專利名稱：多種蛋白酶水解蛋清蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，涉及利用蛋白酶水解雞蛋清蛋白的方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱，按水解多肽方式可將蛋白酶分成內(nèi)肽酶和外肽酶兩大類。內(nèi)肽酶從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部將肽鍵切斷，外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基末端逐個(gè)將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨基肽酶，后者為羧基肽酶。按其活性中心和最適PH值，又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等。按其反應(yīng)的最適PH值，分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的蛋白酶，主要是內(nèi)肽酶。蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋白酶對(duì)所作用的底物有專一性，一種蛋白酶只水解蛋白質(zhì)中特定肽鍵，如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵。工業(yè)上蛋白酶制劑生產(chǎn)以利用枯草桿菌、棲土曲霉等發(fā)酵制取為主。蛋白酶具有特異性，由于不同蛋白酶的酶解位點(diǎn)不同，同樣的蛋白質(zhì)在不同的水解酶作用下可產(chǎn)生不同的肽片段，雖能根據(jù)原料蛋白的組成和酶的專一性作為參考，但仍存在較大的盲目性。許多生物活性肽用胃腸道蛋白酶水解，常用的胃蛋白酶和胰蛋白酶，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性肽、鈣結(jié)合磷酸肽，常用胰蛋白酶來制取。目前商業(yè)用酶以微生物酶為主，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復(fù)合酶等。植物蛋白酶及少量動(dòng)物蛋白酶也有應(yīng)用。針對(duì)不同的底物，選擇蛋白酶應(yīng)考慮到的因素:1、避免水解過程中產(chǎn)生苦味肽；2、能有效的降低游離氨基酸數(shù)量；3、水解反應(yīng)結(jié)束后蛋白酶易于變性失活；4、蛋白酶安全性與經(jīng)濟(jì)性。雞蛋蛋白主要在雞蛋清中，蛋清中除水分外，主要成分是蛋白質(zhì)，含有人體所必需的多種氨基酸，包括賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸等，氨基酸配比均衡性好，是機(jī)體利用率最高的一種蛋白質(zhì)，雞蛋蛋白一般被認(rèn)為是全價(jià)蛋白質(zhì)，常用作評(píng)價(jià)其它食物蛋白營養(yǎng)價(jià)值的參比蛋白。蛋清蛋白本身的某些性質(zhì)，如不耐熱及易凝固，限制了其在食品加工中的應(yīng)用范圍。雞蛋清蛋白質(zhì)作為一種全價(jià)蛋白，其序列中以非活性狀態(tài)存在具有生物活性的肽段，采用適當(dāng)?shù)乃夥椒▽⑦@些生物活性肽釋放出來并發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用，同時(shí)改善蛋清蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，拓寬其應(yīng)用范圍，也是生產(chǎn)蛋白飲料的一種加工手段。蛋白質(zhì)水解一般分為酸法水解和酶法水解。酸法水解雖水解迅速徹底，但會(huì)產(chǎn)生腐黑質(zhì)，而且如色氨酸、絲氨酸等氨基酸被破壞。酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解是一種不完全、不徹底的水解反應(yīng)，其水解產(chǎn)物主要是肽而不是氨基酸，水解過程中不產(chǎn)生消旋作用，氨基酸未被破壞，與基因工程、化學(xué) 合成等方法相比，酶法水解安全性極高、反應(yīng)條件溫和、易于控制水解度，而且水解產(chǎn)物除氨基酸外，還含有大量生物活性肽，國內(nèi)外已有利用蛋清蛋白肽液生產(chǎn)功能性飲料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用多種蛋白酶同時(shí)或分階段水解雞蛋清蛋白的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:首先獲取雞蛋清并加熱變性，然后利用復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、堿性蛋白酶(Alcalase)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)中的兩種或以上進(jìn)行同時(shí)或者分階段水解雞蛋清蛋白(酶來自諾維信公司)，制得雞蛋清蛋白水解液。當(dāng)采用同時(shí)水解方法時(shí)，其步驟為:(1)先將新鮮雞蛋洗凈，然后分離出蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水按照體積比1:3混合后在95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料；(2)以上述蛋清原料為酶水解底物,先后加入喊性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶:調(diào)節(jié)蛋清體積:蒸餾水體積為1: 3，ρΗ7.5，水浴預(yù)熱到550C，加入堿性蛋白酶4.0%，ρΗ7.5，反應(yīng)4小時(shí)，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度55°C，加入風(fēng)味蛋白酶2%，反應(yīng)2小時(shí)；進(jìn)行分步水解，獲得雞蛋清的蛋白水解液。當(dāng)采用分階段水解時(shí)，可按前述步驟(I)制得酶水解用的原料；然后先后加入復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、堿性蛋白酶(Alcalase)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)中的至少兩種進(jìn)行分步水解；各種酶的水解條件可按各自的酶解條件進(jìn)行調(diào)控。