長雙歧桿菌及其應(yīng)用以及功能食品組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種長雙歧桿菌（Bifidobacterium?longum），其特征在于，所述長雙歧桿菌的保藏編號為CGMCC?No.6273。本發(fā)明還提供了一種功能食品組合物及其制備方法，包括：將如上所述的長雙歧桿菌的活菌體滅活，得到菌體物質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種功能食品組合物，所述功能食品組合物含有如上所述的長雙歧桿菌的活菌體。本發(fā)明還提供了如上所述的長雙歧桿菌在制備延緩衰老的功能食品組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的長雙歧桿菌的活菌體及滅活后的菌體物質(zhì)均具有延緩衰老的功效。
【專利說明】長雙歧桿菌及其應(yīng)用以及功能食品組合物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)及其應(yīng)用以及功能食品 組合物及其制備方法，具體地，涉及一種長雙歧桿菌，含有該長雙歧桿菌的功能食品組合物 及其制備方法，以及該長雙歧桿菌在制備延緩衰老的功能食品組合物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 衰老是機(jī)體組織、器官功能隨年齡增長而發(fā)生的退行性變化（Turnheim，2003)，是 機(jī)體各種生化反應(yīng)的綜合表現(xiàn)。經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，使發(fā)達(dá)國家和一些發(fā) 展中國家步入了老齡化社會。人口老齡化問題已經(jīng)成為了全球性的社會問題。截至2009 年底，中國60歲及以上的老年人口達(dá)1. 6714億，占總?cè)丝诘?2. 5%，預(yù)計到2020年將達(dá)到 2. 43億。隨著年齡的增長及機(jī)體的衰老，與衰老相關(guān)的疾病，如心血管、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫 瘤、糖尿病等，威脅著人類的壽命和生活質(zhì)量。因此，越來越多的研究專注于尋找具有抗衰 老作用的物質(zhì)并研究其抗衰老機(jī)理。目前多種天然產(chǎn)物已經(jīng)被證實(shí)具有抗衰老作用。但是 目前認(rèn)為的具有抗衰老作用的物質(zhì)來源較為單一，分離純化成本高，具有抗衰老作用的藥 物又具有一定的副作用，從而限制了這些物質(zhì)的大范圍應(yīng)用。益生菌安全性較高，分離純化 成本低，如果能夠明確益生菌的抗衰老功能，并確定其抗衰老機(jī)制，將益生菌作為抗衰老產(chǎn) 品的前景將十分廣闊。
[0003] 雙歧桿菌是1899年由法國學(xué)者Tissier從母乳營養(yǎng)兒的糞便中分離出的一種厭 氧的革蘭氏陽性桿菌。目前已經(jīng)證實(shí)雙歧桿菌或發(fā)酵產(chǎn)物具有多種抗氧化能力，主要表現(xiàn) 為清除氧自由基、清除DPPH自由基、清除羥自由基，可以抗脂質(zhì)過氧化，具有鐵離子還原 力、亞鐵離子螯合能力。雙歧桿菌脂磷壁酸延緩細(xì)胞衰老的作用及其機(jī)制的初步探討(彭艷 華等，碩士，重慶醫(yī)科大學(xué)，2008)首次在細(xì)胞水平研究了益生菌抗衰老功能。分離純化兩歧 雙歧桿菌脂磷壁酸（LTA)后，利用人胚肺成纖維細(xì)胞研究了 LTA的抗衰老作用。結(jié)果顯示， 雙歧桿菌LTA可以顯著延長細(xì)胞分裂次數(shù)，增強(qiáng)細(xì)胞活力，延緩細(xì)胞衰老表征。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有延緩衰老功能的雙歧桿菌。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)，其中，所述長雙歧桿菌的保藏編號為CGMCC No. 6273。
[0006] 第二方面，本發(fā)明提供了一種制備功能食品組合物的方法，所述方法包括：將如上 所述的長雙歧桿菌的活菌體滅活，得到菌體物質(zhì)。
[0007] 第三方面，本發(fā)明提供了一種由如上所述的方法制備的功能食品組合物。
[0008] 第四方面，本發(fā)明提供了一種功能食品組合物，其中，所述功能食品組合物含有如 上所述的長雙歧桿菌的活菌體。
[0009] 第五方面，本發(fā)明提供了如上所述的長雙歧桿菌在制備延緩衰老的功能食品組合 物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明提供的長雙歧桿菌的活菌體及滅活后的菌體物質(zhì)均具有延緩衰老的功效。
[0011] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
