趨化因子受體cxcr3基因中與豬抗藍耳病相關(guān)的snp標記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記及其應(yīng)用，所述與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記位于豬的趨化因子受體CXCR3基因上，所述SNP標記的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其中，該序列的171bp和279bp兩處堿基為T的待測豬為易感藍耳病豬品種，而該兩處堿基為C的待測豬為抗藍耳病豬品種。本發(fā)明提供的分子遺傳標記不受豬的年齡、性別等限制，可用于抗藍耳病豬品種的早期選育，甚至在豬剛出生時就可準確地進行篩選，可大大加快抗藍耳病豬的育種進程；篩選方法準確，操作簡單，成本低，效率高。
【專利說明】趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記 及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及趨化因子受體CXCR3基 因中與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)，俗稱"藍耳病"是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)引起的，該病毒是巢狀病毒目動脈炎病毒科的一個成員，同屬的病毒還有馬動脈炎 病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現(xiàn)為間 質(zhì)性肺炎和母豬流產(chǎn)木乃伊胎等，每年對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2007年 在中國爆發(fā)了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴散，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死 亡，該病最后證實是由一種高致病性的藍耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細 胞，現(xiàn)在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應(yīng) 答，體液免疫不能及時產(chǎn)生有效的中和抗體，而且會形成抗體依賴的病毒增強效應(yīng)，最終導(dǎo) 致免疫抑制和持續(xù)感染，由于該病毒的突變率極高，傳統(tǒng)疫苗方法也不能有效控制該病，很 多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補傳統(tǒng)方法的不足。
[0003] 由于不同的豬品種和個體的遺傳背景差異，對藍耳病的抗性也不同，研究表明在 臨床癥狀和生理生化指標上，通城豬、梅山豬等國內(nèi)豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感 染高致病性PRRSV后有較強的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和 通城豬的組織做差異基因表達分析，某些免疫相關(guān)的基因表達量在感染前后兩個品種間有 顯著的差異。另外，存在一些品種間的SNP位點，這些基因在宿主的免疫應(yīng)答中起到了很重 要的作用，而且這些SNP位于基因的外顯子中，通過找出不同品種間PRRSV感染造成的基因 表達差異，不僅可以研究PRRSV的感染機制，還可以找出抗性或易感相關(guān)的基因，通過對品 種間的SNP進行比較分析，從而篩選出抗性較強的豬。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記及 其應(yīng)用。
[0005] CXCR3是一種趨化因子受體，可結(jié)合CXCL9、CXCL10、CXCL11，可以調(diào)節(jié)白血球細胞 的轉(zhuǎn)運。當(dāng)這些趨化因子和CXCR3結(jié)合后可以促進引起一系列細胞應(yīng)答，如細胞骨架的改 變，趨化運動等，還可以吸引Thl細胞，促進Thl細胞的成熟，在傷口的愈合中也起到一定的 作用，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)在兩個不同抗性的豬品種：長白豬(易感豬)、通城豬(抗病豬）之間 的趨化因子受體CXCR3基因外顯子中存在兩個品種間SNP位點，用常規(guī)分子生物學(xué)方法檢 測這兩個位點的堿基類型，可以作為一種檢測抗病和易感豬的方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記，其位于豬 的趨化因子受體CXCR3基因上，所述SNP標記的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中，該 序列的171bp和279bp兩處喊基為T的待測豬為易感監(jiān)耳病豬品種，而該兩處喊基分別為 G和C的待測豬為抗藍耳病豬品種。
[0007] 本發(fā)明還提供用于檢測與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記的引物對，其包括上游引物 F :5' -CGCTCCCAGACTTCATCTTC-3' 和下游引物 R :5' -GAGGCAGTCACCTCTGAAGC-3'。
