces cerevisiae), 2010,歐洲微生物學(xué)會聯(lián)合會酵母研究10:385-393)。此菌株也利用GAPDH啟動子來控制TKLl、TALl、RKLl和RPEl的磷酸戊糖途徑。然而，其仍具有以下問題:木糖消耗率低(在PH5下0.27g木糖/g生物質(zhì)/小時)和乙醇產(chǎn)率低(0.785g產(chǎn)物/g所消耗木糖)和對乙酸的耐受性低(在培養(yǎng)基含有l(wèi)g/L乙酸時，木糖消耗率從0.354降低到015)。
`[0006]因此，業(yè)內(nèi)非常需要生物質(zhì)(例如木糖)到乙醇的轉(zhuǎn)化率改良的菌株和以較高產(chǎn)率產(chǎn)生乙醇的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供分離酵母菌株，其木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物質(zhì)/小時且包含一種或一種以上得自DSMZ保藏號25508的釀酒酵母菌株FENC-OOO的木糖代謝基因。
[0008]本發(fā)明另外提供產(chǎn)生乙醇的方法，其包含以下步驟:(a)在適宜發(fā)酵條件下用本發(fā)明的分離酵母菌株使含有木糖或葡萄糖來源的培養(yǎng)基發(fā)酵；和(b)從所述培養(yǎng)基回收乙醇。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1顯示實例2中所提及不同菌株的木糖消耗率。
[0010]圖2顯示實例3中所提及釀酒酵母突變株的木糖消耗率?！揪唧w實施方式】
[0011]本發(fā)明利用克隆和轉(zhuǎn)化技術(shù)以及突變和菌株馴化技術(shù)來獲得具有高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的酵母。用于本發(fā)明中的克隆和轉(zhuǎn)化可將木糖代謝基因轉(zhuǎn)化到酵母中以解決一些酵母菌株無法利用木糖產(chǎn)生乙醇的問題。用于本發(fā)明中的突變和菌株馴化可提高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率以解決消耗率和產(chǎn)率低的問題。通過組合上文所提及的技術(shù)手段，本發(fā)明意外地獲得具有高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的突變株。
[0012]提供以下術(shù)語和方法的解釋以更好地闡述本發(fā)明并引導(dǎo)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員實踐本發(fā)明。除非上下文明確指示其它含義，否則本文所用“包含”意指“包括”且單數(shù)形式“一(a或an)”或“所述”包括復(fù)數(shù)含義。除非上下文明確指示其它含義，否則術(shù)語“或”是指所述二選一要素或兩個或兩個以上要素的組合中的單一要素。
[0013]除非 另有解釋，否則本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解相同的意義。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述方法和材料類似或等效的方法和材料，但下文闡述適宜的方法和材料。材料、方法和實例僅具有說明性而不打算進行限制。從以下詳細說明和權(quán)利要求書可顯而易知本發(fā)明的其它特征。
[0014]本文所用術(shù)語“產(chǎn)率”是指相對于起始材料的量的所產(chǎn)生產(chǎn)物的量。
[0015]本文所用術(shù)語“菌株”是指具有共同特征的一種特定物種的微生物。除非指示相反含義，否則術(shù)語“菌株”與“細胞”在本文中可互換使用。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，微生物菌株是由個別酵母細胞構(gòu)成。另外，個別微生物細胞具有特定特征，所述特征可將所述細胞鑒別為其特定菌株的成員。
[0016]本文所用術(shù)語“親本株”是指經(jīng)歷誘變以產(chǎn)生本發(fā)明微生物的微生物菌株。因此，詞組“親本株”的使用不一定等同于詞組“野生型”或提供關(guān)于所提及菌株的歷史的信息。
[0017]本文所用術(shù)語“突變”是指核酸分子中的插入、缺失或取代。
[0018]本文所用術(shù)語“誘變”是指一種方法，通過這種方法可在生物體的遺傳材料(例如DNA)中產(chǎn)生一個或一個以上突變。使用“隨機”誘變時，無法預(yù)測確切的突變位點，其出現(xiàn)于微生物染色體中的任何位置。
[0019]本文所用詞組“誘變循環(huán)”一般是指用誘變劑或誘變劑的組合處理細胞，之后培養(yǎng)所述細胞以使存活細胞可繁殖。在多種情形下，將在每一誘變循環(huán)后篩選經(jīng)誘變細胞以鑒別那些具有特定特征的細胞。另外，作為誘變循環(huán)的一部分，可在誘變后即刻或在仍暴露于誘變劑中時，使經(jīng)誘變劑處理的細胞暴露于選擇劑或選擇培養(yǎng)基中。
[0020]本文所用術(shù)語“適宜發(fā)酵條件” 一般是指可以pH、溫度、通氣量等調(diào)節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件，優(yōu)選地，最適條件使得微生物可產(chǎn)生所關(guān)注的碳基產(chǎn)物。為確定培養(yǎng)條件是否允許產(chǎn)生產(chǎn)物，可將微生物在接種后培養(yǎng)約24小時到一周且可獲得并分析樣品。測試合意產(chǎn)物在樣品細胞中或在生長細胞的培養(yǎng)基中的存在。