[0012] 生物保藏
[0013] 本發(fā)明的長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)，于2012年6月25日被保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No.6273。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0015] 一方面，本發(fā)明提供了一種長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)，其中，該長雙 歧桿菌的保藏編號為CGMCC No. 6273。
[0016] 本發(fā)明的長雙歧桿菌分離自廣西巴馬縣長壽老人的糞便。
[0017] 本發(fā)明提供的長雙歧桿菌經(jīng)過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量長雙歧桿菌的活菌體，所述培養(yǎng) 的方法沒有特別的要求，只要是能使所述長雙歧桿菌增殖即可，例如可以將1〇 7數(shù)量級的活 菌體接種于雙歧桿菌培養(yǎng)基中，并且在厭氧條件下，在15_38°C的溫度下培養(yǎng)8-72小時后， 得到培養(yǎng)液。所述雙歧桿菌培養(yǎng)基可以為公知的各種適合雙歧桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，例如可 以為乳汁和/或《乳酸菌--生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用》（楊潔彬，輕工業(yè)出版社，1996年出版）中 所述的乳酸菌（MRS)培養(yǎng)基。
[0018] 本發(fā)明可以進(jìn)一步分離上述培養(yǎng)液中的長雙歧桿菌的活菌體，所述分離的方法沒 有特別的限制，只要是能從培養(yǎng)液中富集菌體即可，例如可以通過離心和/或過濾的方法 實(shí)現(xiàn)，所述離心和所述過濾的條件可以為公知的條件，本發(fā)明在此不再贅述。
[0019] 第二方面，本發(fā)明提供了一種制備功能食品組合物的方法，所述方法包括：將如上 所述的長雙歧桿菌的活菌體滅活，得到菌體物質(zhì)。
[0020] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明的長雙歧桿菌在60-90°C下滅活 0. 3-2h，優(yōu)選在65-85°C下滅活0. 5-1. 5h后得到的菌體物質(zhì)，具有更加顯著的延緩衰老的 功效。因此，滅活的條件優(yōu)選包括：溫度為65-85°C，時間為0. 5-1. 5h。
[0021] 本發(fā)明的方法還包括將菌體物質(zhì)添加到食物中。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，盡管將菌體物質(zhì)添加到食物中，即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即起到延 緩衰老的作用，但優(yōu)選情況下，以功能食品組合物的總重量為基準(zhǔn)，菌體物質(zhì)的添加量為 10-70重量％,進(jìn)一步優(yōu)選為30-50重量％。在上述優(yōu)選情況下,所述功能食品組合物的延緩 衰老的作用更顯著。
[0023] 本發(fā)明中，食物可以是任意類型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食物也 可以根據(jù)食用對象的不同而有所不同。所述功能食品組合物中還可以含有常規(guī)的添加劑， 例如香料、礦物質(zhì)、維生素、穩(wěn)定劑、增稠劑、防腐劑等。
[0024] 第三方面，本發(fā)明提供了一種由如上所述的方法制備的功能食品組合物。
[0025] 第四方面，本發(fā)明提供了一種功能食品組合物，其中，所述功能食品組合物含有如 上所述的長雙歧桿菌的活菌體。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，盡管功能食品組合物含有如上所述的長雙歧桿菌的活菌體，即可實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明的目的，即起到延緩衰老的作用。但優(yōu)選情況下，以功能食品組合物的總重量為基 準(zhǔn)，長雙歧桿菌的活菌體的含量為10 5-101(lCFU/g，進(jìn)一步優(yōu)選為107-109CFU/g。在上述優(yōu)選 情況下，所述功能食品組合物的延緩衰老的作用更顯著。CFU (Colony-Forming Units,菌 落形成單位)指活菌個數(shù)。在活菌培養(yǎng)計數(shù)時，由單個菌體或聚集成團(tuán)的多個菌體在固體培 養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落，稱為菌落形成單位，以其表示活菌的數(shù)量。