[0008] 本發(fā)明還提供與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記在鑒定抗藍耳病豬品種中的應(yīng)用，其 包括步驟：1)提取待測豬樣品組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;2)以步驟1)中的cDNA為模 板，F(xiàn)和R為引物，進行RT-PCR反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物，如果擴增產(chǎn)物序列中171bp和279bp 兩處的堿基為C，則待測豬為抗藍耳病豬品種。
[0009] 反轉(zhuǎn)錄PCR的步驟為：
[0010] i )打開RNA二級結(jié)構(gòu)
[0011] 在一支無核酸酶污染的小離心管中加入：
[0012] RNA 2μ g
[0013] oligodT lug
[0014] 無核酸酶水補齊至 15 μ 1
[0015] 加熱離心管至70°C，5分鐘。
[0016] ii)反轉(zhuǎn)錄 PCR
[0017] 向上述離心管中加入：
[0018] M-MLV 5 X反應(yīng)緩沖液 5μ1 10mM dATP 1.25μ! 10mM dCTP ?.25μ1 lOmM dGTP 1,25μ1 lOmM dTTP 1.25μ? RNasin?核酸酶抑制劑 25U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 200U〇
[0019] 反轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)條件為：42°C，60min。
[0020] 常規(guī)PCR使用的擴增體系以15 μ 1計為：
[0021] ΙΟμΜ上游引物F 0 5μΙ ΙΟμΜ下游引物R 0.5μ1 lOmM dNT'P l.0 μ! lOxPCR反應(yīng)緩沖液 1.5μ1 TaqDNA聚合酶 0.2 μ? cDNA 模板 Ι.ΟμΙ 加 ddH20補足至 Ι5μΙ。
[0022] 常規(guī) PCR 的反應(yīng)條件為：：95°C 5min ;以 95°C 30s，50°C -70°C，30s-2min ; 72°C 30s-2min 做 35 個循環(huán)；72°C lOmin，于 4°C保溫。
[0023] 本發(fā)明還提供含有引物F和R的用于檢測抗藍耳病豬品種的試劑盒。所述試劑盒 還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。優(yōu)選地，所述試劑盒 還包括標準陽性模板。
[0024] 本發(fā)明進一步提供與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記在豬的分子標記輔助育種中的 應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明提供了一種基于趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記 篩選抗藍耳病豬的方法，該方法的優(yōu)點在于：（一）本發(fā)明提供的分子遺傳標記不受豬的年 齡、性別等限制，可用于抗藍耳病豬品種的早期選育，甚至在豬剛出生時就可準確地進行篩 選，可大大加快抗藍耳病豬的育種進程；（二）篩選方法準確，操作簡單，成本低，效率高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例1中進行常規(guī)PCR所使用的擴增程序。

【具體實施方式】
[0027] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0028] 實施例1趨化因子受體CXCR3基因中與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記篩選抗藍耳病 豬的方法
[0029] 前期實驗通過對6個品種豬(長白豬、大白豬、杜洛克豬、清平豬、梅山豬、通城豬） 感染高致病性藍耳病毒（PRRSV)進行抗病豬的篩選，通過臨床癥狀記錄：采食量、體溫、生 理生化、細胞因子以及存活時間等的檢測，最后得到了對藍耳病抗性差異較大的兩個品種 ： 長白豬(易感豬)、通城豬(抗病豬)。為了研究高致病性藍耳病的感染機制和篩選抗性基因， 后期實驗選取了 35日齡抗病豬和易感豬各16頭進行攻毒試驗，對感染PRRSV后不同時間 點的豬肺轉(zhuǎn)錄組進行了高通量solexa測序，通過分子生物信息學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)在免疫相關(guān) 的趨化因子受體CXCR3基因（GenBank登錄號為XM_003135179)外顯子中存在兩個品種間 的SNP位點，在抗性豬品種中這兩個位點的單核苷酸分別是鳥嘌呤（G)和胞嘧啶（C)，而在 易感豬中，這兩個位點的單核苷酸均為胸腺嘌呤（T)，通過在這兩個SNP位點附近設(shè)計引物 擴增目的片段，測序檢測SNP堿基類型，可得到同樣的結(jié)果，擴增片段的引物序列如下：上 游引物 F :5'-CGCTCCCAGACTTCATCTTC-3'和下游引物 R :5' -GAGGCAGTCACCTCTGAAGC-3'。用 該對引物檢測待測豬這兩個SNP位點的堿基類型，即可用來篩選抗病豬。
[0030] 一、總RNA的提取
[0031] 1.動物組織：取新鮮或_70°C凍存動物組織，每30-50mg組織加入1ml Trizol，勻 漿儀進行勻漿處理。樣品體積一般不要超過Trizol體積的10%。
[0032] 2.將以上樣品在15_30°C放置5分鐘，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
[0033] 3.可選步驟：4°C 12, OOOrpm(約13, 400g)離心10分鐘，取上清。
