一種低免疫原性的人細胞及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明中提供了一種低免疫原性的人細胞及其制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種修飾的人細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，其細胞表面人類白細胞抗原HLA蛋白或多肽缺失或表達下調(diào)，從而使得所述修飾的人細胞具有降低的免疫原性。本發(fā)明還涉及制備上述修飾的人細胞的方法，包括使人細胞中HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因(例如β2-微球蛋白基因)缺失或表達下降。本發(fā)明的修飾的人細胞(系)具有低免疫原性，有望成為一種新型的、能夠降低甚至避免免疫排斥反應(yīng)的移植供體，這將為器官移植提供一種嶄新的材料和方法。
【專利說明】一種低免疫原性的人細胞及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種具有低免疫原性的人細胞及其制 備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞（stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細 胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細 胞（embryonic stem cell, ES細胞）和成體干細胞（somatic stem cell)。根據(jù)干細胞的 發(fā)育潛能分為三類：全能干細胞（totipotent stem cell, TSC)、多能干細胞（pluripotent stem cell)和單能干細胞（unipotent stem cell)。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟 的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為"萬用細胞"。
[0003] 人類胚胎干細胞（human embryonic stem cell, hESC)是當受精卵分裂發(fā)育成囊 胚時，內(nèi)細胞團（inner cell mass)的細胞在體外培養(yǎng)而成、能夠無限增殖、自我更新且具 有發(fā)育全能性的一種細胞。
[0004] 人類胚胎干細胞的研究意義十分重大，并且具有廣闊的應(yīng)用前景。首先，它帶來了 人類細胞移植治療的一次重大革命。由于人類胚胎干細胞能分化出成體的所有組織和器官 (包括生殖細胞），因而有望成為實施器官再生醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代生物細胞療法的重要細胞來源， 也將為目前大量疑難病癥，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、器官移植和損傷再生等的發(fā)病機理和 治療學(xué)提供研究途徑。例如，用分化得到的神經(jīng)細胞治療神經(jīng)性疾?。ㄅ两鹕C合癥、亨 廷頓舞蹈癥、阿茲海默癥等）；用分化得到的造血干細胞重建造血功能；用分化得到的胰島 細胞治療糖尿??；用分化得到的心肌細胞修復(fù)已壞死的心??；用分化得到的肝細胞治療肝 病7等等 。
[0005] 近年來，我國也非常重視并鼓勵干細胞研究，尤其是人胚胎干細胞研究。例如， 2006年，國務(wù)院公布的《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》中就已經(jīng) 指出：我國要"重點研究治療性克隆技術(shù)，干細胞體外建系和定向誘導(dǎo)技術(shù)，人體結(jié)構(gòu)組織 體外構(gòu)建與規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)，人體多細胞復(fù)雜結(jié)構(gòu)組織構(gòu)建與缺損修復(fù)技術(shù)和生物制造技 術(shù)"，并進一步指出我國要"重點研究干細胞增殖、分化和調(diào)控，生殖細胞發(fā)生、成熟與受精， 胚胎發(fā)育的調(diào)控機制，體細胞去分化和動物克隆機理，人體生殖功能的衰退與退行性病變 的機制，輔助生殖與干細胞技術(shù)的安全和倫理等"。
[0006] 然而，由于細胞或者器官異體移植的供受體之間，極易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，因此使 得干細胞的臨床應(yīng)用受限。為了解決免疫排斥的問題，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)水平建立非常龐大 的干細胞庫，但是建立這些干細胞庫的難度相當大，代價也相當高；并且，即使可以建立龐 大的干細胞庫，也不一定能滿足所有患者的配型。
