專利名稱：一種用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法。
背景技術(shù)：
目前葡萄霜霉病(Grape downy mildew)是葡萄種植中最重要的病害,在我國各葡萄產(chǎn)區(qū)均有分布，多發(fā)生在雨水較多的地區(qū)和年份，在5-6月份開始發(fā)生，7-9月為發(fā)病盛期。主要危害葉片，也能侵染嫩梢、花序、幼果等幼嫩組織。病害流行年份，病葉焦枯早落，病梢扭曲，發(fā)育不良，對(duì)樹勢(shì)和產(chǎn)量影響嚴(yán)重。截止2010年，全國葡萄栽培面積達(dá)到了552，OOOhm2，重病區(qū)的發(fā)病率在70%以上。葡萄霜霉菌是專性寄生真菌，葉片發(fā)病部位產(chǎn)生白色霜狀霉層，即病菌的孢子囊及孢子囊梗。自氣孔伸出的孢子囊梗上生孢子囊，孢子囊呈卵形或橢圓形，頂端有乳頭狀突起，在水中萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子呈腎形，在扁平的一側(cè)生有兩根鞭毛，能在水中游動(dòng)，在水中游動(dòng)變成圓形靜止孢子，并同時(shí)長出芽管，經(jīng)氣孔侵入寄主。自然環(huán)境中，游動(dòng)孢子通過雨水濺到葡萄幼嫩組織上，通過氣孔侵入組織細(xì)胞進(jìn)行初侵染。經(jīng)過一定的潛育期，形成初次病斑-組織上的油狀斑點(diǎn)，在初次病斑上形成孢子囊梗和孢子囊，孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生的游動(dòng)孢子又通過雨露進(jìn)行再侵染。在整個(gè)生長季過程中，只要條件適宜，病菌就會(huì)不斷進(jìn)行重復(fù)侵染，使病害流行。葡萄霜霉病菌是專性寄生菌，在培養(yǎng)基上不能分離培養(yǎng)且在室內(nèi)不能夠大量繁殖，這嚴(yán)重限制了葡萄霜霉病菌室內(nèi)監(jiān)測(cè)抗藥性、新藥劑的篩選、新藥劑抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及致病性分化等研究工作的開展。研究人員不得不只能在短時(shí)間內(nèi)不斷地去田間采集該病菌用于試驗(yàn)的需求,這樣不但增加了工作量,試驗(yàn)成本也大大提高。因此,迫切需要發(fā)明一種簡(jiǎn)單易行的方法用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌，保證葡萄霜霉病菌的研究工作順利展開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法，該方法可在室內(nèi)大量培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌，且簡(jiǎn)單、易行。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用葡萄霜霉病菌的侵染循環(huán)原理建立的該病菌的培養(yǎng)繁殖方法。具體的，該方法包括如下步驟:(I)采集葡萄霜霉病菌菌樣:在不同地區(qū)的葡萄種植區(qū)采集葡萄霜霉病菌的病葉，低溫o°c -10°C保存帶回室內(nèi)；(2)孢子囊懸浮液的制備:(Al)將病葉表面雜質(zhì)和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，在18°C -20°C下黑暗培養(yǎng)24h-32h誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的孢子囊；

(A2)將新生孢子囊沖下制成孢子囊含量為I X IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液；
(A3)將新生孢子囊懸浮液于4°C預(yù)冷20min-30min，室溫放置待懸浮液溫度為室溫時(shí)用于接種；(3)甸甸品種及葉片的選擇:甸甸品種米用易感霜霉病品種；葉片選擇所述易感品種植株葉齡一致、枝條頂端第一至第三片完全展開的健康葉片；同時(shí)，所述葡萄植株及葉片生長期均未用過藥且無霜霉病發(fā)生；(4)孢子囊懸浮液的接種:將孢子囊懸浮液用噴霧法離體接種(3)中所述健康葡萄葉片；(5)葉片保濕培養(yǎng):(Al)在培養(yǎng)皿中鋪有兩層無菌水浸濕的濾紙上放置玻璃棒，待葉片接種后立即將接種后的葉片正面朝下放在玻璃棒上，葉片不與濾紙直接接觸，葉柄用脫脂棉保濕，將培養(yǎng)皿密封；(A2)將上述裝有葉片的培養(yǎng)皿置于18 °C -20 °C下黑暗、RH100%條件下培養(yǎng)24h-32h后進(jìn)行光照培養(yǎng)12h，再進(jìn)行黑暗培養(yǎng)12h，按此順序以后每天18°C _20°C下進(jìn)行12小時(shí)光照/黑暗交替培養(yǎng)至霜霉病菌侵染葉片發(fā)病產(chǎn)生大量孢子囊，此期間保證足夠濕度 RH100%。