專利名稱：一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)包括器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、莖尖組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。其中愈傷組織培養(yǎng)最常見(jiàn)，因?yàn)槌o尖分生組織培養(yǎng)和少數(shù)器官培養(yǎng)外，其它類型都要經(jīng)歷愈傷組織階段才能產(chǎn)生再生植株，其原理是利用植物細(xì)胞的全能性，愈傷組織的形成在組織培養(yǎng)技術(shù)中有著至關(guān)重要的地位，許多藥用植物中的活性成分可直接通過(guò)愈傷組織進(jìn)行合成。珊瑚菜是生長(zhǎng)在北太平洋沿海地區(qū)沙灘地的一種傘形科多年生草藥。在我國(guó)分布于遼寧、山東、江蘇等地，生長(zhǎng)于海邊沙灘或人工栽培，原為海灘沙生植物群落的建群種之一，對(duì)海岸固沙和鹽堿土改良具重要作用，但隨著海灘的濫用開(kāi)發(fā)和對(duì)該植物的過(guò)度采挖，使其數(shù)量日趨減少，已經(jīng)處于瀕臨滅絕的境地，被列為中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物。而人工栽培技術(shù)要求高，種子萌發(fā)率低，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，掠奪式的采集野生資源又會(huì)危及生態(tài)平衡。珊瑚菜具有較高的藥用價(jià)值，其根狀莖和根可作生藥，被收入日本和中國(guó)藥典。珊瑚菜根(北沙參)中含有多種香豆素和香豆素苷，主要有歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、佛手素、花椒毒酚、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、東莨菪素、紫花前胡苷元等。其中補(bǔ)骨脂素、歐前胡素和異歐前胡素三種香豆素的含量可作為評(píng)價(jià)北沙參不同部位質(zhì)量及產(chǎn)地加工方法的標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，北沙參在體內(nèi)具有抗癌作用的主要活性成分為呋喃香豆素，其中濃度為50μ g/mL的歐前胡素和異歐前胡素抑制活性最強(qiáng)。大多數(shù)藥用植物的根不僅可提供生物藥學(xué)成分，而且也是農(nóng)藥、風(fēng)味調(diào)料、染料和香料的重要來(lái)源，而根中的有效成分是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，因此利用根的體外培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期，在植物細(xì) 胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，目前美國(guó)、英國(guó)、加拿大、日本、中國(guó)及韓國(guó)都在對(duì)藥用植物毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)行著大量的基礎(chǔ)研究，研究表明，毛狀根具有細(xì)胞培養(yǎng)和一般器官培養(yǎng)所不能兼?zhèn)涞奶攸c(diǎn)，幾乎所有雙子葉植物中由根部合成的次級(jí)代謝物質(zhì)都可以通過(guò)毛狀根來(lái)生產(chǎn)，這一生物技術(shù)為植物有用成分的大量生產(chǎn)提供了新的途徑，日益引起人們的關(guān)注。利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染誘導(dǎo)藥用植物形成毛狀根，并對(duì)毛狀根進(jìn)行離體培養(yǎng)增殖，是對(duì)藥用資源植物可持續(xù)利用的有效途徑之一。毛狀根具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)增殖不需要加入激素、分化程度高、產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力強(qiáng)、可以通過(guò)基因工程的手段來(lái)增加次生代謝產(chǎn)物的含量、并能夠合成某些懸浮細(xì)胞培養(yǎng)所不能合成的次生代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受諸多專家研究者的重視。但是目前對(duì)于珊瑚菜活性物質(zhì)的誘導(dǎo)及生產(chǎn)還處于利用常規(guī)組織培養(yǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)手段的水平，關(guān)于珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)尚未有人研究
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，利用本發(fā)明所述方法誘導(dǎo)的珊瑚菜毛狀根具有生長(zhǎng)迅速，周期短，次級(jí)代謝產(chǎn)物相對(duì)產(chǎn)量高等特點(diǎn)，可用于工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜香豆素。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，它包括以下步驟:(I)獲得珊瑚菜無(wú)菌苗；(2)培養(yǎng)供感染用的發(fā)根農(nóng)桿菌；(3)轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng):取長(zhǎng)勢(shì)較好的珊瑚菜無(wú)菌苗，切取根、葉柄或葉片作為外植體，在其表面劃出傷口用于感染，放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡，然后放入MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，直至外植體周邊出現(xiàn)菌斑；(4)誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生:將出現(xiàn)菌斑的外植體清洗后，放入含有頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期更換1/2MS培養(yǎng)基，在更換的培養(yǎng)基中逐步降低頭孢噻肟鈉的濃度，直到在完全除掉頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得除菌的毛根系；(5)毛狀根的培養(yǎng)增殖:將除菌完全、生長(zhǎng)快速的毛狀根接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)增殖，獲得大量毛狀根。