[0007] 20世紀時，有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在不同種屬或同種不同系別的個體間進行組織移植時， 會出現(xiàn)排斥反應(yīng)，其本質(zhì)是細胞表面的同種異型抗原誘導(dǎo)的一種免疫應(yīng)答。這種代表個體 特異性的同種異型抗原被稱為"移植抗原"或"組織相容性抗原"，其中能引起強而迅速排斥 反應(yīng)的抗原被稱為"主要組織相容性抗原"，在人體中稱為人白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA) 〇
[0008] 主要組織相容性抗原是一個復(fù)雜的抗原系統(tǒng)，編碼這一系統(tǒng)的基因位于同 一染色體片段上，是一組緊密連鎖的基因群，稱為"主要組織相容性復(fù)合體"（major histocompatibility complex, MHC)。同種異體組織移植時，若供受體移植抗原不同，尤其 是MHC不匹配，將會誘發(fā)受體產(chǎn)生明顯的移植排斥反應(yīng)。MHC分為I類和II類分子，其中 MHC I類分子分布于所有有核細胞，MHC II類分子主要表達于B細胞、單核-巨噬細胞和樹 突狀細胞等。在人體中，MHC I類基因編碼的主要組織相容性抗原指的是HLA I類分子。若 供受體的I類分子不同，會誘發(fā)CD8+的T細胞增殖和分化成熟，導(dǎo)致移植物的破壞，I類抗 原的錯配是導(dǎo)致免疫效應(yīng)階段供體移植物成為被攻擊的靶標的主要原因。在人類器官移植 中，I類抗原主要影響供體移植物的長期存活效率。
[0009] 由于II類分子主要只表達于部分免疫細胞，而I類分子則分布于所有有核細胞， 因此，如果能夠得到HLA I類分子敲除或沉默的人多能干細胞，將其分化為非免疫細胞的細 胞類型（如胰腺或肝臟細胞等），作為移植的供體來源，將極大降低異體移植的免疫排斥反 應(yīng)。這將為供體移植物的來源提供一種嶄新的途徑，并且能夠在很大程度上改善移植物的 長期存活率。
[0010] HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中可涉及很多種基因，例如β 2-微球蛋白 (β 2-microglobulin，Β2Μ)基因和 TAPI、ΤΑΡ2、TAPBP、NLRC5 等基因。Β2Μ 是 HLA I 類分 子的一個組成部分，其與I類分子在細胞表面的表達以及分子的穩(wěn)定性相關(guān)。因此，敲除 β2-微球蛋白可能會導(dǎo)致HLA I類分子在免疫系統(tǒng)中功能的喪失。TAP1在裝配HLA I類 分子過程中發(fā)揮重要作用。當ΤΑΡ1缺失時，HLA I類分子不能正確裝配進而影響HLA I類 分子在細胞表面的表達。因此，敲除ΤΑΡ1可能會導(dǎo)致HLA I類分子在免疫系統(tǒng)中功能的喪 失。
[0011] 然而，由于不同生物種類的多樣性和機體的復(fù)雜性等因素，至今仍沒有在人細胞 中對這些HLA相關(guān)基因（如β 2-微球蛋白基因或ΤΑΡ1)進行成功打靶和后續(xù)研究的報道。
[0012] 綜上所述，人干細胞具有分化的多潛能性，是實施器官再生醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代生物細胞 療法、藥物篩選等的重要細胞來源。但由于細胞或者器官異體移植的供受體之間極易發(fā)生 免疫排斥反應(yīng)，由此使得人成體細胞或人干細胞的臨床應(yīng)用受限。因此，本領(lǐng)域中迫切需要 開發(fā)出一種具有低免疫原性的人細胞或人干細胞系，該細胞系可作為新型的、能夠降低或 者避免免疫排斥反應(yīng)的移植供體，從而為移植治療提供一種嶄新的材料和方法，且可用于 候選藥物的評估和篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明通過對人細胞進行基因工程學(xué)操作，使得人細胞表面的HLA表達下調(diào)或者 缺失，這種方法得到的人細胞具有低免疫原性。
[0014] 由此，本發(fā)明的首要目的在于，提供一種HLA缺失或減少的、具有低免疫原性的修 飾的人細胞及其制備方法，優(yōu)選所述細胞為人干細胞。本發(fā)明的第二個目的在于，提供由 本發(fā)明的修飾的人干細胞進一步制得的、具有降低的移植排斥性的移植用細胞及其制備方 法。本發(fā)明的第三個目的在于，提供本發(fā)明修飾的人干細胞以及移植用細胞在疾病治療中 的應(yīng)用（例如通過具有降低的免疫原性的移植等）。
[0015] 在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種修飾的人細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，所 述修飾的人細胞的細胞表面人類白細胞抗原HLA蛋白或多肽缺失或表達下調(diào)，從而使得所 述修飾的人細胞具有降低的免疫原性。