[0021]根據(jù)上述說明，本發(fā)明提供分離酵母菌株，其木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物質(zhì)/小時且包含一種或一種以上得自DSMZ保藏號25508的釀酒酵母菌株FENC-OOO的木糖代謝基因。在一優(yōu)選實施例中，分離酵母菌株是具有DSMZ保藏號25508的釀酒酵母FENC-OOO的分離菌株。
[0022]在一實施例中，本發(fā)明酵母菌株展現(xiàn)高木糖消耗率；優(yōu)選地高于1.1g木糖/g生物質(zhì)/小時。更優(yōu)選地，木糖消耗率高于1.5g木糖/g生物質(zhì)/小時。[0023]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明酵母菌株包括(但不限于)酵母屬菌株、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)菌株、畢赤酵母屬(Pichia)菌株和假絲酵母屬(Candida)菌株。更優(yōu)選地，本發(fā)明酵母菌株包括(但不限于)釀酒酵母菌株、卡爾斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)菌株、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)菌株、巴尼特酵母(Saccharomyces barnetti)菌株、少抱酵母(Saccharomyces exiguus)菌株、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)菌株、卡爾斯伯酵母菌株、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)菌株、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株、真菌克魯維酵母(Kluyveromyces fungus)菌株、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)菌株、星形假絲酵母(Candida stellata)菌株和休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)菌株。最優(yōu)選地,本發(fā)明提供具有DSMZ保藏號25508的釀酒酵母FENC-OOO的分離菌株。
[0024]木糖是可由多種生物體分解代謝或代謝為可用產(chǎn)物的五碳醛糖(戊糖，單糖)。根據(jù)本發(fā)明，木糖代謝基因包括一種或一種以上選自由以下組成的群組的基因:木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因、木酮糖激酶基因和木糖異構(gòu)酶。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明酵母菌株是基于遺傳克隆、轉(zhuǎn)化、誘變、誘變循環(huán)和菌株馴化來產(chǎn)生。在一實施例中，本發(fā)明酵母菌株是通過克隆木糖代謝基因和將這些基因轉(zhuǎn)化到親本株中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化菌株來產(chǎn)生?？蓸?gòu)筑載有抗生素抗性標(biāo)記基因(例如kan，其編碼卡那霉素(kanomycin)抗性)的質(zhì)粒并使用其作為載體來將合意木糖代謝基因遞送到染色體中。木糖代謝基因可通過用適宜限制性酶消化來分離并將其純化，且隨后通過轉(zhuǎn)化或電穿孔將其引入宿主細胞中。在本發(fā)明一實施例中，釀酒酵母BCRC22743是用于轉(zhuǎn)化的宿主。
[0026]之后，用誘變劑使經(jīng)轉(zhuǎn)化菌株突變。本發(fā)明并不限于展現(xiàn)高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的細胞。換句話說，本發(fā)明包括特征為在培養(yǎng)生長指定時間段時能大量消耗木糖的細胞。在具體實施例中，本發(fā)明菌株是通過以下方式產(chǎn)生:使染色體上含有相關(guān)木糖代謝基因的酵母細胞在非天然啟動子控制下經(jīng)歷I個、2個、3個、4個、5個或更多個循環(huán)的誘變，隨后篩選以鑒別顯示高木糖消耗率的細胞。
[0027]業(yè)內(nèi)已知眾多種執(zhí)行誘變的方法且其可用于產(chǎn)生本發(fā)明的細菌菌株。一般來說，這些方法涉及使用化學(xué)試劑或輻射來誘導(dǎo)突變。用于誘變程序中的化合物類別的實例包括(但不限于)甲烷磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-亞硝基脲N-亞硝基-N，N- 二乙胺(NDEA)和N-乙基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(ENNG)、羥胺、亞硫酸氫鹽和硝基呋喃(例如7-甲氧基-2-硝基萘并[2，Ι-p]呋喃)，業(yè)內(nèi)已知其可誘導(dǎo)核酸分子突變。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可了解如何調(diào)節(jié)誘變劑的濃度和/或特定條件以達成合意突變率。
