專利名稱：一種噬菌核霉的固體發(fā)酵產(chǎn)孢方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及噬菌核霉分生孢子的固體發(fā)酵產(chǎn)孢方法，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)階段由真菌誘發(fā)的植物疾病已經(jīng)占農(nóng)作物疾病中的大部分，急需一些手段對其進(jìn)行控制?；瘜W(xué)農(nóng)藥雖然對其效果雖然較好，但其對人體以及環(huán)境的危害也是不可忽視的。因此，代替化學(xué)農(nóng)藥的的生物防治菌農(nóng)藥應(yīng)運(yùn)而生，在歐洲，已經(jīng)有大量的工業(yè)化真菌的生物防治產(chǎn)品的得到應(yīng)用，其中有些已經(jīng)得到農(nóng)藥的認(rèn)證了，并且他們的數(shù)量還在繼續(xù)增加。
核盤菌[Scerotiniasclerotionrum (Lib.) de Bary]是世界性的植物病原菌,可引起408種植物的菌核病。由其引發(fā)的油菜菌核病仍然是現(xiàn)中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的難題。目前多采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行控制，而核盤菌核的抗藥性和化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的污染及人類身體健康的侵害是不可忽視的。卩遼菌核霉(Coniothyrium minitans Campbell)是1947年由美國學(xué)者Cambell首先發(fā)現(xiàn)并報道的一種重要的菌核寄生菌。它(Coniothyrium minitans)被認(rèn)為是一種對于核盤菌(Scerotinia sclerotionrum)很有前景的生防菌。在歐州已有兩種噬菌核霉制劑(Κ0ΝΙ和Contans)出售。國內(nèi)尚沒有關(guān)于盾殼霉制劑產(chǎn)品上市?，F(xiàn)階段國內(nèi)仍沒有相關(guān)產(chǎn)品上市，并且現(xiàn)階段很多抗化學(xué)農(nóng)藥的噬菌核霉的突變菌株正在研究過程中，但得到的突變菌株容易出現(xiàn)菌絲生長過于旺盛，有產(chǎn)孢兩不足的問題，并且分生孢子的產(chǎn)量與菌劑的質(zhì)量密切相關(guān)，因此需要研究開發(fā)一種能解決噬菌核霉突變菌株高產(chǎn)孢子的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有狀況，合理整合最優(yōu)資源設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，提供一種噬菌核霉突變株分生孢子的固體發(fā)酵方法，能產(chǎn)生大量的分生孢子，可直接用于開發(fā)高效噬菌核霉農(nóng)藥，有效防治菌核病。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明利用無錫楗農(nóng)生物科技有限公司、無錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司篩選、誘變并保存的曬菌核霉(Coniothyrium minitans)K1菌株作為實(shí)驗(yàn)對象。單胞分離后轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面內(nèi)培養(yǎng)后作母菌種，進(jìn)而經(jīng)修飾過的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得二級菌種，再經(jīng)優(yōu)化的固體發(fā)酵方法使其產(chǎn)生分生孢子。發(fā)酵所用的固體發(fā)酵基質(zhì)為麩皮，通過優(yōu)化發(fā)酵條件及營養(yǎng)液組成、配比后得到最優(yōu)產(chǎn)孢條件，發(fā)酵所獲得的孢子-基質(zhì)混合物經(jīng)干燥后可直接用于生產(chǎn)。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟:
1、噬菌核霉K1孢子懸浮液的制備:將K1菌株置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，與20°C條件下培養(yǎng)6 8天，用無菌水沖洗斜面孢子，利用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整分生孢子懸浮液濃度至106/ml，放入4°C冰箱內(nèi)備用。
2、二級種子液的制備:取經(jīng)修飾過的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(在培養(yǎng)基中加入0.7%。瓊脂)，以I 1.5%的接種量想發(fā)酵種子液培養(yǎng)基接種孢子懸浮，于搖床中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:20°C，150r/min，培養(yǎng)6 8天，獲得二級菌種。
3、獲得產(chǎn)量高得固體發(fā)酵條件:以麩皮為基質(zhì)，對固體發(fā)酵產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化。
首先，確定最佳產(chǎn)孢天數(shù)為8 11天，添加微量元素營養(yǎng)液含量為70% 80%，經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定對孢子產(chǎn)量有影響的因子。之后,進(jìn)行正交試驗(yàn)(如不同碳源、有機(jī)無機(jī)氮源)選出產(chǎn)孢最優(yōu)組合。最后,進(jìn)行Response Surface試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定添加最有影響因子的最佳含量。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論與實(shí)際的相符性，即得到最優(yōu)產(chǎn)孢條件。