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(I)中選擇飽滿的珊瑚菜種子，滅菌，后接種于MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)中所用菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌1.2556。

對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)中發(fā)根農(nóng)桿菌的感染菌液最佳濃度為 OD600=0.08。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中所述外植體優(yōu)選為無(wú)菌苗的根，其次為葉柄，再次為葉片。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中珊瑚菜無(wú)菌苗放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡15-30min。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中共培養(yǎng)時(shí)間為2-5d。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(4)中將外植體放入含有頭孢噻肟鈉300mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中，于25°C黑暗培養(yǎng)13_16d。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(4)中在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)每7-10d換一次培養(yǎng)基，最初頭孢噻肟鈉的濃度為300mg/L，逐步降低Cef的濃度為每換一次培養(yǎng)基降低50mg/L頭孢噻肟鈉。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):利用分光光度法測(cè)定珊瑚菜毛狀根中香豆素含量的波長(zhǎng)為325nm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明以珊瑚菜葉片為實(shí)驗(yàn)材料，誘導(dǎo)愈傷組織的生成，并利用石蠟切片技術(shù)對(duì)其發(fā)生進(jìn)行了跟蹤觀察，為珊瑚菜組織培養(yǎng)提供理論依據(jù)，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明利用已形成的愈傷組織，通過(guò)調(diào)節(jié)激素濃度篩選不定根的最佳誘導(dǎo)條件，以探索獲得大量珊瑚菜不定根的組織培養(yǎng)條件，并對(duì)形成的不定根進(jìn)行了擴(kuò)增培養(yǎng)，為提高珊瑚菜藥用活性部位的產(chǎn)量及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染誘導(dǎo)珊瑚菜毛狀根的形成，并建立離體毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，分析測(cè)定了珊瑚菜毛狀根中主要藥用成分香豆素的含量，并與不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量進(jìn)行了對(duì)比，以毛狀根中香豆素的含量最高，珊瑚菜毛狀根具有生長(zhǎng)迅速，周期短，次級(jí)代謝產(chǎn)物相對(duì)產(chǎn)量高等特點(diǎn)，在不含激素的條件下一個(gè)多月便可獲得大量的毛狀根，可用于工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜香豆素；為將來(lái)利用毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了新的途徑，從另一方面保護(hù)該瀕危植物，有利于維護(hù)生態(tài)平衡。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚。


圖1為珊瑚菜葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)程的照片，表明珊瑚菜葉片形成愈傷組織過(guò)程中外部形態(tài)變化，其中圖1-1、1-2、1-3、1-4分別為培養(yǎng)時(shí)間7d、14d、20d和40d的照片。圖2為珊瑚菜愈傷組織誘導(dǎo)不定根的照片，其中2-1表明含IBA3mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上不定根的生長(zhǎng)情況；其中2-2表明含IBA5mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上不定根的生長(zhǎng)情況；其中2-3表明不定根在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)IOd的生長(zhǎng)狀態(tài)；其中2-4表明不定根在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)50d的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖3為珊瑚菜種子的萌發(fā)情況，其中3-1為培養(yǎng)IOd的種子，示胚芽突破種子開(kāi)始萌發(fā)；3-2為培養(yǎng)20d的種子，示兩片子葉逐漸從種子中冒出；3-3為培養(yǎng)25d的種子，示第一片真葉；3_4為培養(yǎng)40d的種子，示珊瑚菜無(wú)菌苗。3-5為誘導(dǎo)培養(yǎng)15d的外植體，白色透明的毛狀根；3_6為高濃度菌液處理下外植體生長(zhǎng)情況，示褐化死亡的外植體。