[0034] 注意：如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等，可離心去 除。
[0035] 4.向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml Trizol加入0. 2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振 蕩15秒，室溫放置3分鐘。
[0036] 5. 4°C 12, OOOrpm(約13, 400g)離心10-15分鐘，此時樣品分成三層：黃色的有 機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相(約500μ 1)轉(zhuǎn)移到一個新的 RNase-Free離心管中。
[0037] 6.在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20-30分鐘。
[0038] 7. 4°C 12, 000 rpm(約 13, 400g)離心 10 分鐘，棄上清。
[0039] 8.加入75%乙醇(用RNase-free水配制）洗漆沉淀。每使用lml Trizol用lml 75%乙醇對沉淀進行洗滌。
[0040] 9. 4°C 5, 000 rpm(約2, 300g)離心3分鐘。用槍頭小心吸出上層液體，保留沉淀。
[0041] 注意：不要吸出沉淀，剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸 棄沉淀。
[0042] 10.室溫放置2-3分鐘，晾干，加入30-100 μ 1 RNase-free水，充分溶解RNA。所 得到RNA置-70°C保存。
[0043] 二、反轉(zhuǎn)錄 PCR
[0044] 1.打開RNA二級結(jié)構(gòu)
[0045] 在一支無核酸酶污染的小離心管中加入：
[0046] RNA 2 μ g
[0047] oligodT lug
[0048] 無核酸酶水補齊至 15 μ 1。
[0049] 加熱離心管到70°C，5分鐘。
[0050] 2.反轉(zhuǎn)錄 PCR
[0051] 向上述離心管中加入：
[0052] M-MLV ( Promega ) 5 X 反應(yīng)緩沖液 5μ1 lOmM clATP 1.25μ1 ΙΟηιΜ ciCTP 1.25μΙ lOmM dGTP 1.25μ] lOmMdTTP 1.25μ1 RNasin?核酸酶抑制劑 25U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 200U。
[0053] 在42 °C孵育60分鐘進行反應(yīng)。
[0054] 三、常規(guī)PCR反應(yīng)
[0055] 1.按下列反應(yīng)體系（15 μ L體系）加樣
[0056] ΙΟμΜ上游引物F 0.5μ1 ΙΟμΜ下游引物R 0.5μ1 lOmM dNTP 1.0 μ? lOxPCR反應(yīng)緩沖液 1.5μ1 TaqDNA聚合酶 0.2 μ? cDNA 模板 Ι.ΟμΙ 加ddH20補·足至 15μ1。
[0057] 2.按如圖1所述的反應(yīng)條件進行PCR擴增
[0058] 四、克隆和測序
[0059] 1.將PCR產(chǎn)物用Ε· Ζ· N. A Gel Extraction Kit膠回收試劑盒回收
[0060] 2.將回收的產(chǎn)物連接pMD-19T載體（Takara)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得陽性克隆，搖 菌，測序(上海生工)。酶切、連接、轉(zhuǎn)化操作詳細步驟見《分子克隆》第三版。
[0061] 五、結(jié)果分析
[0062] 測序結(jié)果如SEQ ID NO. 1所示，其中，該序列的171bp和279bp兩處堿基為T的待 測豬為易感藍耳病豬品種，而該兩處堿基分別為G和C的待測豬為抗藍耳病豬品種。
[0063] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
[0001] 序列表 <11〇> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) <120〉趨化Μ子受體CXCR3基Η中與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記及其應(yīng)用 <130> ΚΗΡ13113337,2 <160> 3 <170> Patentln version 3. 5 <210〉 1 <21D 756 <212> DNA <213〉豬 <220> <221> misc-feature <222> (171).. (171) <223〉n=g 或 t <220> <221> misc-feature <222> (279)\ . (279) <223〉n-c 或 t <400> 1 cgctcccaga cttcatcttc ctatcggccc accctgatga gcgcctcaac gccacccact 60 gccagtacag cttcccccag gtgggccgca cagccctgcg tgtcctgcag ctggtcgcag 120 gtttcctgct gcccctgctg gtcatggcc-t attgctacgc ccgcatcctg nctgtgctgc 180 tggtctccag aggccagagg cggctcagag ccatgcggct ggtggtggtg gtcgtcgtgg 240 cctttgccct ctgctggacc ccctaccacc tggtggtgnt ggtggacacc ctcatgtact 300 tgggggectt ggcccgcaac tgtagccaag