專利名稱：豬瘟活疫苗中病毒含量測定方法及豬瘟病毒兔化弱毒核酸探針試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬瘟活疫苗中病毒含量測定方法及豬瘟病毒兔化弱毒核酸探針試劑盒，屬于獸用生物制品制造領域。
背景技術：
豬痕(classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(classical swine fevervirus, CSFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，HCL在世界養(yǎng)豬國家有不同程度流行，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病(王琴.豬瘟病毒流行病學、病原致病特性及豬瘟綜合防制研究.中國農業(yè)科技導報，2006,8(5):13_18)。HCLV 是黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬(Pestivirus)的一個成員。病毒基因組為單股正鏈RNA，全長12.3kb，包括一個大的0RF，編碼由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，此多聚蛋白又進一步被加工成4個成熟的結構蛋白(C、E0、EU E2)和 7 個非結構蛋白(Npro, NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B) (RumenapfT, Meyers G,Stark R, et al.Molecu lar characterization of hog cholera virus.Arch virol Suppl.1991,3:7-18 ；Van Ri jn P A, Van Gennip H G P, Moormann R JM.An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostictest both based on envelope glycoprotein E2 of classicalswine fever (CSFV).Vaccine, 1999，17:433-440)。1955年我國研制出用經人工誘變獲得的豬瘟病毒兔化弱毒(HCLV)株(又稱C株)制備的豬瘟活疫苗，該疫苗具有高度安全性和優(yōu)良的免疫原性至今仍在世界范圍內被廣泛應用(仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗-半個世紀的回顧.中國農業(yè)科學，2005，38 (8): 1675-1685)，該疫苗對控制豬瘟起到了重要作用，在預防豬瘟方面做出了巨大貢獻。因此，疫苗合格與否十分重要，因此疫苗的質量也變得至關重要。檢測疫苗質量的關鍵指標就是疫苗的效價，因此對疫苗的準確完全定量顯得極為重要。HCLV可以在PK-15、ST等多種細胞上生長，但是均不產生細胞病變(CPE)。因此，迄今為止對豬瘟弱毒疫苗中的病毒含量還沒有一個穩(wěn)定的重復性好定量方法。在過去60多年中，兔體定型熱反應法一直是對其疫苗效價測定的經典方法。但是該方法需要時間太長，并且實驗中有很多不可控制的因素影響結果的可靠性和穩(wěn)定性。特別是兔子對疫苗病毒熱反應的個體差異性會顯著影響檢測結果。。但是至今卻不能為該疫苗完全定量，近年來國內外建立了數種檢測方法，特別是熒光定量RT-PCR技術應用于檢測CSFV的比較多(溫國元，萬超.應用熒光定量PCR技術快速定量檢測豬瘟病毒.武漢大學學報:理學版，2004，50 (6):746-750 ；Hoffmann B,Beer M, Schelp C，et al.Validation of a real-time RT-PCRassay for sensitive and specific detection of classical swine fever.J VirolMethods, 2005, 130(1-2):36-44 ;高博，楊曉農，子掌輝，等.快速檢測豬瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立應用.西南民族大學學報:自然科學版，2009，35(1):92-97 ;朱中武，黃萍，魯杏華，等.實時熒光RT-PCR快速檢測豬源性食品中豬瘟病毒的研究.