圖4為毛狀根在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)過(guò)程，4-1為培養(yǎng)IOd的毛狀根，4-2為培養(yǎng)20d的毛狀根，4-3為培養(yǎng)35d的毛狀根，4-4為毛狀根PCR檢測(cè)結(jié)果，圖中M為Marker，I為發(fā)根農(nóng)桿菌1.2556T-DNA PCR擴(kuò)增條帶，2為毛狀根DNA PCR擴(kuò)增條帶，3為不定根DNA PCR擴(kuò)增條帶，4為無(wú)菌苗DNA PCR擴(kuò)增條帶。圖5為傘形花內(nèi)酷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光譜掃描圖。圖6為珊瑚菜毛狀根溶液的光譜掃描圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1一、珊瑚菜葉片愈傷組織發(fā)生1、實(shí)驗(yàn)材料植物材料選用無(wú)病蟲(chóng)害的珊瑚菜葉片。MS (Murashige and Skoog)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30g/L，瓊脂含量為8g/L。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2, 4-D0.15mg/L+6_BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L。2、生化試劑和主要儀器MS培養(yǎng)基所用各成分以及酒精、甲醛、冰乙酸、二甲苯等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭＜?xì)胞分裂素6-BA以及生長(zhǎng)素NAA、2，4_D均為上海生物工程公司化學(xué)分析純產(chǎn)品。組織培養(yǎng)常用儀器:無(wú)菌操作臺(tái)、手提式壓力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培養(yǎng)箱坐寸O3、實(shí)驗(yàn)方法3.1外植體的處理方法取珊瑚菜葉片若干，洗凈表面塵土，放入燒杯中，流水沖洗lh，再用無(wú)菌水沖洗2-3次，將經(jīng)過(guò)上述處理的葉片放在無(wú)菌操作臺(tái)上，用濾紙吸干表面的水分，用75%的酒精消毒20s，無(wú)菌水沖洗3-5次，然后放入含有3-4滴吐溫20的10%的次氯酸鈉(有效氯1%)中消毒15min，無(wú)菌水沖洗3-5次，將葉片放在無(wú)菌濾紙上，切割成0.25cm2大小備用。3.2愈傷組織的誘導(dǎo)采用常規(guī)的組織培養(yǎng)方法(潘瑞熾.植物組織培養(yǎng).第三版.廣州:廣東高等教育教出版社，2003，64)培養(yǎng)珊瑚菜葉片，誘導(dǎo)愈傷組織生成。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2, 4-D0.15mg/L+6-BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L，光照周期為 16h:8h(光 / 暗)，其中光照溫度為25±2°C，黑暗溫度為20±2°C。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果離體培養(yǎng)和外源激素是形成愈傷組織的關(guān)鍵條件，珊瑚菜葉片經(jīng)含有2，4-D0.15mg/L+6-BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L的MS培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出淺黃色透明的愈傷組織。葉片經(jīng)培養(yǎng)3d后吸水膨脹，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，7d左右長(zhǎng)出顆粒狀愈傷組織(圖
1-1);隨后愈傷組織逐漸積累(圖1-2) ;20d左右形成愈傷組織團(tuán)(圖1-3) ;40d后形成疏松的愈傷組織團(tuán)(圖1-4)。二、珊瑚菜不定根的誘導(dǎo)1、實(shí)驗(yàn)材料以上述獲得的長(zhǎng)勢(shì)均勻健康的珊瑚菜葉片愈傷組織為實(shí)驗(yàn)材料。1/2MS培養(yǎng)基為大量元素減半，其它元素不變的MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為30g/L，瓊脂含量為6g/L。不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為含不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基。2、生化試劑和主要儀器MS培養(yǎng)基所用各成分等常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。IBA為上海生物工程公司化學(xué)分析純產(chǎn)品。主要儀器:無(wú)菌操作臺(tái)、手提式壓力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培養(yǎng)箱等組織培養(yǎng)常用儀器。3、實(shí)驗(yàn)方法采用常規(guī)組織培養(yǎng)方法，通過(guò)含不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織形成不定根，IBA分為5個(gè)濃度梯度，分別為:l、2、3、4、5mg/L，并以不含IBA的1/2MS培養(yǎng)基作對(duì)照，每個(gè)濃度及對(duì)照分別培養(yǎng)30塊大小均勻的愈傷組織塊，并設(shè)三個(gè)平行。黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2°C。記錄各條件下最早生根時(shí)間，并培養(yǎng)至生根穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)不同條件下愈傷組織塊的生根率及平均根長(zhǎng)，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析。4、結(jié)果與分析將愈傷組織切割轉(zhuǎn)移至對(duì)照及不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)條件下均生成了不定根。