[0016] 在一個優(yōu)選例中，所述HLA蛋白或多肽為HLA I類蛋白或多肽。在另一個優(yōu)選例 中，所述HLA蛋白或多肽為選自下組中的至少一種：HLA A型多肽、HLA B型多肽和HLA C型 多肽。在另一個優(yōu)選例中，所述人細胞選自下組：造血細胞、神經(jīng)細胞、血液細胞、脂肪細胞、 間充質(zhì)細胞、肌肉細胞、心臟細胞、肝臟細胞、胰腺細胞、皮膚細胞等。
[0017] 在一些實施方式中，所述人細胞是人干細胞，優(yōu)選人多能干細胞。在一個優(yōu)選例 中，所述修飾的人干細胞基于選自下組的干細胞：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。
[0018] 在另一個優(yōu)選例中，所述修飾的人干細胞通過對選自下組的干細胞系進行基因 工程化操作獲得：胚胎來源的胚胎干細胞，例如已建立的胚胎干細胞系；誘導(dǎo)多能干細胞 (induced pluripotent stem cells, iPS);生殖細胞起源的干細胞；通過體細胞核移植 (SCNT)所獲得的干細胞。優(yōu)選已建立的干細胞系（例如胚胎干細胞，如XI細胞系）、誘導(dǎo) 多能干細胞。
[0019] 在另一個優(yōu)選例中，所述修飾的人干細胞基于選自下組的干細胞：造血干細胞、神 經(jīng)干細胞、周邊血干細胞、脂肪干細胞、間充質(zhì)干細胞、肌肉干細胞、心臟干細胞等。
[0020] 在另一個優(yōu)選例中，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞的HLA I類多 肽在細胞表面表達下調(diào)至少30%，優(yōu)選下調(diào)至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%，更優(yōu) 選不表達HLA I類多肽。
[0021] 在另一個優(yōu)選例中，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的人干細胞的免疫原 性降低，優(yōu)選與移植相關(guān)的免疫原性降低。在另一個優(yōu)選例中，所述免疫原性的降低在統(tǒng)計 學(xué)上具有顯著差異（P〈〇. 05)，更優(yōu)選具有極顯著差異（P〈0. 001)。
[0022] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述修飾的人干細胞不具有發(fā)育成人類個體的能 力。
[0023] 在另一個優(yōu)選例中，相對于相應(yīng)的野生型干細胞，所述修飾的干細胞具有降低的 免疫原性。相對于相應(yīng)的野生型干細胞，所述降低可選自下組：（i)用所述修飾的干細胞 誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平降低；（ii)用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的細胞因子水平降低；和/或 (iii)用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的外周血細胞增殖水平降低。
[0024] 在另一個優(yōu)選例中，（i)、（ii)和/或（iii)中的所述水平基本上低于相應(yīng)野生型 干細胞所致的水平，是相應(yīng)野生型干細胞所致的水平的10%?95%，更優(yōu)選10%?50%。在 另一個優(yōu)選例中，和/或（iii)中的所述水平比相應(yīng)野生型干細胞所致的水平降 低0. 05?10倍，更優(yōu)選1?10倍。
[0025] 在另一個優(yōu)選例中，所述（i)中的炎性應(yīng)答水平是在開始注入所述修飾的干細胞 后約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天測定的。所述降低的炎性應(yīng)答水平包括炎性 細胞數(shù)量的減少。采用炎性細胞侵潤分析法來定量所述炎性應(yīng)答水平。
[0026] 在另一個優(yōu)選例中，所述（ii)中的細胞因子水平是在外周血與所述修飾的干細 胞共孵育后約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天測定的。所述細胞因子水平的降 低包括降低干擾素的量。采用酶聯(lián)免疫吸附斑點分析法相對于相應(yīng)的野生型干細胞定量所 述細胞因子水平。
[0027] 在另一個優(yōu)選例中，所述（iii)中的外周血細胞增殖水平是在開始孵育所述修飾 的干細胞和外周血細胞后約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天計算的。所述外周血 細胞增殖水平包括采用免疫表型分析法定量的外周血單核細胞（PMBC)增殖水平。
[0028] 在另一些實施方式中，所述修飾的人細胞中HLA I類分子生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中 的一種或多種基因表達下降。在一個優(yōu)選例中，所述HLA I類分子生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中 的一種或多種基因發(fā)生全部或部分缺失。在另一個優(yōu)選例中，所述修飾的人細胞的內(nèi)源性 HLA基因被破壞，優(yōu)選通過基因定點修飾將所述破壞引入所述修飾的人細胞的基因組，更優(yōu) 選所述破壞包括同源性破壞HLA基因。