[0028]在細胞經(jīng)歷誘變后，可對其進行篩選以確定其是否具有如本發(fā)明所述的特定特征。所述特征的實例包括高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率。本發(fā)明菌株可通過使用多個誘變和篩選的循環(huán)來產(chǎn)生。在每次誘變處理后，可針對提高的木糖消耗率篩選經(jīng)誘變細胞。
[0029]根據(jù)上述說明，本發(fā)明提供產(chǎn)生乙醇的方法，其包含以下步驟:(a)在適宜發(fā)酵條件下用本發(fā)明的分離酵母菌株使含有木糖或葡萄糖來源的培養(yǎng)基發(fā)酵；和(b)從所述培養(yǎng)基回收乙醇。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，使用本發(fā)明的分離酵母菌株來使包含木糖或葡萄糖來源的碳源發(fā)酵。木糖或葡萄糖來源可為木糖或葡萄糖本身或可為包含木糖或葡萄糖單元的任何碳水化合物寡聚物或多聚物，例如木質(zhì)纖維素、木聚糖、纖維素、淀粉和諸如此類。對于從所述碳水化合物釋放木糖或葡萄糖單元，可將適當(dāng)碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和諸如此類)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，或可通過經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞來產(chǎn)生所述酶。在后一情形下，經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞可經(jīng)遺傳改造以產(chǎn)生并分泌所述碳水化合物酶。在一優(yōu)選方法中，經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞使木糖和葡萄糖二者發(fā)酵。除了作為碳源的木糖(和葡萄糖)來源外，發(fā)酵培養(yǎng)基將另外包含經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞生長所需的適當(dāng)成份。業(yè)內(nèi)非常熟悉用于諸如酵母等微生物生長的發(fā)酵培養(yǎng)基的組合物。
[0031]發(fā)酵方法是用于產(chǎn)生諸如以下等發(fā)酵產(chǎn)物的方法:乙醇、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、檸檬酸、3-羥基-丙酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素(例如青霉素G(Penicillin G)或青霉素V和其發(fā)酵衍生物)和頭孢菌素。發(fā)酵方法可為好氧或厭氧發(fā)酵方法。厭氧發(fā)酵方法在本文中定義為在不存在氧的情況下運行或?qū)嵸|(zhì)上不耗氧(例如小于5mmol/L/h)的發(fā)酵方法，且其中有機分子用作電子供體和電子受體二者。在不存在氧的情況下，無法通過氧化磷酸化來氧化在糖酵解和生物質(zhì)形成中產(chǎn)生的NADH。為解決此問題，許多微生物使用丙酮酸鹽或其衍生物中的一種作為電子和氫受體，由此使NAD+再生。因此，在優(yōu)選厭氧發(fā)酵方法中，使用丙酮酸鹽作為電子(和氫受體)且將其還原為諸如以下等發(fā)酵產(chǎn)物:乙醇、乳酸、1，3-丙二醇、乙烯、乙酸或琥珀酸。
[0032]發(fā)酵方法優(yōu)選地在最適于經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞的溫度下運行。因此，對于大多數(shù)酵母，在低于38°C的溫度下執(zhí)行發(fā)酵方法。對于酵母或絲狀真菌宿主細胞，優(yōu)選地在低于37、36、35、34、33、32、31、30、29或28°C的溫度下且在高于20、21、22、23、24或25°C的溫度下執(zhí)行發(fā)酵方法。
[0033]根據(jù)本發(fā)明，在所述方法中，乙醇容積生產(chǎn)率優(yōu)選地為至少0.6g乙醇/升/小時；優(yōu)選地至少0.7g乙醇 /升/小時、0.8g乙醇/升/小時、0.9g乙醇/升/小時、1.0g乙醇/升/小時、1.1g乙醇/升/小時、1.5g乙醇/升/小時、2.0g乙醇/升/小時、2.5g乙醇/升/小時、3.0g乙醇/升/小時、3.5g乙醇/升/小時、4.0g乙醇/升/小時、4.5g乙醇/升/小時或5.0g乙醇/升/小時；更優(yōu)選地約0.6g乙醇/升/小時到約2.5g乙醇/升/小時，或約1.0g乙醇/升/小時到約3.0g乙醇/升/小時。在方法中基于木糖和/或葡萄糖的乙醇產(chǎn)率優(yōu)選地為至少50%、60%、70%、80%、90%、95或98%。
[0034]分離酵母菌株具有意外的木糖消耗率和高乙醇產(chǎn)率，因此所述酵母菌株有利于通過發(fā)酵方法產(chǎn)生乙醇。
[0035]SM
[0036]實例I木糖代謝基因的克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)筑