中國預防獸醫(yī)學報，2009，31(8):627-630)，但這些方法都不是完全定量的方法。目前建立的Taq-Man實時熒光定量RT-PCR方法可以對疫苗中的病毒核酸做定量，并且具有很高的靈敏度。但是該方法不能將疫苗中的有復制能力的活病毒粒子與死亡的病毒粒子區(qū)別開來，不能區(qū)別具有感染力和不具有感染力的病毒，還是沒有實現對疫苗所必須的活病毒的定量。RT-PCR作為一種先進的生物學技術具有很高靈敏度已經被廣泛應用于豬瘟病毒病原(羅廷榮，莫揚，吳文德，等.RT-CR技術診斷豬瘟的應用研究.中國預防獸醫(yī)學報，2003，25(3):219-222)和其他傳染源的鑒定和臨床診斷，但不能用于定量。而且該方法同樣也難以區(qū)分疫苗中具有感染力和不具有感染力的病毒。并且還容易出現非特性產物，電泳后在凝膠成像儀下看到的條帶不一定就是目的條帶，易出現假陽性。同時，在凝膠成像儀下看不到目的條帶也不一定就是陰性結果，因為電泳能看到的條帶最少也是IOng級別，因此也容易出現假陰性，如同本實驗的結果，RT-PCR的產物電泳后雖然除陽性對照外看不到任何條帶.但是如果結合斑點雜交，結果卻是不同，不僅解決了特異性的問題，也提高了靈敏度。本實驗標記的HCLV-E2基因的核酸探針可以檢測到RT-PCR產物的I 2pg的水平。

發(fā)明內容
本發(fā)明建立的定量方法是先將以不同稀釋度的疫苗接種于ST細胞后用RT-PCR結合斑點雜交檢測每個細胞孔的感染狀態(tài)，具有準確，靈敏，特異的特點，是一個完全的定量方法。疫苗接種于細胞后可以除去無感染力細胞的干擾，實驗中所標記的探針的重復性和穩(wěn)定性較好。斑點雜交是一種特異性強、靈敏的檢測技術，操作簡單，結果易于判斷。利用斑點雜交對雞傳染性貧血病毒(劉岳龍，崔治中，段玉友.PCR和斑點雜交檢測雞傳染性貧血病毒.中國獸醫(yī)學報，1996，16 (I): 38-41)、犬瘟熱病毒(王宏俊，丁少忠.核酸探針檢測犬瘟熱病毒方法的建立和初步應用.中國獸藥雜志.2006, 40 (5): 19-22)等多種病毒成功做了相應的地高辛標記探針。地高辛是一種非放射性物質，對人及環(huán)境沒有危害。此外,核酸探針檢測法操作簡便，一次可同時檢測多個樣品，且在檢測時，對儀器的要求不高，特別適宜于基層的掌握和使用，因此，該方法不僅可以用于豬瘟兔化弱毒疫苗的定量，也可以作為一種豬瘟的檢測方法和流行病學調查的手段在基層使用。將疫苗接種于ST細胞，可以排除掉疫苗中不具有感染力的死病毒，具有準確的特點；RT-PCR可以擴增HCLV核酸片段，具有增強敏感度的特點；斑點雜交不僅敏感，而且具有很高的特異性，操作簡單。上世紀90年代本發(fā)明人就用核酸探針檢出I型馬立克氏病毒(崔治中.用非放射性DNA探針從感染雞羽毛囊中檢出I型馬立克氏病病毒.中國獸醫(yī)科技，1992，22(9): 20-21)，因此，本發(fā)明將三者(接種細胞、RT-PCR和斑點雜交)的優(yōu)勢巧妙的結合在一起，組成了一種對HCLV完全的定量方法，該方法的特點就是準確，敏感，特異，完全，應用該方法對某疫苗公司不同批次的疫苗進行了檢測，得到了理想的結果。本發(fā)明的技術方案
1.本發(fā)明所涉及的一種豬瘟活疫苗中病毒含量測定的方法包括:(1)是以HCLV-E2基因片段質粒為模板，用序列I和序列2所述序列的引物HCLV-F1/HCLV-R1進行擴增，采用地高辛標記技術將擴增產物制備成地高辛標記HCLV-E2DNA 探針；(2)以從24孔培養(yǎng)板上的被不同稀釋度豬瘟活疫苗感染的ST細胞提取的RNA為模板用序列3和序列4所述序列的一對引物HCLV-F2/HCLV-R2進行RT-PCR ；(3)通過斑點雜交，根據在硝酸纖維膜點樣后的顯色，狄高辛標記的特異性核酸探針可檢測經豬瘟活疫苗感染的ST細胞中豬瘟兔化弱毒病毒的特異性核酸的RT-PCR產物存在；(4)根據不同稀釋度樣本在硝酸纖維膜點樣后的顯色反應，計算疫苗中以TCID5tl/頭份為單位的豬痕兔化弱毒病毒的含量。
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2.本發(fā)明所述的豬瘟活疫苗中病毒含量測定的方法用于測定的以TCID5tl/頭份為單位的豬瘟兔化弱毒病毒定量結果作為豬瘟活疫苗效力檢驗的質量標準。3.一種實施本發(fā)明豬瘟病毒兔化弱毒株病毒含量測定的豬瘟病毒兔化弱毒特異性核酸探針試劑盒，含有:(I)經狄高辛標記的HCLV-E2DNA探針；(2)未感染的正常ST細胞提取RNA的RT-PCR產物做為陰性對照和豬瘟兔化弱毒病毒感染的ST細胞提取RNA的RT-PCR產物做為陽性對照；(3)用于樣品RNA擴增的一對特異性引物，其序列如序列3、序列4所示；(4)硝酸纖維膜、封閉試劑、NCPI溶液、NBT溶液和20XSSC溶液。4.本發(fā)明所涉及的豬瘟兔化弱毒特異性核酸探針試劑盒可用于豬瘟活疫苗成品檢驗中的效價檢驗；也可用于豬瘟病毒的檢測和流行病學調查。