[0029] 在另一些實施方式中，所述基因選自：B2M基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、 或NLRC5基因，優(yōu)選B2M基因。
[0030] 在另一個優(yōu)選例中，所述B2M基因、TAP 1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基 因全部或部分缺失。
[0031] 在一個優(yōu)選例中，通過TAP廠〃雙拷貝敲除或TAP1 + 〃單拷貝敲除實現(xiàn)所述TAP1 的缺失或表達下降。在另一個優(yōu)選例中，所述ΤΑΡ1+/_ (單拷貝敲除）使得所述修飾的干細 胞的HLA I類蛋白或者多肽在細胞表面表達下調(diào)。在另一個優(yōu)選例中，所述TAPI^p (雙 拷貝敲除）使得所述修飾的干細胞的HLA I類分子或者多肽在細胞表面表達下調(diào)，更優(yōu)選 不表達HLA I類蛋白或者多肽。
[0032] 在另一些實施方式中，所述B2M基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5 基因全部或部分缺失。通過B2M W_雙拷貝敲除或B2M + -單拷貝敲除實現(xiàn)所述β2-微球 蛋白的缺失或表達下降。在另一個優(yōu)選例中，所述Β2Μ + /-(單拷貝敲除）使得所述修飾的 干細胞的HLA I類蛋白或者多肽在細胞表面表達下調(diào)至少30%。在另一個優(yōu)選例中，所述 Β2Μ~-(雙拷貝敲除）使得所述修飾的干細胞的HLA I類分子蛋白或者多肽在細胞表面 表達下調(diào)至少90%，更優(yōu)選不表達HLA I類分子蛋白或者多肽。
[0033] 在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種制備本發(fā)明所述的修飾的人細胞的方法，所 述方法包括:Α)提供原料人細胞；Β)對所述原料人細胞進行修飾改造，以使其HLA生物合 成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因表達下降；C)收集所述修飾的人細胞。
[0034] 在一個優(yōu)選例中，步驟Α)中的原料人細胞選自下組：全能干細胞、多能干細胞 和單能干細胞。在另一個優(yōu)選例中，所述人干細胞原料選自下組：已建立并可公開獲得 的人胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs);人誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS);生殖細胞起源的干細胞；通過體細胞核移植（SCNT)所獲 得的干細胞。優(yōu)選已建立的干細胞系（例如胚胎干細胞，如XI細胞系）、誘導(dǎo)多能干細胞。
[0035] 在另一個優(yōu)選例中，所述原料人干細胞選自下組：成體干細胞例如造血干細胞、神 經(jīng)干細胞、血液干細胞、脂肪干細胞、間充質(zhì)干細胞、肌肉干細胞、心臟干細胞等。
[0036] 在另一個優(yōu)選例中，所述原料人細胞選自下組：造血細胞、神經(jīng)細胞、血液細胞、月旨 肪細胞、間充質(zhì)細胞、肌肉細胞、心臟細胞、肝臟細胞、胰腺細胞、皮膚細胞等體細胞。
[0037] 在一個優(yōu)選例中，步驟B)使得原料人細胞中HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或 多種基因發(fā)生全部或部分基因缺失。在另一個優(yōu)選例中，所述基因選自：β 2-微球蛋白基 因、ΤΑΡ1基因、ΤΑΡ2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因，優(yōu)選Β2Μ基因。
[0038] 在另一些實施方式中，所述步驟B)是使得所述原料人細胞中的HLA I類分子組分 蛋白的B2M基因缺失或使得該基因的表達下調(diào)。
[0039] 在一個優(yōu)選例中，所述步驟B)使得所述原料干細胞中B2M基因發(fā)生全部或部分基 因缺失。在另一個優(yōu)選例中，通過B2iT~雙拷貝敲除或B2M+P單拷貝敲除實現(xiàn)所述β 2-微 球蛋白的缺失或表達下降。在另一個優(yōu)選例中，所述Β2Μ + /-(單拷貝敲除）使得所述修飾 的干細胞的HLA I類蛋白或者多肽在細胞表面表達下調(diào)至少30%。在另一個優(yōu)選例中，所 述(雙拷貝敲除）使得所述修飾的干細胞的HLA I類分子蛋白或者多肽在細胞表 面表達下調(diào)至少90%，更優(yōu)選不表達HLA I類分子蛋白或者多肽。
