一種分離反硝化細菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分離反硝化細菌的方法，首先制備牛肉膏一蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入瓊脂后加熱滅菌，冷凝成平板固體培養(yǎng)基，然后將混合微生物菌群均勻涂布于牛肉膏一蛋白胨平板，靜置冷凝后于生化培養(yǎng)箱30℃下培養(yǎng)7-10天，在形成的菌落中挑取單菌落到牛肉膏一蛋白胨平板劃線純化得到純菌，然后將純菌菌苔接種于氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液，采用格利斯試劑直接點滴入適量培養(yǎng)液中進行硝化活性鑒定，鑒定試驗以不接純化菌株的氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液作空白對照。本發(fā)明通過牛肉膏一蛋白胨瓊脂平板分離，氨氧化能力鑒定液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和格利斯試劑顯色等步驟，可從混合微生物系中分離篩選反硝化細菌，具有簡便，重復性好，準確可靠的特點。
【專利說明】一種分離反硝化細菌的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離反硝化細菌的方法，具體涉及一種從處理人工模擬城市生活污水系統(tǒng)中分離篩選，并鑒定具有硝化活性的反硝化細菌的方法，屬于微生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]水體環(huán)境中構成氮循環(huán)的主要環(huán)節(jié)是:生物體內有機氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用。自然水體中的氮來自水生動植物尸體及排泄物的積累及腐敗，含氮有機化合物通過營腐生細菌分解成氨氮、硫化氫等小分子無機物，然后由各種自養(yǎng)型微生物主要為硝化細菌的作用，轉化為亞硝酸鹽和硝酸鹽，這三種氮素一方面被藻類和水生植物吸收，另一方面硝酸鹽在缺氧條件下被反硝化細菌通過脫氮作用將硝態(tài)氮轉化為氮氣逸出水體，大氣中的氮被固氮菌利用重新回到水體。因此反硝化細菌在水體環(huán)境的維護和改良方面起著十分重要的作用，水體環(huán)境中反硝化細菌含量不足，就會造成水體環(huán)境亞硝酸鹽含量高，水體就不能應用水產養(yǎng)殖，農業(yè)灌溉，特別是在處理高濃度生活污水方面，通過現(xiàn)有污水處理方法不容易達到良好除氮的效果，而通過人為給待處理水體投放反硝化細菌，由于反硝化細菌本身繁殖速度較快，大概在十八分鐘繁殖一代，因此在短時間內都能產生良好的除氮效果。
[0003]目前對反硝化菌的研究中，真菌被認為是數(shù)量最大、效率最髙的反硝化菌，如青霉菌和香曲霉菌、輪枝菌等等。此外，某些放線菌、細菌甚至藻類在自然界或實驗室的純培養(yǎng)中，也被確定為具有硝化能力的異養(yǎng)微生物。如反硝化假
單胞菌、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerwgifl1s)、焚光假單胞菌iPseudomonas/7Wore1Scefl1S)、產鋮桿菌、節(jié)抒菌、異產械菌iAlcaligenus faecal is) > PB16假單胞菌以及一些新發(fā)現(xiàn)的菌種(或屬)等等。
[0004]為了有效的調控、監(jiān)測和評價硝化作用，對脫氮系統(tǒng)活性污泥中微生物種群分布進行一定的研究，建立的一套新型可靠的分離反硝化細菌的分離方法對系統(tǒng)中混合微生物菌群中的反硝化細菌進行分離活性鑒別顯得十分重要和必要，具有重要的理論和應用價值。
[0005]Winogradsky認為:自養(yǎng)硝化作用不能在牛肉明膠平板上發(fā)生生長,硝化細菌,特別是銨鹽氧化細菌，只能在無機鹽中運用特異性的化能自養(yǎng)方式生活，根本不能在營養(yǎng)明膠或營養(yǎng)瓊脂平板上生長。據(jù)此在分離自養(yǎng)硝化細菌的過程中，為了證實分離自養(yǎng)硝化菌株的培養(yǎng)液中，是否存在有機營養(yǎng)微生物污染，就會用到肉膏瓊脂平板來進行檢驗，即肉膏瓊脂營養(yǎng)平板成為了檢驗“反硝化細菌”純度的輔助工具，其上生長的為非分離目的反硝化菌株的雜菌，而從不用以分離自養(yǎng)硝化細菌。
[0006]20世紀50年代，Quasel等對傳統(tǒng)的硝化作用反硝化細菌發(fā)生說提出了質疑，并以丙酮肟為唯一碳氮源，采用土柱滲濾進行選擇性加富培養(yǎng)，獲得了具有產生N02-能力的反硝化細菌菌株，后來的研究者多采用相似的方法進行反硝化活性菌株的分離。目前常用的培養(yǎng)基有:丙酮酸肟，乙酰胺及其它一些有機物如肟、吡啶等。這些方法的缺點是樣品前處理比較繁瑣，耗時費力，重復性差，分離的菌株單一且缺乏代表性。