aaagtagggt ggacgtagcc aagteggtca 360 catcgggcct gggctacatg cactgctgcc tcaacccact gctctacgcc ttcgtgggtg 420 tcaagttccg agagcggatg tggatgctgc tcatgcgcet gggctgccac caacggcagc 480 cgccagtttc ccgccgggat tcctcctggt cggagaccac agagggttcc tactcaggct 540 tgtgaggctg gggtggggga at.ccaccttc accacgcagc ctgacccccc cccccccacc 600 ttccaggctc ctccctccca agccccggag acacacactc ctgggagtct ccaggggccc 660 caggaccaca ggtctcccat ggagcctccc tctaggctct gggggc-tgag ccatcgctgc- 720 tccttagctg cccgccgctt cagaggtgac tgcctc 756 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213〉人丁序列 <400> 2 c gc tcccaga c 11 cat c 11 c 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400 3 gaggcagtca cctctgaagc 20
【權(quán)利要求】
1. 一種與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記，其特征在于，其位于豬的趨化因子受體CXCR3基 因上，所述SNP標記的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，其中，該序列的171bp和279bp兩處 堿基為T的待測豬為易感藍耳病豬品種，而兩處堿基分別為G和C的待測豬為抗藍耳病豬 品種。
2. 用于檢測權(quán)利要求1所述與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記的引物對，其特征在于，包括 上游引物 F :5' -CGCTCCCAGACTTCATCTTC-3' 和下游引物 R :5' -GAGGCAGTCACCTCTGAAGC-3'。
3. 權(quán)利要求1所述與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記在鑒定抗藍耳病豬品種中的應(yīng)用，其 包括步驟： 1) 提取待測豬樣品組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ; 2) 以步驟1)中的cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，進行RT-PCR反應(yīng)； 3) 分析PCR產(chǎn)物，如果擴增產(chǎn)物序列中171bp和279bp兩處的堿基分別為G和C，則待 測豬為抗藍耳病豬品種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中反轉(zhuǎn)錄PCR包括的步驟為： i) 打開RNA二級結(jié)構(gòu) 在一支無核酸酶污染的離心管中加入： RNA 2 μ g oligodT lug 無核酸酶水補齊至 15μ 1 ; 加熱離心管至70°C，5分鐘； ii) 反轉(zhuǎn)錄PCR 向上述離心管中加入： M-MLV 5 X反應(yīng)緩沖液 5μ1 10mM dATP 1.25li1 !0mM dCTP 1.25μ1 lOmM dGTP 1.25μ1 !0mM dTTP 1.25μΙ RNasin?核酸酶抑制劑 25U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 200U; 反轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)條件為：42°C，60min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中常規(guī)PCR使用的擴增體系以 15 μ 1計為： ΙΟμΜ上游引物F 0.5μ1 ΙΟμΜ下游引物R 0.5μ1 lOmMdNTP 1.0 μ? lOxPCR反應(yīng)緩沖液 1.5μ1 TaqDNA聚合酶 0.2 μ? cDNA 模板 1 ,Ομ! 加ddH20補足至 15μ1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中常規(guī)PCR的反應(yīng)條件為：： 95°C 5min ;以 95°C 30s，5(TC -7(TC，30s-2min ;72°C 30s-2min 做 35 個循環(huán)；72°C lOmin，于 4 C保溫。
7. 含有權(quán)利要求2所述引物對的用于檢測抗藍耳病豬品種的試劑盒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
10. 權(quán)利要求1所述與豬抗藍耳病相關(guān)的SNP標記在豬的分子標記輔助育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104046623SQ201310082332
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月14日
【發(fā)明者】李寧, 陳志勝, 任立明, 胡曉湘 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)