[0027] 符合上述要求的功能食品組合物可以包括長雙歧桿菌的培養(yǎng)液(例如經(jīng)該長雙歧 桿菌發(fā)酵制得的發(fā)酵乳制品)、分離的長雙歧桿菌的活菌體等。
[0028] 本發(fā)明中，功能食品組合物還含有食物，食物如前所述，在此不再贅述。
[0029] 第五方面，本發(fā)明提供了如上所述的長雙歧桿菌在制備延緩衰老的功能食品組合 物中的應(yīng)用。
[0030] 實(shí)施例
[0031] 以下的實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0032] (-）采用線蟲作為受試對象
[0033] 線蟲是在發(fā)育、凋亡、衰老領(lǐng)域研究最為清晰的模式生物，其生命周期短，并且對 外界環(huán)境敏感，而且由于衰老信號的同源性高，低等生物的研究對哺乳動物及人體衰老有 直接的參考（Greer and Brunet, 2008)。因此，在以下實(shí)施例和對比例中采用線蟲作為受試 對象。
[0034] 在下述實(shí)施例和對比例中：
[0035] 線蟲為秀麗隱桿線蟲蟲株，野生型Caenorhabditis elegans N2,購自美國線蟲遺 傳學(xué)中心（Caenorhabditis Genetics Center (CGC))。
[0036] 菌種：線蟲標(biāo)準(zhǔn)食物大腸桿菌（E. coli)0P50,購自美國線蟲遺傳學(xué)中心；長雙歧 桿菌為本發(fā)明的長雙歧桿菌(該菌株于2012年6月25日被保藏在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研 究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 6273)。
[0037] 線蟲基本操作方法參考Wormbook標(biāo)準(zhǔn)線蟲培養(yǎng)方法進(jìn)行。
[0038] 1M 磷酸鉀緩沖液（ρΗ6· 0) :108. 3g ΚΗ2Ρ04,46 · 8g Κ2ΗΡ04 · 3H20,蒸餾水定容至 1L， 121°C滅菌15min備用。
[0039] NGM培養(yǎng)基：3. Og NaCl，20g瓊脂粉，2. 5g細(xì)菌蛋白胨，加入蒸餾水970mL，121°C滅 菌15min，置于60°C水浴，無菌條件下加入以下成分：lmLlM MgS04，lmLlM CaCl2,25mLlM磷 酸鉀緩沖液，3. 2mL5mg/mL膽固醇的乙醇溶液；混勻后，傾倒平板。待平板凝固后，置于室溫 2天，揮發(fā)水分及檢查平板無雜菌污染后置于4°C密封箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br> [0040] mNGM培養(yǎng)基：NGM培養(yǎng)基傾注平板之前在無菌條件下加入經(jīng)過濾除菌的FUdR、羧 芐青霉素至終濃度分別為50 μ M、0. 5mM，混勻傾注平板，凝固后置于室溫2天揮發(fā)水分，之 后平板可涂菌使用或置于4°C密封箱內(nèi)保存，于1個月內(nèi)使用完畢。
[0041] M9 緩沖液：3g ΚΗ2Ρ04,15. 12g Na2HP04 ·12Η20,58 NaCl，加蒸餾水定容至 1L，121°C 滅菌15min，冷卻至室溫后無菌加入lmLIM的MgS04，混勻備用。
[0042] 線蟲裂解液：lmL8M的NaOH，0. 6mL9%的次氯酸鈉溶液，3. 4mL無菌ddH20，混勻后使 用，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0043] LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCllOg (固體培養(yǎng)基加入15g瓊脂)，加 入950mL蒸饋水，調(diào)節(jié)pH至7. 0,121°C滅菌15min備用。
[0044] MRS培養(yǎng)基：購于北京陸橋公司。
[0045] 實(shí)施例1. 1
[0046] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的長雙歧桿菌延緩衰老的功效。
[0047] (1)將大腸桿菌0P50以1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，于恒溫?fù)u床 37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)8h至對數(shù)末期，得到大腸桿菌0P50培養(yǎng)液；將長雙歧桿菌以1%的接 種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，于充氮厭氧瓶37°C培養(yǎng)12h至對數(shù)末期，得到長雙歧桿菌培養(yǎng) 液。