具體實施例方式1.HCLV-E2DNA探針制備和探針特異性與靈敏度的檢測
(I)PCR法制備地高辛標記HCLV-E2DNA探針以HCLV-E2基因片段質粒(由中國人民解放軍軍事獸醫(yī)研究所涂長春研究員惠贈)為模板，用表I中的HCLV-F1/HCLV-R1引物擴增，出現預期450bp目的條帶(

圖1)。PCR產物經測序無誤后，回收、純化及定量，采用地高辛PCR法標記技術，用羅氏公司的試劑盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit,Cat.N0.11636090910, Version December2005)進行地高辛標記E2基因片段DNA制備探針，探針標記方法按以上試劑盒操作說明書進行，標記的探針在電泳圖譜上明顯滯后于普通dNTP擴增產物條帶(圖2)，說明探針標記成功，同時和DNAMarker條帶比較,所標記探針的量大約為30ng/ μ I。表I標記HCLV探針和HCLV株RT-PCR擴增的引物
權利要求
1.一種豬瘟活疫苗中病毒含量測定的方法，其特征在于: (1)是以HCLV-E2基因片段質粒為模板，用序列I和序列2所述序列的引物HCLV-Fl/HCLV-Rl進行擴增，采用地高辛標記技術將擴增產物制備成地高辛標記HCLV-E2DNA探針； (2)以從24孔培養(yǎng)板上的被不同稀釋度豬瘟活疫苗感染的ST細胞提取的RNA為模板用序列3和序列4所述序列的一對引物HCLV-F2/HCLV-R2進行RT-PCR ； (3)通過斑點雜交，根據在硝酸纖維膜點樣后的顯色，狄高辛標記的特異性核酸探針可檢測經豬瘟活疫苗感染的ST細胞中豬瘟兔化弱毒病毒的特異性核酸的RT-PCR產物存在； (4)根據不同稀釋度樣本在硝酸纖維膜點樣后的顯色反應，計算疫苗中以TCID5tl/頭份為單位的豬痕兔化弱毒病毒的含量。
2.如權利要求1所述一種豬瘟活疫苗中病毒含量測定的方法的應用，其特征在于用該方法測定的以TCID5tl/頭份為單位的豬瘟兔化弱毒病毒定量結果作為豬瘟活疫苗效價檢驗的質量標準。
3.一種實施權利要求1豬瘟病毒兔化弱毒株病毒含量測定的豬瘟病毒兔化弱毒特異性核酸探針試劑盒，其特征在于該試劑盒含有: (1)經狄高辛標記的HCLV-E2DNA探針； (2)未感染的正常ST細胞提取RNA的RT-PCR產物做為陰性對照和豬瘟兔化弱毒病毒感染的ST細胞提取RNA的RT-PCR產物做為陽性對照； (3)用于樣品RNA擴增的一對特異性引物，其序列如序列3、序列4所示； (4)硝酸纖維膜、封閉試劑、NCPI溶液、NBT溶液和20X SSC溶液。
4.如權利要求3所述一 種豬瘟兔化弱毒特異性核酸探針試劑盒的應用，其特征在于該試劑盒可用于豬瘟活疫苗成品檢驗中的效價檢驗。
5.如權利要求3所述一種豬瘟兔化弱毒特異性核酸探針試劑盒的應用，其特征在于該試劑盒可用于豬瘟病毒的檢測和流行病學調查。
全文摘要
本發(fā)明涉及建立一種豬瘟活疫苗中病毒含量測定方法及豬瘟病毒兔化弱毒核酸探針試劑盒。本發(fā)明采用PCR法制備HCLV特異性地高辛標記的DNA探針，同時將HCLV疫苗梯度稀釋后接種于24孔培養(yǎng)板上的ST細胞中，在培養(yǎng)7天后分別從接種各稀釋度的不同孔細胞中提取RNA后，用RT-PCR結合斑點雜交的方法檢測病毒感染。應用該方法能很好的對疫苗病毒實施以TCID50為單位的準確定量，多次重復實驗發(fā)現對同一批次疫苗間定量的重復性好，相互結果相差不大(5.3×104TCID50/頭份、3.0×104TCID50/頭份、3.0×104TCID50/頭份)。本發(fā)明技術方案的實驗結果表明RT-PCR結合斑點雜交定量方法能準確、完全的對疫苗HCLV定量，值得推廣應用。
文檔編號C12Q1/70GK103146844SQ201310082099
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權日2013年3月14日
發(fā)明者崔治中, 馬誠太, 趙鵬 申請人:山東農業(yè)大學