其中:
步驟3所添加的微量元素營養(yǎng)液為K2HPO4' EDTA、CaCl2.2H20、MgCl2.6H20、ZnSO4.7H20、FeSO4.7H20、Na2MoO4.2H20、CoCl2.2H20
步驟3中Plackett-Burman試驗(yàn)就是篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì),主要針對因子數(shù)較多,且未確定眾因子相對于響應(yīng)變量的顯著性是，采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。
步驟3中Response Surface是指響應(yīng)變量Π與一組輸入變量(ζ I, ζ 2,ζ 3...ζ k)之間的函數(shù)關(guān)系式:η = f ( ζ 1，ζ 2，ζ 3...ζ k)。利用統(tǒng)計(jì)模型對產(chǎn)孢結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。
本發(fā)明方法可產(chǎn)生大量的噬菌核霉分生孢子。最大分生孢子量可達(dá)到I 5X 101°個/克干基質(zhì)，可經(jīng)處理后制成噴霧劑灑在大田中，預(yù)防菌核病的發(fā)生。
本發(fā)明適用于噬菌核霉經(jīng)化學(xué)農(nóng)藥突變株的大量生產(chǎn)，利用的麩皮等物質(zhì)工業(yè)中價格便宜，實(shí)驗(yàn)室階段環(huán)境需求條件低，為其中試條件的優(yōu)化提供了有效的依據(jù)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
1、噬菌核霉K1孢子懸浮液的制備:將K1菌株置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，與20°C條件下培養(yǎng)6 8天，用無菌水沖洗斜面孢子，利用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整分生孢子懸浮液濃度至106/ml，放入4°C冰箱內(nèi)備用。
2、二級種子液的制備:取經(jīng)修飾過的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(在培養(yǎng)基中加入0.7%。瓊脂)，以I 1.5%的接種量想發(fā)酵種子液培養(yǎng)基接種孢子懸浮，于搖床中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:20°C，150r/mm，培養(yǎng)6 8天，獲得二級菌種。
3、獲得產(chǎn)量高得固體發(fā)酵條件:以麩皮為基質(zhì)，對固體發(fā)酵產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化。
首先，確定最 佳產(chǎn)孢天數(shù)為8 11天，添加微量元素營養(yǎng)液含量為70% 80%，經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定對孢子產(chǎn)量有影響的因子。之后,進(jìn)行正交試驗(yàn)(如不同碳源、有機(jī)無機(jī)氮源)選出產(chǎn)孢最優(yōu)組合。最后,進(jìn)行Response Surface試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定添加最有影響因子的最佳含量。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論與實(shí)際的相符性，得到最優(yōu)產(chǎn)孢量不少于I XlOici個/克干物質(zhì)。
實(shí)施例2:
噬菌核霉致腐活性測定
噬菌核霉是菌核菌的重寄生菌，通過寄生于菌核菌，致使菌核液化、腐爛，并最終降解。試驗(yàn)采用江沙中混入不同量的噬菌核霉，以觀察噬菌核霉對菌核菌的致腐能力，利用半數(shù)有效劑量EC5tl進(jìn)行致腐活性測定。
1、菌核的培養(yǎng)
菌核菌預(yù)培養(yǎng):取一支凍存于_80°C冰箱中的的菌核菌JPG-2凍存管，在保持不開蓋的情況下于室溫解凍。在無菌條件下，用滅菌后的移液器，吸取50 200 μ I解凍后的菌液，加入到9cm PSA平板的中央，用涂布棒涂補(bǔ)均勻。于23 28°C條件下培養(yǎng)2 6天。
用接種鏟取預(yù)培養(yǎng)后的JPG-2菌，接種到PSA平板的中央，于23 28 °C、黑暗條件下培養(yǎng)10 16天，從平皿上取黑色的菌核作為試驗(yàn)對象。
2、試驗(yàn)處理和方法
(1)基質(zhì)的準(zhǔn)備
江沙經(jīng)過0.59mm(30目)過篩后，在165°C下干熱滅菌3h ;作為備用基質(zhì)。
(2)藥劑配制
稱取8份IOOg的滅菌江沙分別置于8個200毫升的燒杯中，按照0，0.625，0.125，0.25，0.5，1.0,2.0和4.0g/Kg江沙的劑量稱取噬菌核霉并分別加入盛有江沙的燒杯中，充分混勻。
3、試驗(yàn)方法
稱取上述已經(jīng)充分混勻后的噬菌核霉+江沙的樣品20g，分別裝入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，同時在每個平皿中加入2 6mL滅菌水，混勻后在每皿埋入15 30個菌核，每個劑量安排4個重復(fù)，以O(shè)g/Kg的劑量作為空白對照。
把經(jīng)上述處理的培養(yǎng)皿放入塑料袋中(以防水分散失)，然后置于20°C的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，10 35天后取出培養(yǎng)皿。用刀從菌核中間切開，如果發(fā)現(xiàn)被切開的菌核組織變軟并且中間變黑，則該菌核就作為是腐爛菌核。
4、測定結(jié)果
采用半數(shù)致腐值(EC5tl)來表示噬菌核霉的致腐效果，EC50的計(jì)算方法如下:
(1)統(tǒng)計(jì)各處理劑量4個重復(fù)的腐爛菌核數(shù)的平均值，分別計(jì)算各處理劑量和對照劑量的平均腐爛率,F1 (% )和Ftl(X) =F1 (or F0)=(腐爛菌核數(shù)平均值+20) XlOO% ;F — F
