甲基化dna檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種甲基DNA檢測方法，該方法包括以下步驟：處理樣品、合成探針、雜交反應(yīng)、加入單克隆抗體、加入偶聯(lián)單克隆抗體、加入檢測試劑、測定、判斷。本發(fā)明具有檢測特異性高、不容易被干擾、假陽性率低等優(yōu)點，在對腫瘤早期檢測、腫瘤個性化治療、腫瘤病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面的檢測和檢測試劑的開發(fā)有著重要的意義。
【專利說明】甲基化DNA檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種甲基化DNA的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點的胞嘧啶(C)殘基的5’碳上被修飾了一個甲基。DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CG 二核苷酸的胞嘧啶殘基上，這常見于基因5’端表達(dá)調(diào)控序列。DNA甲基化在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用，參與了動物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)互相作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。
[0003]DNA甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升聞，可以導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達(dá)。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機(jī)率就會提高，所以DNA甲基化在腫瘤早期檢測中的應(yīng)用十分引人注目。研究表明，表觀遺傳的變化伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，因而檢測DNA甲基化改變可以有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因，這是因為人們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。由于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測。
[0004]CpG島甲基化的檢測方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測法。甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶/Southern法(methyIat1n-sensitive restrict1n Endonuclease/Southern, MSRE- Southern)是比較傳統(tǒng)的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法(Methylat1n SpecificPCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA檢測方法，是目前檢測DNA甲基化的常用方法，其靈敏度較高，但容易受干擾，特異性差，從而導(dǎo)致檢測的假陽性率也很高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種甲基化DNA檢測方法，能夠有效地排除非甲基化DNA的影響，很好地解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測特異性低、容易被干擾、假陽性高等缺點。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種甲基化DNA檢測方法，所述甲基化DNA檢測方法包括如下步驟:
步驟1，采用亞硫酸鹽處理待測樣品DNA，以及已知的標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA和已知的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA ；
步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，選擇目標(biāo)檢測序列，按照基因序列設(shè)計并合成檢測探針序列；
步驟3，用亞硫酸鹽處理過的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA作為檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)對照和陰性標(biāo)準(zhǔn)對照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測探針與梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA樣品和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)；同時用所述的檢測探針與用亞硫酸鹽處理過的待測樣品DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)；
步驟4，將步驟3所得的反應(yīng)物加入用親和素包被的反應(yīng)載體上，捕捉經(jīng)過了雜交反應(yīng)的被標(biāo)記的探針，并洗滌；
步驟5，加入抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌；
步驟6，加入HRP偶聯(lián)單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測試劑進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后進(jìn)行測定，并計算甲基化DNA的濃度和量;
步驟8，判斷是否存在甲基化DNA。
[0007]優(yōu)選的，所述步驟I中所用的亞硫酸鹽為亞硫酸鈉，濃度為5M，pH5.0。