[0048] 分別將上述大腸桿菌0P50和長雙歧桿菌的培養(yǎng)液，以4000 X g離心15min收集菌 體，用M9緩沖液重復(fù)離心洗滌兩次，之后4°C 16000 X g離心15min，去掉全部上清液，稱量 菌體濕重。將菌體以一定量的M9緩沖液重懸，使菌體終濃度為400mg/mL，分裝于1. 5mL離 心管，作為濃縮菌體。
[0049] 分別將上述兩種濃縮菌體在75°C熱滅活lh，冷卻后將大腸桿菌0P50和長雙歧桿 菌按3:2的重量比（即長雙歧桿菌為40重量％)混合得到混合物，將混合物按照400mg/mL 的比例懸浮于M9緩沖液中，涂布于直徑60mm的mNGM平板表面，使每平板菌體量為10mg，共 6塊平板，4 °C密封保存?zhèn)溆谩?br> [0050] (2)在直徑90mm的NGM培養(yǎng)基表面，均勻涂布200 μ L大腸桿菌0P50培養(yǎng)液，37°C 培養(yǎng)l〇h，作為線蟲傳代用平板，4°C密封保存?zhèn)溆谩?br> [0051] 在無菌條件下，用手術(shù)刀從生長有線蟲的NGM平板上切取約lcmX lcm的小塊培養(yǎng) 基，正面向下扣在線蟲傳代用平板上，置于25°C培養(yǎng)，60mm平皿一般7天傳代一次，保持線 蟲活性。
[0052] 取傳代后成蟲大多處于產(chǎn)卵期的平板用于線蟲同期化：
[0053] 向平板中加入2mL M9緩沖液，用無菌吸管吹打，盡量沖下平板上的蟲體，將蟲體轉(zhuǎn) 移至1. 5mL離心管，800Xg離心lmin，棄上清收集蟲體，加入lmL M9緩沖液再次離心洗滌 蟲體，盡量吸盡上清。
[0054] 加入lmL新鮮的線蟲裂解液，立刻漩潤振蕩10s，800 Xg離心lmin，移液器吸走上 清。
[0055] 立刻加入lmL M9緩沖液洗滌蟲體，800Xg離心lmin，連續(xù)兩次，去除殘留裂解液。 最后管內(nèi)剩余約1〇〇 μ L含有蟲卵的M9懸濁液。
[0056] 使用無菌吸管將蟲卵滴加于涂布0Ρ50的NGM平板，25°C培養(yǎng)48h，得到同期化48h 的線蟲。
[0057] (3)將同期化48h的線蟲，置于體視顯微鏡觀察，使用鉬金鏟挑取生殖口為透明半 月形的L4期雌雄同體蟲于步驟（1)得到的mNGM平板上，每塊平板挑取10只，平板置于25°C 培養(yǎng)。每天觀察線蟲生存狀況，如蟲體對鉬金鏟輕觸沒有活動反應(yīng)則認(rèn)為蟲體死亡。排除 失蹤、體內(nèi)孵化及非自然死亡線蟲。全部線蟲死亡則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。計算線蟲平均壽命見表1。
[0058] 實(shí)施例1. 2
[0059] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的長雙歧桿菌延緩衰老的功效。
[0060] (1)將大腸桿菌0P50以1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，于恒溫?fù)u床 37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)8h至對數(shù)末期，得到大腸桿菌0P50培養(yǎng)液；將長雙歧桿菌以1%的接 種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，于充氮厭氧瓶37°C培養(yǎng)12h至對數(shù)末期，得到長雙歧桿菌培養(yǎng) 液。
[0061] 分別將上述大腸桿菌0P50和長雙歧桿菌的培養(yǎng)液，以4000Xg離心15min收集菌 體，用M9緩沖液重復(fù)離心洗滌兩次，之后4°C 16000 X g離心15min，去掉全部上清液，稱量 菌體濕重。將菌體以一定量的M9緩沖液重懸，使菌體終濃度為400mg/mL，分裝于1. 5mL離 心管，作為濃縮菌體。
[0062] 分別將上述兩種濃縮菌體65°C熱滅活1. 5h，冷卻后將大腸桿菌0P50和長雙歧桿 菌按7:3的重量比（即長雙歧桿菌為30重量％)混合得到混合物，將混合物按照400mg/mL 的比例懸浮于M9緩沖液中，涂布于直徑60mm的mNGM平板表面，使每平板菌體量為10mg，共 6塊平板，4 °C密封保存?zhèn)溆谩?br> [0063] (2)在直徑90mm NGM培養(yǎng)基表面，均勻涂布200 μ L大腸桿菌0P50培養(yǎng)液，37°C培 養(yǎng)l〇h，作為線蟲傳代用平板，4°C密封保存?zhèn)溆谩?br> [0064] 在無菌條件下，用手術(shù)刀從生長有線蟲的NGM平板上切取約lcmX lcm的小塊培養(yǎng) 基，正面向下扣在線蟲傳代用平板上，置于25°C培養(yǎng)，60mm平皿一般7天傳代一次，保持線 蟲活性。
[0065] 取傳代后成蟲大多處于產(chǎn)卵期的平板用于線蟲同期化：