IOd左右愈傷組織在含有各濃度IBA的培養(yǎng)基上相繼長(zhǎng)出不定根，濃度較高的培養(yǎng)基生根時(shí)間相對(duì)較早，對(duì)照組生成不定根的時(shí)間最晚。記錄最早生根時(shí)間，45d后生根率穩(wěn)定，不再有新的不定根生成，統(tǒng)計(jì)各濃度下生根率及平均根長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I。表I不同IBA濃度下珊瑚菜不定根的誘導(dǎo)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)獲得珊瑚菜無(wú)菌苗； (2)培養(yǎng)供感染用的發(fā)根農(nóng)桿菌； (3)轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng):取長(zhǎng)勢(shì)較好的珊瑚菜無(wú)菌苗，切取根、葉柄或葉片作為外植體，在其表面劃出傷口用于感染，放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡，然后放入MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，直至外植體周邊出現(xiàn)菌斑； (4)誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生:將出現(xiàn)菌斑的外植體清洗后，放入含有頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期更換1/2MS培養(yǎng)基，在更換的培養(yǎng)基中逐步降低頭孢噻肟鈉的濃度，直到在完全除掉頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得除菌的毛根系； (5)毛狀根的培養(yǎng)增殖:將除菌完全、生長(zhǎng)快速的毛狀根接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)增殖，獲得大量毛狀根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊 瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(I)中選擇飽滿的珊瑚菜種子，滅菌，后接種于MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(2)中所用菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌1.2556。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(2)中發(fā)根農(nóng)桿菌的感染菌液最佳濃度為OD6tltl=0.08。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(3)中所述外植體優(yōu)選為無(wú)菌苗的根，其次為葉柄，再次為葉片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(3)中珊瑚菜無(wú)菌苗放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡15-30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(3)中共培養(yǎng)時(shí)間為2-5d。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于所述步驟(4)中將外植體放入含有頭孢噻肟鈉300mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中，于25°C黑暗培養(yǎng)13_16d。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于所述步驟(4)中在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)每7-10d換一次培養(yǎng)基，最初頭孢噻肟鈉的濃度為300mg/L，逐步降低頭孢噻肟鈉的濃度為每換一次培養(yǎng)基降低50mg/L頭孢噻肟鈉。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:利用分光光度法測(cè)定珊瑚菜毛狀根中香豆素含量的波長(zhǎng)為325nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，它包括獲得珊瑚菜無(wú)菌苗；培養(yǎng)供感染用的發(fā)根農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng)；誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生和毛狀根的培養(yǎng)增殖。本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染誘導(dǎo)珊瑚菜毛狀根的形成，建立離體毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，并分析測(cè)定了其藥用成分香豆素的含量，與不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量進(jìn)行了對(duì)比，以毛狀根中香豆素的含量最高，本發(fā)明中珊瑚菜毛狀根具有生長(zhǎng)迅速，周期短，次級(jí)代謝產(chǎn)物相對(duì)產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，可用于工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜香豆素；為將來(lái)利用毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了新的途徑，從另一方面保護(hù)該瀕危植物，有利于維護(hù)生態(tài)平衡。
文檔編號(hào)C12N5/04GK103146638SQ20131008163
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者辛華, 馬蓓蓓, 劉漢柱 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)