[0008]優(yōu)選的，所述步驟I的反應(yīng)溫度為60度，反應(yīng)時間為4小時。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟2中確定待測基因的檢測區(qū)域和目標(biāo)檢測序列并設(shè)計合成探針，是指在待測基因中選擇一段序列A，使該序列A含有盡可能多的CpG位點，序列長度為18-120堿基，以序列A經(jīng)亞硫酸鹽處理后的甲基化狀態(tài)作為目標(biāo)檢測序列進(jìn)行檢測探針設(shè)計，以序列A的互補(bǔ)序列作為檢測探針序列I ;在待測基因組DNA中序列A下游區(qū)域的另一條鏈上，選擇一段序列B，使序列B富含CpG位點且不與序列A重合，序列長度為18-120堿基，以序列B經(jīng)亞硫酸鹽處理后的甲基化狀態(tài)作為目標(biāo)檢測序列進(jìn)行檢測探針設(shè)計，以序列B的互補(bǔ)序列作為檢測探針序列2，合成檢測探針，并在合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記。
[0010]優(yōu)選的，所述對合成的探針進(jìn)行標(biāo)記，是指用生物素或具有可檢測性質(zhì)的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
[0011 ] 優(yōu)選的，所述步驟3中的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA，是經(jīng)確定的純的人類甲基化DNA和非甲基化DNA ;所述雜交反應(yīng)是在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟4的反應(yīng)載體是用親和素包被的酶標(biāo)板或玻璃微球。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟5中加入的單克隆抗體是小鼠抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體，所述步驟5的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟6中加入的偶聯(lián)抗體是HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體，所述步驟6的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
優(yōu)選的，所述步驟7中的HRP檢測試劑為HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。
[0015]優(yōu)選的，所述待測樣品為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
[0016]優(yōu)選的，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、直腸細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟8中判斷是否存在甲基化DNA，是對照以標(biāo)準(zhǔn)品檢測到的甲基化DNA相應(yīng)的特征性曲線，判斷待測樣品中是否存在甲基化DNA。
[0018]以重亞硫酸鹽處理過的待測DNA中由于非甲基化的胞嘧啶(C)被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)而甲基化的胞嘧啶(C)維持不變，從而使得DNA鏈上總體的GC含量降低，有利于檢測探針與目標(biāo)DNA的特異性雜交。在用特異性的檢測探針進(jìn)行雜交捕獲后，有效地消除全局性DNA甲基化(Global DNA methylat1n)的影響,使得僅有目標(biāo)檢測區(qū)域的甲基化DNA得以保存，從而可以檢測到樣品中存在的極微量的甲基化DNA。
[0019]相比于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明能夠有效排除非甲基化DNA的影響，使樣品中的甲基化DNA得以富集，因此本發(fā)明具有檢測特異性高、不容易被干擾、假陽性率低等優(yōu)點，同時還具有適用范圍大、方法簡單、需要樣本量小、適用混合樣本等好處，在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明甲基化DNA檢測方法流程圖。

【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附后權(quán)利要求書限定的范圍。
[0022]實施例1，
步驟1，用已知的標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA和甲基化DNA作為檢測樣品；采用濃度為5M的亞硫酸鈉溶液處理待測樣品DNA，反應(yīng)溫度為60度，處理時間為4小時；
步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，按照基因序列設(shè)計并合成能與亞硫酸鹽處理過的甲基化DNA序列互補(bǔ)配對的序列作為檢測的探針序列；在基因組序列相對應(yīng)的兩條鏈上各設(shè)計一條探針序列，使這一段序列長18-120堿基，并使兩條探針的序列不重合；對所設(shè)計并合成的探針的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
步驟3，按1/2的梯度稀釋步驟I所得的用亞硫酸鹽處理過的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA，用步驟2所得的檢測探針在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應(yīng)溫度條件下與梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品進(jìn)行雜交反應(yīng)；
步驟4，將步驟3的反應(yīng)物分別加入用親和素包被的酶標(biāo)板，捕捉經(jīng)過進(jìn)行雜交反應(yīng)的生物素標(biāo)記的探針，并洗滌；
步驟5,加入小鼠抗甲基化胞嘧唳(Ant1-5-MethyIcytosine)單克隆抗體,在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌；步驟6，加入HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體(Goat Ant1-Mouse IgG (H+L)-HRP pAb)，在IxPBST的鹽濃度、pH8.0、0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測試劑(HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺)進(jìn)行反應(yīng)，然后終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，并計算甲基化DNA的濃度和量； 步驟8，判斷是否存在甲基化DNA，判斷方法為:將步驟7中所計算得到的數(shù)據(jù)，對照以標(biāo)準(zhǔn)品檢測到的甲基化DNA相應(yīng)的特征性曲線，判斷待測樣品中是否存在甲基化DNA。