[0040] 在另一個優(yōu)選例中，通過TAP廠〃雙拷貝敲除或TAP1 + -單拷貝敲除實現(xiàn)所述 TAP1的缺失或表達下降。在另一個優(yōu)選例中，ΤΑΡ1+/_ (單拷貝敲除）使得所述修飾的干 細胞的HLA I類蛋白或者多肽在細胞表面表達下調(diào)。在另一個優(yōu)選例中，所述TAP廠~ (雙 拷貝敲除）使得所述修飾的干細胞的HLA I類分子蛋白或者多肽在細胞表面表達下調(diào)，更 優(yōu)選不表達HAL I類蛋白或者多肽。
[0041] 在另一個優(yōu)選例中，通過如下步驟進行所述B):
[0042] B1)構(gòu)建打靶載體，所打靶的目標為HLA I類分子組分蛋白的B2M基因；
[0043] B2)用所述打靶載體轉(zhuǎn)染所述人細胞，得到因 B2M基因被敲除而使得細胞表面HLA I類分子表達缺失或下調(diào)的人細胞。
[0044] 在另一個優(yōu)選例中，所述步驟B)是通過基因定點修飾技術(shù)實現(xiàn)的。在另一個優(yōu)選 例中，所述步驟B)是通過TALEN實現(xiàn)的。在另一個優(yōu)選例中，所述步驟B)是通過TALEN法 單拷貝或雙拷貝敲除所述人細胞中的HLA I類分子組分蛋白的B2M基因。
[0045] 在另一些實施方式中，所述步驟C)包括：從步驟B)中所得細胞中選擇細胞表面 HLA I類分子表達缺失或下調(diào)的人細胞，從而獲得細胞表面的HLA I類分子缺失或表達下調(diào) 的修飾的人細胞。
[0046] 在另一些實施方式中，所述方法還任選包括：D)檢驗步驟C)中所得修飾的人細胞 的免疫原性，以確定所述修飾的人細胞與野生型細胞相比具有降低的免疫原性。
[0047] 在一個優(yōu)選例中，所述方法包括：收集包含靶多核苷酸的人細胞，所述靶核酸與 HLA I類分子生物合成或轉(zhuǎn)運途徑的一種和多種基因相關(guān)；將轉(zhuǎn)錄激活子樣（TAL)效應(yīng) 子核酸酶導(dǎo)入所述人細胞以產(chǎn)生所述修飾的干細胞；和分離所述修飾的干細胞，其中多種 TAL效應(yīng)子重復(fù)序列與靶多核苷酸結(jié)合。
[0048] 在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種具有降低的免疫原性的移植用細胞，所述移 植用細胞是由本發(fā)明所述修飾的人細胞獲得或誘導(dǎo)分化來的，或是由采用本發(fā)明所述方法 制得的修飾的人細胞獲得、誘導(dǎo)分化、或者轉(zhuǎn)分化來的。
[0049] 在一個優(yōu)選例中，與相應(yīng)的野生型細胞相比，所述移植用細胞與移植相關(guān)的免疫 原性降低。在另一個優(yōu)選例中，所述免疫原性的降低在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異（P〈〇. 05)，更 優(yōu)選具有極顯著差異（P〈〇. 001)。
[0050] 在另一個優(yōu)選例中，所述分化的誘導(dǎo)是通過選自下組的方法進行的：擬胚體形成、 生長因子誘導(dǎo)的分化、小分子化合物誘導(dǎo)的分化、轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的分化、或其他方法誘導(dǎo)的 分化以及轉(zhuǎn)分化。
[0051] 在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種制備本發(fā)明所述移植用細胞的方法，所述方 法包括：誘導(dǎo)本發(fā)明所述修飾的人細胞分化為所需的移植用細胞；或用采用本發(fā)明所述方 法制得的修飾的人細胞，并誘導(dǎo)所得的修飾的人細胞分化為所需的移植用細胞，其中所述 修飾的人細胞是修飾的人干細胞，優(yōu)選修飾的人多能干細胞。
[0052] 在本發(fā)明的第五方面中，提供了本發(fā)明所述修飾的人細胞、通過本發(fā)明方法制得 的修飾的人細胞、本發(fā)明的移植用細胞或通過本發(fā)明方法制得的移植用細胞在制備用于疾 病治療的移植物或藥物組合物中的用途。
[0053] 在一個優(yōu)選例中，所述修飾的人干細胞為未分化或分化狀態(tài)。在另一個優(yōu)選例中， 所述移植物或藥物組合物具有減弱的免疫排斥反應(yīng)。
[0054] 在另一個優(yōu)選例中，所述移植物或藥物組合物用于治療選自下組的疾?。号两鹕?氏病、亨廷頓舞蹈癥、阿茲海默癥、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮癥等神經(jīng)退行性 疾病，以及脊髓損傷、中風(fēng)、燒傷、心臟病、肝病、糖尿病、造血功能缺陷、癌癥等的器官移植 (如胰腺移植、肝細胞移植、腎臟移植等）及損傷再生。
[0055] 在本發(fā)明的其它方面中，還提供了本發(fā)明的修飾的人細胞在器官再生、修復(fù)、疾病 治療等方面（例如治療細胞功能障礙或組織破壞）、對干細胞全能性的機理研究、器官移 植、藥物篩選、基因治療中的應(yīng)用。