復(fù)合蛋白酶(Protamex)的最佳水解條件為:溫度55°C、pH7.0、酶量為7%、蛋清濃度為1:5，Protamex6h酶解物的蛋白殘留率為6.82%，水解度達(dá)7.40%。中性蛋白酶(Neutrase)最佳水解條件為溫度55°C、pH6.0、酶量為5%、蛋清濃度為1:5, Neutrase6h酶解物的蛋白殘留率為24.28%，水解度達(dá)3.71%。堿性蛋白酶(Alc a lase)最佳水解條件為溫度55°C、pH7.5、酶量為6%、蛋清濃度為1:3或1:4，Alcalase6h酶解物的水解度可達(dá)18.73%。風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)最佳水解條件為溫度55°C、pH6.5、酶量為6%、蛋清濃度為1:5，F(xiàn)lavourzyme6h酶解物的蛋白殘留率為27.68%，水解度達(dá)38.75%。例如，先后加入堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行分步水解，獲得雞蛋清的蛋白水解液的步驟是:以上述經(jīng)變性的蛋清原料為酶水解底物，調(diào)節(jié)蛋清濃度為1:5 (純蛋清體積:蒸餾水體積)，ρΗ7.5，水浴預(yù)熱到55°C，加入堿性蛋白酶2.0%，ρΗ7.5，反應(yīng)4小時(shí)，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度55°C，加入風(fēng)味蛋白酶4.0%，反應(yīng)2小時(shí)。由于單一的蛋白酶水解蛋白質(zhì)具有專一性，單一使用只能使底物中相應(yīng)的肽鍵斷裂，當(dāng)聯(lián)合使用不同的酶，在酶作用位點(diǎn)方面可以產(chǎn)生互補(bǔ)性，提高水解度，增加蛋清蛋白肽得率。
具體實(shí)施例方式I)獲得酶水解用的底物原料將新鮮雞蛋洗凈，然后分離蛋清蛋黃，獲得蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水水按照體積比I: 3混合，95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料。實(shí)例1:以此蛋清原料為酶水解底物，加入復(fù)合蛋白酶(Protamex)中性蛋白酶(Neutrase )、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme )同時(shí)水解,獲得雞蛋清的蛋白水解液。
調(diào)節(jié)蛋清濃度為1:5 (蛋清體積:蒸餾水體積)，用HCl調(diào)節(jié)到pH6.5，水浴預(yù)熱到55 °C,加入復(fù)合蛋白酶(Protamex) 1.5%、中性蛋白酶(Neutrase) 1.5%、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)3.0% (占稀釋后蛋清重量的比),于恒溫水浴振蕩器(120r/min)中進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解反應(yīng)期間用PH計(jì)監(jiān)測蛋清液的pH，并通過滴加NaOH溶液來調(diào)節(jié)pH，使pH保持在6.5，反應(yīng)6小時(shí)后，收集蛋清蛋白水解液,置沸水浴中滅活酶20min，使酶解反應(yīng)終止。凱氏定氮法測水解物總含氮量，甲醛滴定法測定水解物游離氨基酸含量。
權(quán)利要求
1.一種多種蛋白酶水解蛋清蛋白的方法，其特征在于首先獲取雞蛋清并加熱變性，然后利用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中的兩種或以上進(jìn)行同時(shí)或者分階段水解雞蛋清蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)先將新鮮雞蛋洗凈，然后分離出蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水按照體積比1:3混合后在95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料； (2)以上述蛋清原料為酶水解底物，調(diào)節(jié)蛋清與蒸餾水體積比為1:4，按稀釋后蛋清的重量比加入復(fù)合蛋白酶1.5%、中性蛋白酶3.0%、風(fēng)味蛋白酶1.5%同時(shí)水解；在pH 6.5，55°C條件下反應(yīng)5小時(shí)，獲得雞蛋清的蛋白水解液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)先將新鮮雞蛋洗凈，然后分離出蛋清，蛋清與滅菌蒸餾水按照體積比1:3混合后在95°C加熱變性20分鐘，得酶水解用的原料； (2)以上述蛋清原料為酶水解底物，先后加入堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶:調(diào)節(jié)蛋清體積:蒸餾水體積為1:3，pH 7.5，水浴預(yù)熱到55°C，加入堿性蛋白酶4.0%，pH 7.5，反應(yīng)4小時(shí)，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度55°C，加入風(fēng)味蛋白酶2%，反應(yīng)2小時(shí)；進(jìn)行分步水解，獲得雞蛋清的 蛋白水解液。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，涉及利用蛋白酶水解雞蛋清蛋白的方法。該方法是首先獲取雞蛋清并加熱變性，然后利用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中的兩種或以上進(jìn)行同時(shí)或者分階段水解雞蛋清蛋白。本發(fā)明聯(lián)合使用不同的酶，在酶作用位點(diǎn)方面可以產(chǎn)生互補(bǔ)性，提高水解度，增加蛋清蛋白肽得率。
文檔編號(hào)C12P21/06GK103146791SQ201310080858
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者趙國琦, 袁宇, 霍永久, 林淼, 徐嗣昌, 金曉君, 鄧波波 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)