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法還包括如下步驟:(6)菌種純化:待葡萄霜霉病菌侵染葉片開始形成病斑后，剪取某一病斑(病斑面積大小一定)進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，沖洗單一病斑孢子囊成孢子囊懸浮液，過濾離心，將孢子囊懸浮液稀釋成孢子囊含量為I X IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液，4°C低溫誘導(dǎo)20min-30min，室溫下放置一定時(shí)間，待孢子囊懸浮液溫度為室溫時(shí)，分散噴于葡萄葉片，逐天進(jìn)行觀察葉片發(fā)病情況，待霜霉病斑發(fā)生初期，繼續(xù)對(duì)單一病斑進(jìn)行剪切獨(dú)立培養(yǎng)，連續(xù)重復(fù)兩次，得到相對(duì)比較純 的菌系，同樣方法繼續(xù)擴(kuò)繁2代獲得大量的孢子囊含量為IXlO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液；(7)將(6)中純化后的孢子囊懸浮液按步驟(4)進(jìn)行接種，并按步驟(5)進(jìn)行葉片保濕培養(yǎng)至霜霉病菌侵染葉片發(fā)病產(chǎn)生大量孢子囊。純化后的霜霉病菌可提高葡萄霜霉病的監(jiān)測(cè)、致病性測(cè)定、藥劑篩選等大型試驗(yàn)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。優(yōu)選地，步驟(I)中在我國不同省份的不同葡萄種植區(qū)采集葡萄霜霉病菌的病葉，用保溫箱低溫0°c -10°C保存帶回室內(nèi)。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(I)中，所述葡萄霜霉病菌菌樣的采集是在我國不同省份的不同葡萄種植區(qū)采用5點(diǎn)法取樣，每點(diǎn)取10個(gè)葡萄霜霉病菌的病葉，用保溫箱低溫0-10°C保存帶回室內(nèi)，進(jìn)行進(jìn)一步繁殖。葡萄霜霉病菌菌樣的采集過程中必須低溫0-10°C保存帶回室內(nèi)來保證病菌的生活力。優(yōu)選地，步驟(2)中(Al)中在18°C下黑暗培養(yǎng)24h誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的孢子囊。具體地，步驟(2)中(Al)中在壓力0.08Mpa下用無菌水將病葉表面雜質(zhì)和霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，將病葉置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜將培養(yǎng)皿封口，在18°C下黑暗保濕培養(yǎng)24h誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的孢子囊。所述培養(yǎng)皿可用塑料盒或其他本領(lǐng)域常用的器皿代替。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(2)中(Al)中用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器將病葉表面雜質(zhì)和霜霉病菌表面老熟的孢子囊用無菌水沖洗掉。優(yōu)選地，步驟(2)中(A2)中在壓力0.08Mpa下用無菌水將新生孢子囊洗下來，4號(hào)定性濾紙過濾，以2000r/min離心5min，重復(fù)離心2次，配制成孢子囊含量為IXlO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液。所述4號(hào)定性濾紙屬于定性濾紙的一種,優(yōu)選為Whatman Grade4定性標(biāo)準(zhǔn)濾紙，其加快了流速和增加了負(fù)載力，大顆粒和膠狀沉淀物保留能力強(qiáng)，可以使孢子囊與雜質(zhì)充分分離，也可以使用除Grade4定性標(biāo)準(zhǔn)濾紙外的其它型號(hào)的濾紙，但有可能分離孢子囊時(shí)有一部分不能很好的被過濾或者有些雜質(zhì)會(huì)在過濾時(shí)一起進(jìn)入孢子懸浮液中。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(2)中(A2)中用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器用無菌水將新生孢子囊洗下來。優(yōu)選地，將孢子囊懸浮液的濃度用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整為I X IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL。在壓力0.0SMpa下沖洗老熟的孢子囊和新生的孢子囊此時(shí)葉片損害程度較輕且孢子囊受到的撞擊較小，利于病菌繁殖。新生孢子囊洗下后，離心來提高孢子囊濃度和去雜。優(yōu)選地，步驟(2)中(A3)中于4°C 20min低溫處理，室溫放置一段時(shí)間待懸浮液溫度為室溫時(shí)用于接種。制成孢子囊懸浮液后經(jīng)4°C 20min-30min低溫處理能夠促進(jìn)游動(dòng)孢子釋放,待懸浮液溫度為室溫后即可進(jìn)行接種。優(yōu)選地，步驟(3)中，菌種接種及培養(yǎng)過程需嚴(yán)格注意葡萄品種和葉片選擇。葡萄品種多采用易感霜霉病品種如歐 亞種群赤霞珠，或者采用部分歐美雜交種巨峰、高妻等；葉片有選擇性的采集供試葡萄品 種葉齡一致、枝條頂端第一至第三片完全展開的健康葉片，此部位葉片接種霜霉病菌最易被霜霉病菌侵染并保證菌種的純度。需注意的是，所述葡萄植株及葉片生長期均未用過藥且無霜霉病發(fā)生。優(yōu)選地，步驟(4)中所述霜霉病菌混合孢子懸浮液的接種方法為:用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器將孢子囊懸浮液均勻噴霧于葉片背面，液滴在葉片剛好不滑落為宜。其中，步驟(5)中(Al)中葉片接種后立即將接種后的葉片正面朝下放在玻璃棒上防止葉片短時(shí)間內(nèi)被水浸泡變爛，葉片不與濾紙直接接觸，每天注意向培養(yǎng)皿中加水保持濾紙和脫脂棉濕潤來保證足夠的濕度，用封口膜將培養(yǎng)皿封嚴(yán)確保每個(gè)葉片都被均勻保濕。所用培養(yǎng)皿優(yōu)選為Φ 15cm的培養(yǎng)皿。所述培養(yǎng)皿可用塑料盒或其他本領(lǐng)域常用的器皿代替。培養(yǎng)過程中葉片正面不與濾紙及皿內(nèi)無菌水的接觸，使得葉片更容易保鮮，葉片為病菌的生長提供更好的營養(yǎng)條件，病菌可以在葉片上長時(shí)間生長。其中，優(yōu)選地，步驟(5)中(A2)中將所述培養(yǎng)皿置于18°C黑暗條件下保濕RH100%條件下培養(yǎng)24h后進(jìn)行光照培養(yǎng)12h，使霜霉病菌孢子完成萌發(fā)和侵染過程，再進(jìn)行黑暗培養(yǎng)12h，按此順序以后每天18°C下進(jìn)行12h光照/黑暗交替培養(yǎng)，霜霉病菌侵染葉片發(fā)病大量產(chǎn)生孢子囊，此期間保證足夠濕度RH100%，葉片開始發(fā)病后可以維持7-10天，可用于試驗(yàn)或擴(kuò)繁，保證充足的孢子囊數(shù)量。接種后于18_20°C黑暗條件下保濕RH100%條件下24_32h培養(yǎng)，利于游動(dòng)孢子的侵染。本發(fā)明的另一目的是提供所述方法在葡萄霜霉病的監(jiān)測(cè)、致病性測(cè)定、藥劑篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明利用葡萄霜霉病菌的侵染循環(huán)原理提供了一種室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法，通常葡萄霜霉病菌不易人工培養(yǎng)，且培養(yǎng)過程中一般發(fā)病不均勻，如果繼續(xù)繼代培養(yǎng)生活力會(huì)明顯下降。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、易行的霜霉菌培養(yǎng)繁殖方法，有效地解決了專性寄生的葡萄霜霉菌培養(yǎng)繁殖的難點(diǎn)，克服了目前常規(guī)離體繁殖方法不能用于專性寄生的葡萄霜霉病菌離體大量繁殖的缺點(diǎn)。該方法簡(jiǎn)單易學(xué)，容易操作，對(duì)試驗(yàn)儀器要求不高，葉片發(fā)病后仍可以在相同環(huán)境條件下培養(yǎng)7-10天，且克服了以往葡萄霜霉病接種后難于成活、在室內(nèi)不能對(duì)菌樣進(jìn)行大量繁殖、得不到充足孢子囊懸浮液的缺陷，本發(fā)明的方法可用于葡萄霜霉病的監(jiān)測(cè)、致病性測(cè)定、藥劑篩選等大型試驗(yàn)，為霜霉病科研工作提供了極大的便利，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。所使用的4號(hào)定性濾紙為Whatman Grade4定性標(biāo)準(zhǔn)濾紙,貨號(hào)為1004-090。