[0007]經文獻檢索發(fā)現(xiàn)，《微生物世界》2001年第五期，公開了一種分離鑒定純化反硝化微生物的方法:將待檢樣品涂布于牛肉浸膏一蛋白胨瓊脂平板后，挑取單菌落至上述牛肉浸膏一蛋白胨瓊脂平板繼續(xù)劃線純化，經28°C培養(yǎng)10天，格利斯試劑直接點滴到平板，進行硝化活性確認，并以不接菌的平板作空白對照。雖然所述方法操作相對簡便且所需時間較短，因此具較高實用性，然而，其所述的方法存在以下不足:
在應用上述方法時，由于試劑的純度不高所帶來的影響不易排除，因此需要對培養(yǎng)基的成分做較髙要求，比如對其中的亞硝酸鹽及硝酸鹽的含量需要進行提前的驗證。由于目前國內市售的蛋白胨及牛肉青中成分復雜，如果為了降低成本而使用市面上較易購得的蛋白胨后，往往在實驗分離過程中的涂布及劃線過程前，菌落周圍就由于培養(yǎng)基的影響而具有一定量的亞硝酸鹽或硝酸鹽，這樣勢必給實驗結果的判斷帶來很大的影響，從而影響到對反硝化細菌的分離結果。


【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于針對以上所述各種分離方法的不足，提出一種新的分離篩選反硝化細菌的方法，簡化實驗操作步驟，降低實驗試劑中雜質對實驗結果的干擾，從而提高檢出率。
[0009]為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明首先制備牛肉膏一蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入瓊脂后加熱滅菌，冷凝成平板固體培養(yǎng)基，然后將混合微生物菌群均勻涂布于牛肉膏一蛋白胨平板，靜置冷凝后于生化培養(yǎng)箱30*C下培養(yǎng)7-10天，在形成的菌落中，挑取單菌落到牛肉膏一蛋白胨平板，劃線純化得到純菌，然后將純菌菌苔接種于氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液，采用格利斯試劑直接點滴入適量培養(yǎng)液中，進行硝化活性鑒定，鑒定試驗以不接純化菌株的氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液作空白對照。
[0010]本發(fā)明的方法具體包括如下步驟:
1、牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基的制備:按牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaC15g，100mL蒸餾水的比例配制液體培養(yǎng)基，先將牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶解于蒸餾水中，用lmol/L的NaOH調節(jié)培養(yǎng)基pH為7.0 8.0形成液體培養(yǎng)基，經121°C:高溫高壓滅菌15 20分鐘。在上述牛肉膏一蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入15 20g瓊脂，加熱使其充分溶解后裝于錐形瓶中，于121 °C:下滅菌15 20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至45 50°C后傾倒至滅菌的培養(yǎng)皿中，靜置冷凝成平板，得到牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基。
[0011]2、混合微生物菌群的稀釋:
1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密閉后振蕩稀釋，得到稀釋10倍的樣品。然后取稀釋后的樣品與無菌蒸餾水按同樣的比例再次進行振蕩稀釋，共進行10次，每次稀釋倍數(shù)為10倍，得到ID種不同稀釋度的樣品。
[0012]3、混合微生物菌群的涂布:
從各個稀釋度的樣品中均取0.1mL分別加入到制備好的牛肉育一蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用滅菌的涂布棒將稀釋樣品分散攤開使其千燥。每個稀釋度的樣品三個重復，每變化一次稀釋度系列，要重新?lián)Q移液管。靜置冷凝后，將培養(yǎng)基平板扣過來放于生化培養(yǎng)箱30°C下培養(yǎng)7-10天。
[0013]4、細菌的純化分離:
在形成菌落的平板內，挑選出90-110個孤立菌落的平板。在水平層流雙人凈化工作臺上，把裝有選出平板的培養(yǎng)皿中的孤立菌落用接種環(huán)挑出，移植到牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基上，30°C條件下培養(yǎng)7-10天，然后，再用接種環(huán)挑取一菌環(huán)細菌菌苔放到無菌水中，充分振蕩。用此細菌懸液，按照活菌數(shù)測定方法在平板上涂布，使其在培養(yǎng)皿上形成30-50個孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反復2-3次，即可得到經分離純化后的反硝化細菌菌株。
[0014]5、氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液的制備:
氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液的制備:取葡糖糖5g/L，(NH4)2S04 0.5g/L，NaCL 0.3g/L，K2HP04 1.0g/L, MgS04.7H20 0.3g/L, FeS04.7H20 0.03g/L, CaC03 7.5g/L，充分混合溶解后分裝于玻璃試管中，每只試管分裝3mL，用硅膠塞塞緊，于110°C下高壓滅菌20min，制得氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液；
6、格利斯試劑的配制:
稱取對氨基苯璜酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和10mL蒸餾水的混合液中，過濾后制得對氨基苯磺酸溶液；稱取0.1ga-萘胺溶解于10mL熱蒸餾水中，冷卻后，加入30mL冰醋酸，過濾后制得α-萘胺溶液。將兩種溶液等量混合成格利斯試劑使用。
[0015]7、液體純培養(yǎng)的硝化活性驗證:
將經分離純化后獲得的反硝化細菌菌株用接種環(huán)挑取一菌環(huán)菌苔接種于氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液，于30°C條件下培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)期間每隔3天取2mL培養(yǎng)液至潔凈試管，將格利斯試劑1-2滴直接點滴入試管中進行硝化活性確認，并以不接純化菌株的氨氧化能力鑒定培養(yǎng)基作空白對照。若培養(yǎng)液變紅即可確定菌株具有硝化活性。
[0016]在將分離純化后的單菌落菌苔移至液體氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液的過程中，注意接種環(huán)切莫觸碰瓊脂，以免瓊脂培養(yǎng)基中的雜質帶入氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液，從而影響鑒定結果；且移入氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液時，注意不要觸碰試管壁。
[0017]本發(fā)明中所適用的格利斯試劑需要在4°C冰箱中避光保存，要在兩周內使用，一旦發(fā)現(xiàn)混濁需要重新配置。
[0018]本發(fā)明通過牛肉青一蛋白胨瓊脂平板分離，氨氧化能力鑒定液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和格利斯試劑顯色等步驟，可從混合微生物系中分離篩選反硝化細菌，與現(xiàn)在所使用的方法相t匕，具有簡便，重復性好，分離菌株效果好，準確可靠的特點。

【具體實施方式】
以下結合具體的實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步描述。
[0019]本發(fā)明的一個實施例，是在處理城市生活模擬污水的高效膜生物反應器中，對反硝化細菌進行了分離篩選過程。
[0020]方法使用的主要實驗儀器和設備有:
立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產，型號YXQ-LS-50SI ； 生化培養(yǎng)箱:廣東省醫(yī)療器械廠生產，型號LRH-250A ；
水平層流雙人凈化工作臺:江蘇蘇州凈化設備有限公司生產，型號HS-1300 ； 恒溫振蕩器:江蘇常州國華電器有限公司生產，型號SHZ-82 ；
顯微鏡:日本Olympus生產，型號BX51TF。
[0021]本發(fā)明的方法按如下步驟進行:1、牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基的制備:
制備牛肉膏一蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方如下:牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，
NaCl5g/L。
[0022]制作過程:稱取牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaC15g溶解于100mL蒸餾水中，用Imol/L的NaOH調節(jié)培養(yǎng)基pH為7.0-7.2，形成液體培養(yǎng)基，經高溫高壓滅菌(121°C，15_20min)待用。
[0023]在上述牛肉膏一蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入15_20g瓊脂，加熱使其充分溶解后裝于錐形瓶中，于121°C下滅菌15-20min，待培養(yǎng)基冷卻至45-50°C后傾倒至滅菌的培養(yǎng)皿中，靜置待冷凝成平板。使用時可放在沸水中溶解后使用。
[0024]2、混合微生物菌群的稀釋:
吸取膜生物反應器中的活性污泥20mL，加入到盛有ISOmL的無菌蒸餾水和玻璃珠的500mL三角瓶中，塞上滅菌的棉花塞，于恒溫振蕩器上以100r/min轉速30°C下振蕩10小時，而后取5mL稀釋液接于含有45mL無菌蒸餾水和玻璃珠的250mL三角瓶中，塞上滅菌的硅膠塞，于恒溫振蕩器上以lOOr/min轉速振蕩10分鐘。這是第二次稀釋倍數(shù)為10的稀釋，而后迅速用滅菌的移液管吸取1mL加入到90mL滅菌的無菌水中。第三次稀釋完畢后塞上經滅菌的棉塞，用手振蕩40次，取ImL加到9mL的無菌水中，此為第四次稀釋，而后一直再按照第三次稀釋方法連續(xù)稀釋6次。共進行10次稀釋，得到10種不同稀釋度的樣品。
[0025]3、混合微生物菌群的涂布:
從各個稀釋度的樣品中均取0.1mL分別加入到制備好的牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用滅菌的涂布棒將稀釋樣品分散攤開使其干燥。每個稀釋度的樣品三個重復，每變化一次稀釋度系列，要重新?lián)Q移液管。靜置冷凝后，將培養(yǎng)基平板扣過來放于生化培養(yǎng)箱30°C下培養(yǎng)7-10天。
[0026]4、細菌的純化分離:
在形成菌落的平板內，挑選出90-110個孤立菌落的平板。在水平層流雙人凈化工作臺上，把裝有選出的平板的培養(yǎng)皿中的孤立菌落用接種環(huán)挑出，劃線分離。
[0027]通常，可以認為一個菌落是由一個細胞發(fā)育來的，因此是由一個種類細菌組成的?？墒牵灿杏煞N類不同的幾個細菌細胞形成一個菌落的可能性。所以，為慎重起見需要對這些菌進行純化。待形成菌落后，再用接種環(huán)移植到固體培養(yǎng)基上，30°C條件下培養(yǎng)7-10天。然后，再挑取一接種環(huán)的細菌菌苔放到無菌水中，充分振蕩。用此細菌懸液，按照活菌數(shù)測定方法在平板上涂布，使其在培養(yǎng)皿上形成30-50個孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反復2-3次，即可得到經分離純化后的異養(yǎng)菌株。并以不接菌的平板做空白對照。
[0028]5、氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液的制備:
配方如下:葡萄糖 5g/L, (NH4) 2So4 0.5g/L，NaCl 0.3g/L，K2HP04 1.0g/L,MgSo4.7H2o 0.3g/L, FeS04.7H2o 0.03g/L, CaC03 7.5g/L。
[0029]制作過程:稱取以上各物質相應質量，充分混合溶解后將其分裝于玻璃試管中，規(guī)格為18x150毫米，每只試管分裝3mL，用硅膠塞塞緊，于110°C下高壓滅菌20min。制得氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液。
[0030] 6、格利斯試劑的配制:格利斯試劑由兩種溶液混合使用。1、對氣基苯確酸溶液:稱取對氨基苯璜酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和10mL蒸飽水的混合液中，過濾，避光保存，此試劑一個月內可用；2、α -萘胺溶液:稱取0.1g α -萘胺溶解于10mL熱蒸餾水中，冷卻后，加入30mL冰醋酸，過濾，避光保存，此試劑一個星期內可用。
[0031]臨用前兩種溶液等量混合。
[0032]7、液體純培養(yǎng)的反硝化活性驗證:
將獲得的經分離純化后的反硝化細菌菌株，由牛肉膏一蛋白胨固體培養(yǎng)基中，用接種環(huán)挑取一菌環(huán)純菌菌苔，接種于氨氧化能力鑒定培養(yǎng)基，3 (TC條件下培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)期間每隔3天取2mL培養(yǎng)液至潔凈試管，將格利斯試劑1-2滴直接點滴入試管中進行硝化活性確認，并以不接純化菌株的氨氧化能力鑒定培養(yǎng)基作空白對照。如現(xiàn)紅色乃至褐色，則說明由于硝化作用而積蓄了亞硝酸鹽。2-3分鐘后再在未顯色的試管中用小藥匙加入鋅粉少許，靜置，觀察是否呈現(xiàn)紅色。如加入鋅粉后顯紅色，則說明培養(yǎng)液中的產生了硝酸鹽。即菌株也具有硝化活性，初步確認為反硝化活性菌。
[0033]本發(fā)明由膜生物反應器系統(tǒng)的混合菌群中分離篩選出了具有硝化活性的細菌，分別編號為Al及A2，并分別進行了相關的細菌學鑒定以及生理生化試驗研究，結果如下:
菌株Al在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)1-2天后形成的菌落呈乳白色，不透明，革蘭氏陽性芽抱桿菌，細菌大小為(0.5-0.6) μ m(l.6-2.6) μ m,具球桿變化周期，60°C不生長，不具抗酸性。接觸酶陽性，V-P試驗陰性，淀粉水解陰性，厭氧洋菜不生長，葡萄糖不產酸，除個別生理生化特征(可利用葡萄糖做有機碳源等)外，其主要特征與也《7^?macro ides 基本一致。