[0066] 向平板中加入2mL M9緩沖液，用無菌吸管吹打，盡量沖下平板上的蟲體，將蟲體轉(zhuǎn) 移至1. 5mL離心管，800Xg離心lmin，棄上清收集蟲體，加入lmL M9緩沖液再次離心洗滌 蟲體，盡量吸盡上清。
[0067] 加入lmL新鮮的線蟲裂解液，立刻漩潤振蕩10s，800 Xg離心lmin，移液器吸走上 清。
[0068] 立刻加入lmL M9緩沖液洗滌蟲體，800Xg離心lmin，連續(xù)兩次，去除殘留裂解液。 最后管內(nèi)剩余約1〇〇 μ L含有蟲卵的M9懸濁液。
[0069] 使用無菌吸管將蟲卵滴加于涂布0Ρ50的NGM平板，25°C培養(yǎng)48h，得到同期化48h 的線蟲。
[0070] (3)將同期化48h的線蟲，置于體視顯微鏡觀察，使用鉬金鏟挑取生殖口為透明半 月形的L4期雌雄同體蟲于步驟（1)得到的mNGM平板上，每塊平板挑取10只，平板置于25°C 培養(yǎng)。每天觀察線蟲生存狀況，如蟲體對鉬金鏟輕觸沒有活動反應(yīng)則認(rèn)為蟲體死亡。排除 失蹤、體內(nèi)孵化及非自然死亡線蟲。全部線蟲死亡則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。計算線蟲平均壽命見表1。
[0071] 實(shí)施例1.3
[0072] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的長雙歧桿菌延緩衰老的功效。
[0073] (1)將大腸桿菌0P50以1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，于恒溫?fù)u床 37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)8h至對數(shù)末期，得到大腸桿菌0P50培養(yǎng)液；將長雙歧桿菌以1%的接 種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，于充氮厭氧瓶37°C培養(yǎng)12h至對數(shù)末期，得到長雙歧桿菌培養(yǎng) 液。
[0074] 分別將上述大腸桿菌0P50和長雙歧桿菌的培養(yǎng)液，以4000 X g離心15min收集菌 體，用M9緩沖液重復(fù)離心洗滌兩次，之后4°C 16000 X g離心15min，去掉全部上清液，稱量 菌體濕重。將菌體以一定量的M9緩沖液重懸，使菌體終濃度為400mg/mL，分裝于1. 5mL離 心管，作為濃縮菌體。
[0075] 分別將上述兩種濃縮菌體85°C熱滅活0. 5h，冷卻后將大腸桿菌0P50和長雙歧桿 菌按1:1的重量比（即長雙歧桿菌為50重量％)混合得到混合物，將混合物按照400mg/mL 的比例懸浮于M9緩沖液中，涂布于直徑60mm的mNGM平板表面，使每平板菌體量為10mg，共 6塊平板，4 °C密封保存?zhèn)溆谩?br> [0076] (2)在直徑90mm NGM培養(yǎng)基表面，均勻涂布200yL大腸桿菌0P50培養(yǎng)液，37°C培 養(yǎng)l〇h，作為線蟲傳代用平板，4°C密封保存?zhèn)溆谩?br> [0077] 在無菌條件下，用手術(shù)刀從生長有線蟲的NGM平板上切取約lcmX lcm的小塊培養(yǎng) 基，正面向下扣在線蟲傳代用平板上，置于25°C培養(yǎng)，60mm平皿一般7天傳代一次，保持線 蟲活性。
[0078] 取傳代后成蟲大多處于產(chǎn)卵期的平板用于線蟲同期化：
[0079] 向平板中加入2mL M9緩沖液，用無菌吸管吹打，盡量沖下平板上的蟲體，將蟲體轉(zhuǎn) 移至1. 5mL離心管，800Xg離心lmin，棄上清收集蟲體，加入lmL M9緩沖液再次離心洗滌 蟲體，盡量吸盡上清。
[0080] 加入lmL新鮮的線蟲裂解液，立刻漩潤振蕩10s，800 Xg離心lmin，移液器吸走上 清。
[0081] 立刻加入lmL M9緩沖液洗滌蟲體，800Xg離心lmin，連續(xù)兩次，去除殘留裂解液。 最后管內(nèi)剩余約1〇〇 μ L含有蟲卵的M9懸濁液。
[0082] 使用無菌吸管將蟲卵滴加于涂布0Ρ50的NGM平板，25°C培養(yǎng)48h，得到同期化48h 的線蟲。
[0083] (3)將同期化48h的線蟲，置于體視顯微鏡觀察，使用鉬金鏟挑取生殖口為透明半 月形的L4期雌雄同體蟲于步驟（1)得到的mNGM平板上，每塊平板挑取10只，平板置于25°C 培養(yǎng)。每天觀察線蟲生存狀況，如蟲體對鉬金鏟輕觸沒有活動反應(yīng)則認(rèn)為蟲體死亡。排除 失蹤、體內(nèi)孵化及非自然死亡線蟲。全部線蟲死亡則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。計算線蟲平均壽命見表1。
[0084] 實(shí)施例1. 4