(2)按如下計(jì)算各處理劑量的校正腐爛率F(% ) ^ = -^^00
(3)在《百分率 概率單位表》上查找與各校正腐爛百分率F相對應(yīng)的概率單位值G；
(4)繪制1gC (y軸) G (X軸)曲線圖，得到噬菌核霉對菌核菌菌核致腐活性的回歸方程:y = ax+b其中:G為概率單位值，C為噬菌核霉劑量值(g/Kg)；
(5)在上述曲線圖上，讀取概率單位為5時相對應(yīng)的1gC值，1gC的反對數(shù)值C即為所求EC5tl (g/Kg).其中PSA培養(yǎng)基平板
配方(IL):馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂粉20g。
配置方法:馬鈴薯去皮，切成小塊，放入800mL去離子中，煮沸30min。用紗布過濾去除濾洛后，加入鹿糖，加水定容至1000mL。按每瓶200mL分裝于500mL三角瓶中，每瓶加入4g瓊脂粉。121°C高壓滅菌20min后涼至45°C左右，倒入9cm培養(yǎng)皿制成約4mm厚的平板，備用。
實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果為< 10g/kg，噬菌核霉活性測定結(jié)果表明本發(fā)明所制備的噬菌核霉Kl的分生孢子具有良好的生防價值，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種新的噬菌核霉的固體發(fā)酵產(chǎn)孢方法，其特征包括如下步驟: (1)噬菌核霉K1孢子懸浮液的制備:將噬菌核!^菌株置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，與20°C條件下培養(yǎng)6 8天，用無菌水沖洗斜面孢子，利用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整分生孢子懸浮液濃度至106/ml，放入4°C冰箱內(nèi)備用。
(2)二級種子液的制備:取經(jīng)修飾過的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(在培養(yǎng)基中加入0.7%。瓊脂)，以I 1.5%的接種量想發(fā)酵種子液培養(yǎng)基接種孢子懸浮，于搖床中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:20°C，150r/min，培養(yǎng)6 8天，獲得二級菌種。
(3)獲得產(chǎn)量高得固體發(fā)酵條件:以麩皮為基質(zhì)，對固體發(fā)酵產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化。
首先，確定最佳產(chǎn)孢天數(shù)為8 11天，添加微量元素營養(yǎng)液含量為70% 80%，經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定對孢子產(chǎn)量有影響的因子。之后,進(jìn)行正交試驗(yàn)(如不同碳源、有機(jī)無機(jī)氮源)選出產(chǎn)孢最優(yōu)組合。最后,進(jìn)行Response Surface試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定添加最有影響因子的最佳含量。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論與實(shí)際的相符性，即得到最優(yōu)產(chǎn)孢條件。
其中: 步驟(3)所添加的微量元素營養(yǎng)液為 K2HP04、EDTA、CaCl2.2H20、MgCl2.6H20、ZnS04.7H20、FeSO4.7H20、Na2MoO4.2H20、CoCl2.2H20 步驟(3)中Plackett-Burman試驗(yàn)就是篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì),主要針對因子數(shù)較多,且未確定眾因子相對于響應(yīng)變量的顯著性是，采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。
步驟(3)中Response Surface是指響應(yīng)變量η與一組輸入變量(ζ ，ζ 2,ζ 3...ζ k)之間的函數(shù)關(guān)系式:η = f ( ζ 1，ζ 2，ζ 3...ζ k)。利用統(tǒng)計(jì)模型對產(chǎn)孢結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的噬菌`核霉K1在生物防治菌核病微生物制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體主要涉及優(yōu)化對菌核病具有強(qiáng)寄生、致腐能力的噬菌核霉的固體發(fā)酵產(chǎn)孢的研究。這里描述的噬菌核霉菌株，由我們篩選、誘變并保存。單胞分離后轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面內(nèi)培養(yǎng)后作母菌種，進(jìn)而經(jīng)修飾過的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得二級菌種，再經(jīng)優(yōu)化的固體發(fā)酵方法使其產(chǎn)生分生孢子。發(fā)酵所用的固體發(fā)酵基質(zhì)為麩皮，通過優(yōu)化發(fā)酵條件及營養(yǎng)液組成、配比后得到最優(yōu)產(chǎn)孢條件，發(fā)酵所獲得的孢子-基質(zhì)混合物經(jīng)干燥后可直接用于田間菌核病的防治。本發(fā)明方法可在短時間周期內(nèi)產(chǎn)生大量的分生孢子，可用于預(yù)防植物的菌核病。
文檔編號C12N3/00GK103146635SQ20131008230
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者雷楗勇, 馮骉, 朱瑞宇, 李紅, 金堅(jiān), 陸核, 陳金娣, 沈志松, 付強(qiáng), 張六六, 夏森玉, 徐夢龍, 丁鵬鵬 申請人:無錫楗農(nóng)生物科技有限公司, 無錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司