若未特別指明，本發(fā)明實(shí)施例中所用的材料和儀器均可市售獲得，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所述用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法中各處理?xiàng)l件的確定實(shí)驗(yàn)如下:實(shí)施例1游動(dòng)孢子釋放的條件1、材料和方法(1)采集葡萄霜霉病菌菌樣:以河北保定葡萄霜霉病菌菌樣為代表，采用5點(diǎn)法取樣，每點(diǎn)取10個(gè)葡萄霜霉病菌的病葉，用保溫箱低溫o-1o°c保存帶回室內(nèi)；(2)孢子囊懸浮液的制備:用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器用無菌水將病葉表面雜質(zhì)和霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，將病葉置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜將培養(yǎng)皿封口，在18°C下黑暗保濕培養(yǎng)24小時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的孢子囊；用壓力0.0SMPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器用無菌水將新鮮的孢子囊沖洗下來，Whatman Grade4定性標(biāo)準(zhǔn)濾紙過濾，以2000r/min離心5min,重復(fù)離心2次,配制成孢子囊含量1X IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液，置于2mL離心管；(3)孢子囊懸浮液處理:將(2)中新生孢子囊懸浮液分別進(jìn)行4°C低溫誘導(dǎo)處理O、10、20、30min，處理后于18°C溫度下分別采用24h光照、24h黑暗及12h光照/黑暗交替培養(yǎng);(4) 24h后光學(xué)顯微鏡下IOX 10倍下觀察游動(dòng)孢子釋放情況，調(diào)查空孢囊率。2、試驗(yàn)結(jié)果孢子囊經(jīng)不同時(shí)間低溫處理于不同培養(yǎng)條件下的游動(dòng)孢子釋放情況如表I所示，結(jié)果表明，葡萄霜霉病菌的孢子囊經(jīng)4°C低溫誘導(dǎo)處理20min后黑暗培養(yǎng)24h，其空孢囊率達(dá)到95%，游動(dòng)孢子基本上全部釋放出來，遠(yuǎn)高于其他培養(yǎng)條件。4°C低溫誘導(dǎo)處理20min黑暗培養(yǎng)24h利于游動(dòng)孢子的釋放，可知此方法處理葡萄霜霉病菌孢子囊接種后利于短時(shí)間內(nèi)所有游動(dòng)孢子侵入葉片氣孔進(jìn)行全面侵染葉片，使得葉片發(fā)病均勻。表I孢子囊經(jīng)不同時(shí)間低溫處理于不同培養(yǎng)條件下的游動(dòng)孢子釋放情況
權(quán)利要求
1.一種用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)采集葡萄霜霉病菌菌樣:在不同地區(qū)的葡萄種植區(qū)采集葡萄霜霉病菌的病葉，低溫0°C -10°C保存帶回室內(nèi)； (2)孢子囊懸浮液的制備:(Al)將病葉表面雜質(zhì)和葡萄霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，在18°C -20°C下黑暗培養(yǎng)24h-32h誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的孢子囊； (A2)將新生孢子囊沖下制成孢子囊含量為I X IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液； (A3)將新生孢子囊懸浮液于4°C預(yù)冷20min-30min，室溫放置待懸浮液溫度為室溫時(shí)用于接種； (3)甸甸品種及葉片的選擇:甸甸品種米用易感霜霉病品種；葉片選擇所述易感品種植株葉齡一致、枝條頂端第一至第三片完全展開的健康葉片；同時(shí)，所述葡萄植株及葉片生長期均未用過藥且無霜霉病發(fā)生； (4)孢子囊懸浮液的接種:將孢子囊懸浮液用噴霧法離體接種(3)中所述健康葡萄葉片; (5)葉片保濕培養(yǎng):(Al)在培養(yǎng)皿中鋪有兩層無菌水浸濕的濾紙上放置玻璃棒，待葉片接種后立即將接種后的葉片正面朝下放在玻璃棒上，葉片不與濾紙直接接觸，葉柄用脫脂棉保濕，將培養(yǎng)皿密封； (A2)將上述裝有葉片的培養(yǎng)皿置于18°C -20°C下黑暗、RH100%條件下培養(yǎng)24h_32h后進(jìn)行光照培養(yǎng)12h，再進(jìn)行黑暗培養(yǎng)12h，按此順序以后每天18°C -20°C下進(jìn)行12小時(shí)光照/黑暗交替培養(yǎng)至霜霉病菌侵染葉片發(fā)病產(chǎn)生大量孢子囊，此期間保證濕度RH100%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，本發(fā)明的用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法還包括如下步驟: (6)菌種純化:待葡萄霜霉病菌侵染葉片形成病斑后，剪取某一病斑進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，沖洗單一病斑孢子囊成孢子囊懸浮液，過濾離心，將孢子囊懸浮液稀釋成孢子囊含量為I X IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液，4°C低溫誘導(dǎo)20min-30min，待孢子囊懸浮液溫度為室溫時(shí)，分散噴于葡萄葉片，待霜霉病斑發(fā)生初期，繼續(xù)對(duì)單一病斑進(jìn)行剪切獨(dú)立培養(yǎng)，連續(xù)重復(fù)兩次，得到相對(duì)比較純的菌系，同樣方法繼續(xù)擴(kuò)繁2代獲得孢子囊含量為I X IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液； (7)將(6)中純化后的孢子囊懸浮液按步驟(4)進(jìn)行接種，并按步驟(5)進(jìn)行葉片保濕培養(yǎng)至霜霉病菌侵染葉片發(fā)病產(chǎn)生大量孢子囊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述葡萄霜霉病菌菌樣的采集是在我國不同省份的不同葡萄種植區(qū)采用5點(diǎn)法取樣，每點(diǎn)取10個(gè)葡萄霜霉病菌的病葉，用保溫箱低溫0-10°C保存帶回室內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中(Al)中在壓力0.0SMpa下用無菌水將病葉表面雜質(zhì)和霜霉病菌表面老熟的孢子囊沖洗掉，將病葉置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜將培養(yǎng)皿封口，在18°C下黑暗保濕培養(yǎng)24h誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的孢子囊。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中(Al)中用壓力0.0SMPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器將病葉表面雜質(zhì)和霜霉病菌表面老熟的孢子囊用無菌水沖洗掉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2沖(A2)中在壓力0.0SMpa下用無菌水將新生孢子囊洗下來，4號(hào)定性濾紙過濾，以2000r/min離心5min,重復(fù)離心2次，配制成孢子囊含量為IX IO5個(gè)-1.5 X IO5個(gè)/mL的孢子囊懸浮液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中(A2)中用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器用無菌水將新生孢子囊洗下來。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述易感霜霉病品種為歐亞種群赤霞珠、歐美雜交種巨峰或歐美雜交種高妻。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述孢子囊懸浮液的接種方法為:用壓力0.08MPa的QWJ-150型空壓機(jī)帶動(dòng)喉頭噴霧器將孢子囊懸浮液均勻噴霧于葉片背面，液滴在葉片剛好不滑落為宜。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(5)中(A2)中將上述裝有葉片的培養(yǎng)皿置于18°C下黑暗、RH100%條件下培養(yǎng)24h后進(jìn)行光照培養(yǎng)12h，再進(jìn)行黑暗培養(yǎng)12h，按此順序以后每天18 °C下進(jìn)行12小時(shí)光照/黑暗交替培養(yǎng)至霜霉病菌侵染葉片發(fā)病產(chǎn)生大量孢子囊，此期間保證濕度RH100%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于室內(nèi)培養(yǎng)繁殖葡萄霜霉病菌的方法，所述方法包括如下步驟(1)采集葡萄霜霉病菌菌樣；(2)孢子囊懸浮液的制備；(3)葡萄品種及葉片的選擇；(4)孢子囊懸浮液的接種；(5)葉片保濕培養(yǎng)。該方法簡(jiǎn)單易學(xué)，容易操作，對(duì)試驗(yàn)儀器要求不高，葉片發(fā)病后仍可以在相同環(huán)境條件下培養(yǎng)7-10天，且克服了以往葡萄霜霉病接種后難于成活、在室內(nèi)不能對(duì)菌樣進(jìn)行大量繁殖、得不到充足孢子囊懸浮液的缺陷，可用于葡萄霜霉病的監(jiān)測(cè)、致病性測(cè)定、藥劑篩選等大型試驗(yàn)，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103173365SQ20131007688
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者馬志強(qiáng), 畢秋艷, 張小風(fēng), 王文橋, 韓秀英 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所