[0023]實施例2，
取正常人和已經(jīng)證實為結(jié)腸癌病人糞便5克，加入5倍體積IxTE并充分混合，用等體積氯仿抽提一次，用0.6倍的異丙醇沉淀獲得總DNA。以此DNA為待測樣品，在與實施例1相同的條件下，檢驗本發(fā)明的實用性。
[0024]其中與實施例1相同的條件，指的是除以實際臨床樣品提取的DNA為待測樣品外，所有操作與實施例1相同。
[0025]實施例二中的待測DNA樣品，為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、各種體液DNA或各種排泄物DNA的樣品。
[0026]所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、直腸細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述各種體液包括血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。
[0027]步驟1，用上述待測DNA樣品為檢測樣品，已知的標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA和甲基化DNA作為陰性對照和陽性對照；采用濃度為5M的亞硫酸鈉溶液分別處理待測樣品DNA和陰性對照、陽性對照，反應(yīng)溫度為60度，處理時間為4小時； 步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域和目標(biāo)檢測序列并設(shè)計合成探針:在待測基因中選擇一段序列A，使該序列A含有盡可能多的CpG位點，序列長度為18-120堿基，以序列A經(jīng)亞硫酸鹽處理后的甲基化狀態(tài)作為目標(biāo)檢測序列進(jìn)行檢測探針設(shè)計，以序列A的互補(bǔ)序列作為檢測探針序列I ;在待測基因組DNA中序列A下游區(qū)域的另一條鏈上，選擇一段序列B，使序列B富含CpG位點且不與序列A重合，序列長度為18-120堿基，以序列B經(jīng)亞硫酸鹽處理后的甲基化狀態(tài)作為目標(biāo)檢測序列進(jìn)行檢測探針設(shè)計，以序列B的互補(bǔ)序列作為檢測探針序列2，合成檢測探針，并在合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記；
步驟3，按1/2的梯度稀釋步驟I所得的用亞硫酸鹽處理過的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和非甲基化DNA，用步驟2所得的檢測探針在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應(yīng)溫度條件下與用亞硫酸鹽處理過的待測樣品DNA、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)；
步驟4，將步驟3的反應(yīng)物分別加入用親和素包被的酶標(biāo)板，捕捉經(jīng)過進(jìn)行雜交反應(yīng)的生物素標(biāo)記的探針，并洗滌；
步驟5,加入小鼠抗甲基化胞嘧唳(Ant1-5-MethyIcytosine)單克隆抗體,在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌；步驟6，加入HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體(Goat Ant1-Mouse IgG (H+L) -HRP pAb)，在IxPBST的鹽濃度、pH8.0、0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測試劑(HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺)進(jìn)行反應(yīng)，然后終止反應(yīng)并用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，并計算甲基化DNA的濃度和量；
步驟8，判斷是否存在甲基化DNA，判斷方法為:將步驟7中所計算得到的待測樣品DNA的數(shù)據(jù)，對照以標(biāo)準(zhǔn)品檢測到的甲基化DNA相應(yīng)的特征性曲線，判斷待測樣品中是否存在甲基化DNA。
[0028]實施例3，
檢測探針的設(shè)計
P16基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的甲基化是肺癌等多種癌癥細(xì)胞具有的特征。P16基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的序列如下，有下劃線的部分為所選定的檢測區(qū)域。
[0029]Homo sapiens pl6 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds,DQ325544.1
基因組 DNA 正鏈(sense strand):
5’ -CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG-3，
基因組 DNA 副鏈(ant1-sense strand):
3’ -GCCTGGCGCACGCGAGCCGCCGACGCCTCTCCCCCTCTCGTCCGTCGCCCGCCGCCCCTCGTCGTACCTCGCCCGCCGCCCCTCGTCGTACCTCGGAAGCCGACTGACCGACCGGTGCCGGCGCCGGGCCCGAGCCCATCTCCTCCACGCCCGCGACGACCTCCGCCCCCGCGACGGGTTGCGTGGCTTATCAATGCCAGCCTCCGGC-5’
正鏈DNA在經(jīng)過亞硫酸鹽處理后的序列(下劃線部分是所設(shè)計的探針位置):
5’ -CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG-3，
副鏈DNA在經(jīng)過亞硫酸鹽處理后的序列(下劃線部分是所設(shè)計的探針位置):
3’ -GCTTGGCGCATGCGAGCTGCTGATGCTTTTTTTTTTTTTGTTTGTTGCTTGCTGCTTTTTGTTGTATTTTGCTTGCTGCTTTTTGTTGTATTTTGGAAGCTGATTGATTGATTGGTGCTGGCGCTGGGCTTGAGCTTATTTTTTTTATGCTTGCGATGATTTTTGCTTTTGCGATGGGTTGCGTGGCTTATTAATGCTAGCTTTTGGC-5，