[0037]培養(yǎng)30個得自食品工業(yè)發(fā)展研究所(FoodIndustry Research and DevelopmentInstitute, FIRDI)的野生型菌株并使用含有10%乙醇的SX培養(yǎng)基進行選擇，且選擇一個對高含量乙醇具有高耐受性的菌株，即釀酒酵母BCRC22743。在以下條件下使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來克隆以下基因:
[0038]l.pGK 啟動子
[0039]長度:643bp
[0040]類型:DNA
[0041]原始菌株:釀酒酵母[0042]基因注釋:pGK啟動子
[0043]正向引物:GACTACGCATGCGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTC(SEQID NO:1)
[0044]反向引物:TGAATTACTGAACACAACATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG(SEQ ID NO:2)
[0045]2.木糖還原酶
[0046]長度:957bp
[0047]類型:DNA
[0048]原始菌株:樹干畢赤酵母
[0049]基因注釋:木糖還原酶
[0050]正向引物:AAAACAATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCT(SEQ ID NO: 3)
[0051 ]反向引物:CAATTCAATTCAATTTAGACGAAGATAGGAATCTTGTC (SEQ ID NO:4)
[0052]3.木糖醇脫氫酶
[0053]長度:l，092bp
[0054]類型:DNA
[0055]原始菌株:樹干畢赤酵母
[0056]基因注釋:木糖醇脫氫酶
[0057]正向引物:GACTACGCGGCCGCGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTC(SEQIDNO:5)
[0058]反向引物:AAGGAAGGGTTAGCAGTCATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG(SEQID NO:6)
[0059]4.木酮糖激酶
[0060]長度:l，803bp
[0061]類型:DNA
[0062]原始菌株:釀酒酵母
[0063]基因注釋:木酮糖激酶
[0064]正向引物:AAAACAATGT TGTGTTCAGTAATTCAGAG(SEQID NO:7)
[0065]反向引物:CAATTCAATTCAATTTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTCG(SEQIDNO:8)
[0066]5.DGK 終丨 h子
[0067]長度:433bp
[0068]類型:DNA
[0069]原始菌株:釀酒酵母
[0070]基因注釋:pGK終止子
[0071 ]正向引物:GACTCTCATCTAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAG (SEQ IDNO: 9)
[0072]反向引物:
[0073]TAGAGTCCCGGGAGTCTGCTCGAGGAGATGCGGCCGCGACTTTTTTTGTTGCAAGTGGGAT(SEQ IDNO:10)
[0074]使用業(yè)內(nèi)已知的遺傳改造技術(shù)將經(jīng)克隆基因引入pAURlOl質(zhì)粒中以構(gòu)筑重組載體[李L(Li L)、舒秋 C(Shuqiu C)、安雅 J VB (Anja J VB)、埃里克 BK (Eric BK).通過經(jīng)修飾單鏈寡核苷酸載體引導(dǎo)的Rad51p和Rad54p而非Rap52p在釀酒酵母中提升基因修復(fù)(Rad51p and Rad54p, but not Rap52p, elevate gene repair in Saccharomycescerevisiae directed by modified single-stranded oligonucleotide vectors), 2002,核酸研究(Nucleic Acids Research) 30:2742-2750]。處理釀酒酵母 BCRC22743 以形成感受態(tài)細胞且用重組載體轉(zhuǎn)化，從而使得可將木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因引入釀酒酵母BCRC22743的基因組DNA中。選擇所得轉(zhuǎn)化株以獲得能使用木糖并產(chǎn)生乙醇的經(jīng)轉(zhuǎn)化菌株。
[0075]實例2所選轉(zhuǎn)化株的木糖代謝和乙醇產(chǎn)生
[0076]根據(jù)實例I中所述的程序從1，000多個釀酒酵母轉(zhuǎn)化株中選擇5個能使用木糖并產(chǎn)生乙醇的經(jīng)轉(zhuǎn)化菌株，并將其命名為釀酒酵母RG352、釀酒酵母RG758、釀酒酵母RG316、釀酒酵母RG527和釀酒酵母RG589。在所選菌株中，釀酒酵母RG589能在5%SX培養(yǎng)基中產(chǎn)生最高乙醇濃度(16g/L)且達成0.21g木糖/g生物質(zhì)/小時的木糖消耗率。然而，上文所提及的結(jié)果優(yōu)于菌株TMB3001，但與菌株TMB3026、TMB3057和424A (LNH-ST)無顯著差異。比較木糖消耗率展示于圖1中。