[0034]菌株A2在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)I天后形成的菌落呈乳白色偏灰，不透明，細菌大小為(0.4-0.6) μ m X (1.2-2.1) μ m，具球桿變化周期。革蘭氏染色實驗中，菌株在培養(yǎng)初期為呈陽性的芽孢桿菌，但革蘭氏染色不穩(wěn)定，在生長至7天左右染色卻呈陰性，且菌落變至褐色。6°C不生長，不具抗酸性。接觸酶陽性，V-P試驗陽性，淀粉水解陰性，厭氧洋菜不生長，葡萄糖產酸，除個別生理生化特征(不具抗酸性，不在銨態(tài)氮上生長)外，其主要特征與短芽孢桿菌屬Qirevibeicillus')基本一致。
【權利要求】
1.一種分離反硝化細菌的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基的制備:按牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaC15g，100mL蒸餾水的比例配制液體培養(yǎng)基，先將牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶解于蒸餾水中，用lmol/L的NaOH調節(jié)培養(yǎng)基pH為7.0 8.0形成液體培養(yǎng)基，經121°C高溫高壓滅菌15 20分鐘；在上述牛肉膏一蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入15 20g瓊脂，加熱使其充分溶解后裝于錐形瓶中，于121°C下滅菌15 20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至45 50°C后傾倒至滅菌的培養(yǎng)皿中，靜置冷凝成平板，得到牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基； 2)混合微生物菌群的稀釋:將樣品與無菌蒸館水按體積比為1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密閉后振蕩稀釋，得到稀釋10倍的樣品，然后取稀釋后的樣品與無菌蒸餾水按同樣的比例再次進行振蕩稀釋，共進行10次，每次稀釋倍數(shù)為10倍，得到10種不同稀釋度的樣品； 3)混合微生物菌群的涂布:從各個稀釋度的樣品中均取0.1mL分別加入到制備好的牛肉膏_蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用滅菌的涂布棒將稀釋樣品分散攤開使其干燥，每個稀釋度的樣品三個重復，每變化一次稀釋度系列，要重新?lián)Q移液管，靜置冷凝后，將培養(yǎng)基平板扣過來放于生化培養(yǎng)箱30°C下培養(yǎng)7-10天； 4)細菌的純化分離:在形成菌落的平板內，挑選出90-110個孤立菌落的平板，在水平層流雙人凈化工作臺上，把裝有選出平板的培養(yǎng)皿中的孤立菌落用接種環(huán)挑出，移植到牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基上，30°C條件下培養(yǎng)7-10天，然后，再用接種環(huán)挑取一菌環(huán)細菌菌苔放到無菌水中，充分振蕩，用此細菌懸液按照活菌數(shù)測定方法在平板上涂布，使其在培養(yǎng)皿上形成30-50個孤立的菌落，而后把孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，反復2-3次，即可得到經分離純化后的 反硝化細菌菌株； 5)氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液的制備:取葡糖糖5g/L，(NH4)2S040.5g/L，NaCl0.3g/L，K2HP04 1.0g/L, MgS04.7H20 0.3g/L, FeS04.7H20 0.03g/L, CaC03 7.5g/L，充分混合溶解后分裝于玻璃試管中，每只試管分裝3mL，用硅膠塞塞緊，于110°C下高壓滅菌20min，制得氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液； 6)格利斯試劑的配制:稱取對氨基苯璜酸0.5g，溶于30mL冰醋酸和10mL蒸餾水的混合液中，過濾后制得對氧基苯硪酸洛液:稱取0.1ga-萘胺溶解于10mL熱蒸餾水中，冷卻后，加入30mL冰醋酸，過濾后制得α -萘胺溶液；將兩種溶液等量混合成格利斯試劑使用； 7)液體純培養(yǎng)的硝化活性驗證:將經分離純化后獲得的反硝化細菌菌株用接種環(huán)挑取一菌環(huán)細菌菌苔接種于氨氧化能力鑒定培養(yǎng)液，30°C條件下培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)期間每隔3天取2mL培養(yǎng)液至潔凈試管，將格利斯試劑1-2滴直接點滴入試管中進行硝化活性確認，并以不接純化菌株的氨氧化能力鑒定培養(yǎng)基作空白對照，若培養(yǎng)液變紅即可確定菌株具有反硝化活性。
【文檔編號】C12R1/07GK104046575SQ201310079767
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權日:2013年3月13日
【發(fā)明者】李朝均 申請人:都江堰惠農生物技術有限責任公司