設(shè)計的上游探針:
5，-b1tin-CCCGCCGCCCGCTACCTACTCTCCCCCTCTCCGCAACCGCCGAACGCACGCGATCCG-3，
設(shè)計的下游探針:
5， -b1tin-CGAACGCTACTAAAAACGAAAACGCTACCCAACGCACCGAATAATTACGATCGAAAACCG-3，上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實施例的例舉，對于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作方法等，應(yīng)當(dāng)理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來予以實施。
[0030]以上為對本發(fā)明實施例的描述，通過對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述甲基化DNA檢測方法包括如下步驟: 步驟1，采用亞硫酸鹽處理待測樣品DNA，以及已知的標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA和已知的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA ； 步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，選擇目標(biāo)檢測序列，按照基因序列設(shè)計并合成檢測探針序列； 步驟3，用亞硫酸鹽處理過的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA作為檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)對照和陰性標(biāo)準(zhǔn)對照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測探針與梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA樣品和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA樣品分別進(jìn)行雜交反應(yīng)；同時用所述的檢測探針與用亞硫酸鹽處理過的待測樣品 DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)； 步驟4，將步驟3所得的反應(yīng)物分別加入到反應(yīng)載體中，捕捉經(jīng)過了雜交反應(yīng)的被標(biāo)記的探針，并洗滌； 步驟5，加入抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌； 步驟6，加入HRP偶聯(lián)單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，并洗滌； 步驟7，加入HRP檢測試劑進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后進(jìn)行測定，并計算甲基化DNA的濃度和量; 步驟8，判斷是否存在甲基化DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟I中所用的亞硫酸鹽為亞硫酸鈉，濃度為5M，pH5.0，所述步驟I的反應(yīng)溫度為60度，反應(yīng)時間為4小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟2中確定待測基因的檢測區(qū)域和目標(biāo)檢測序列并設(shè)計合成探針，是指在待測基因中選擇一段序列A，使該序列A含有盡可能多的CpG位點，序列長度為18-120堿基，以序列A經(jīng)亞硫酸鹽處理后的甲基化狀態(tài)作為目標(biāo)檢測序列進(jìn)行檢測探針設(shè)計，以序列A的互補(bǔ)序列作為檢測探針序列I ;在待測基因組DNA中序列A下游區(qū)域的另一條鏈上，選擇一段序列B，使序列B富含CpG位點且不與序列A重合，序列長度為18-120堿基，以序列B經(jīng)亞硫酸鹽處理后的甲基化狀態(tài)作為目標(biāo)檢測序列進(jìn)行檢測探針設(shè)計，以序列B的互補(bǔ)序列作為檢測探針序列2，合成檢測探針，并在合成的探針的5’端進(jìn)行標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述對合成的探針進(jìn)行標(biāo)記，是指用生物素或具有可檢測性質(zhì)的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟3中的標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA，是經(jīng)確定的純的人類甲基化DNA和非甲基化DNA ;所述雜交反應(yīng)是在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟5中加入的單克隆抗體是小鼠抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體，所述步驟5的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、PH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟6中加入的偶聯(lián)抗體是HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體，所述步驟6的反應(yīng)是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0、0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟7中的HRP檢測試劑為HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述待測樣品為人類正常和癌細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細(xì)胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、直腸細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046680SQ201310077102
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月11日
【發(fā)明者】孫喜元 申請人:蘇州承美生物科技有限公司