[0077]實例3釀酒酵母RG589突變株的制備
[0078]用甲磺酸乙酯(EMS)溶液將釀酒酵母RG589細胞處理20分鐘以獲得突變株。將所得溶液離心并移除上清液。將殘留細胞沉淀用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6)洗滌兩次。在適當(dāng)稀釋后，將細胞接種于5%SX培養(yǎng)基(4.7g/L酵母氮源基礎(chǔ)和50g/L木糖)中并在30°C和200rpm振蕩下培養(yǎng)。如果在50g/L木糖濃度下培養(yǎng)的突變株可利用木糖來維持、生長、代謝并產(chǎn)生乙醇，則其使用木糖的能力更佳。在50g/L木糖濃度下將突變株培養(yǎng)三天后，取出突變株且隨后將上文所提及的突變和培養(yǎng)方法執(zhí)行二十次。將所得突變株平鋪于SX培養(yǎng)基板上以供突變株選擇。在兩天后，選擇快速生長的突變株并命名為釀酒酵母FENC-OOO，其由德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZelIkulturen，DSMZ)以保藏號25508來保藏。在將所選突變株用SX5%培養(yǎng)基在30°C和200印111振蕩下培養(yǎng)24小時后，木糖消耗率達到1.54g木糖/g生物質(zhì)/小時，其為RG589和424A(LNH-ST)的5倍到7.14倍。結(jié)果展示于圖2中。
[0079]實例4使用釀酒酵母FENC-OOO的乙醇產(chǎn)生和比較產(chǎn)率
[0080]在30°C和200rpm振蕩下用與一種或兩種碳源混合的SX培養(yǎng)基培養(yǎng)實例3中提及的釀酒酵母FENC-000(SPDSMZ25508)和實例2中提及的釀酒酵母RG589。乙醇產(chǎn)率展示于
下表中。
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種具有 DSMZ 保藏號 25508 的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FENC-000 的分離菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離菌株，其具有選自由以下組成的群組的木糖代謝基因:木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因、木酮糖激酶基因和木糖異構(gòu)酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離菌株，其是通過以下方式獲得:克隆一個或一個以上木糖代謝基因，將所述基因轉(zhuǎn)化到宿主酵母菌株中，用誘變劑使所得菌株突變且選擇木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物質(zhì)/小時的酵母菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離菌株，其可產(chǎn)生乙醇和以下物質(zhì)中的至少一種:乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、檸檬酸、3-羥基-丙酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素。
5.一種用于產(chǎn)生乙醇的方法，其包含以下步驟:(a)在適宜發(fā)酵條件下用根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離菌株使含有木糖或葡萄糖來源的培養(yǎng)基發(fā)酵；和(b)從所述培養(yǎng)基回收所述乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述來源是包含木糖或葡萄糖單元的碳水化合物寡聚物或多聚物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述碳水化合物寡聚物或多聚物是木質(zhì)纖維素、木聚糖、纖維素或淀粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其另外產(chǎn)生以下物質(zhì)中的至少一種:乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、檸檬酸、3-羥基-丙酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述乙醇的生產(chǎn)率為至少1.0g乙醇/升/小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述乙醇的生產(chǎn)率為至少1.5g乙醇/升/小時。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述乙醇的生產(chǎn)率在約0.6g乙醇/升/小時到約2.5g乙醇/升/小時范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述乙醇產(chǎn)率為至少70%。
【文檔編號】C12R1/865GK103695329SQ201310074168
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月27日
【發(fā)明者】莊育泉, 蔡秀虹 申請人:遠東新世紀(jì)股份有限公司