[0085] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的長雙歧桿菌延緩衰老的功效。
[0086] 按照實(shí)施例1. 1的方法進(jìn)行線蟲壽命試驗(yàn)，不同的是，步驟（1)中，滅活冷卻后將 大腸桿菌0P50和長雙歧桿菌按3:7的重量比（即長雙歧桿菌為70重量％)混合。計算線蟲 平均壽命見表1。
[0087] 實(shí)施例1. 5
[0088] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的長雙歧桿菌延緩衰老的功效。
[0089] 按照實(shí)施例1. 1的方法進(jìn)行線蟲壽命試驗(yàn)，不同的是，步驟（1)中，滅活冷卻后將 大腸桿菌0P50和長雙歧桿菌按9:1的重量比（即長雙歧桿菌為10重量％)混合。計算線蟲 平均壽命見表1。
[0090] 實(shí)施例1. 6
[0091] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的長雙歧桿菌延緩衰老的功效。
[0092] 按照實(shí)施例1. 1的方法進(jìn)行線蟲壽命試驗(yàn)，不同的是，滅活溫度為90°C，滅活時間 為0. 3h。計算線蟲平均壽命見表1。
[0093] 實(shí)施例1. 7
[0094] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的長雙歧桿菌延緩衰老的功效。
[0095] 按照實(shí)施例1. 1的方法進(jìn)行線蟲壽命試驗(yàn)，不同的是，滅活溫度為60°C，滅活時間 為2. Oh。計算線蟲平均壽命見表1。
[0096] 對比例1. 1
[0097] 按照實(shí)施例1. 1的方法進(jìn)行線蟲壽命試驗(yàn)，不同的是，用ATCC15707(S卩，保藏于美 國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，保藏號為ATCC15707)公開的菌株替代長雙歧桿菌。計算線蟲平均 壽命見表1。
[0098] 對比例1.2
[0099] 按照實(shí)施例1. 1的方法進(jìn)行線蟲壽命試驗(yàn)，不同的是，滅活冷卻后將大腸桿菌 0P50按照400mg/mL的比例懸浮于M9緩沖液中，涂布于mNGM平板表面，S卩，mNGM平板表面 僅涂布滅活冷卻后的大腸桿菌0P50。計算線蟲平均壽命見表1。
[0100] 表 1
[0101]

【權(quán)利要求】
1. 一種長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)，其特征在于，所述長雙歧桿菌的保藏 編號為 CGMCC No. 6273。
2. -種制備功能食品組合物的方法，所述方法包括：將權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌 的活菌體滅活，得到菌體物質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述滅活的條件包括：溫度為60-90°C，優(yōu)選 65-85°C，時間為 0· 3-2h，優(yōu)選 0· 5-1. 5h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述方法還包括，將所述菌體物質(zhì)添加到食 物中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，以所述功能食品組合物的總重量為基準(zhǔn)，所述菌 體物質(zhì)的添加量為10-70重量％，優(yōu)選為30-50重量％。
6. 由權(quán)利要求2-5中任意一項(xiàng)所述的方法制備的功能食品組合物。
7. -種功能食品組合物，其特征在于，所述功能食品組合物含有權(quán)利要求1所述的長 雙歧桿菌的活菌體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的功能食品組合物，其中，以所述功能食品組合物的總重量為 基準(zhǔn)，所述長雙歧桿菌的活菌體的含量為l〇5-l〇 1(lCFU/g，優(yōu)選為107-109CFU/g。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的功能食品組合物，其中，所述功能食品組合物還含有食 物。
10. 權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌在制備延緩衰老的功能食品組合物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23L1/30GK104046573SQ201310076631
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月11日
【發(fā)明者】任發(fā)政 申請人:北京中天神舟航天食品技術(shù)研究院