[0056] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種對患者進行干細胞治療的方法，所述方法 包括：（a)分離和收集人干細胞；(b)對所述人干細胞進行修飾改造，以使其HLA生物合成 或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因表達下降；（c)收集所述修飾的人干細胞；(d)將所述修飾 的人干細胞移植入需要所述治療的患者，或誘導(dǎo)所述修飾的人干細胞分化為所需的細胞類 型后移植入需要所述治療的患者。
[0057] 在一個優(yōu)選例中，所述干細胞可為獲自患者本身或他人的干細胞。在另一優(yōu)選例 中，所述基因選自β 2-微球蛋白基因、TAP1基因、TAP2基因、TAPBP基因、或NLRC5基因，優(yōu) 選Β2Μ基因。
[0058] 在另一個實施方式中，提供了一種篩選候選藥物或評估候選化合物生理功能或毒 性的方法，所述方法包括步驟：用所述候選藥物或候選化合物處理本發(fā)明的修飾的人細胞 或由本發(fā)明的修飾的干細胞分化而得的所需細胞類型。
[0059] 從另一角度而言，在本發(fā)明中涉及一種修飾的細胞、產(chǎn)生用于移植的修飾的細胞 的方法、采用本發(fā)明細胞的治療方法。以下以修飾的干細胞為例，但應(yīng)理解所述修飾的細胞 可為其它類型的細胞，例如上文所例舉的各種細胞類型，優(yōu)選為人細胞。
[0060] 在本發(fā)明中涉及一種修飾的干細胞，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干 細胞包含的HLA多肽的量減少，且其中與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞具 有降低的免疫原性。
[0061] 在本發(fā)明的一些實施方式中，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞中 HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因表達下降。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所 述一種或多種基因包括全部或部分基因缺失。
[0062] 在本發(fā)明中進一步涉及一種產(chǎn)生用于移植的修飾的干細胞的方法，所述方法包 括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)修飾的干細胞，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞的HLA 多肽減少，其中與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞具有降低的免疫原性。
[0063] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的方法進一步包括：收集包含靶多核苷酸的干 細胞，所述靶核酸與HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑的一種和多種基因相關(guān)；將轉(zhuǎn)錄激活子樣 (TAL)效應(yīng)因子核酸酶導(dǎo)入所述干細胞以產(chǎn)生所述修飾的干細胞；和分離所述修飾的干細 胞，其中多種TAL效應(yīng)因子重復(fù)序列與靶多核苷酸結(jié)合。
[0064] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，采用本發(fā)明方法制 得的所述修飾的干細胞中HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因的表達降低。在本 發(fā)明的另一些實施方式中，所述一種或多種基因包含全部或部分基因缺失。
[0065] 在本發(fā)明進一步涉及一種治療方法，所述方法包括給予對象治療有效量的修飾的 干細胞，其中與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞包含的HLA多肽的量減少，且 其中與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞具有降低的免疫原性。
[0066] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述疾病是選自下組中的至少一種：帕金森氏病、亨 廷頓舞蹈癥、阿茲海默癥、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮癥等神經(jīng)退行性疾病，以 及脊髓損傷、中風(fēng)、燒傷、心臟病、肝病、糖尿病、造血功能缺陷癌癥等的器官移植及損傷再 生。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述對象是人。
[0067] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的干細胞 中HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因的表達降低。在本發(fā)明的另一些實施方式 中，所述一種或多種基因包含全部或部分基因缺失。
[0068] 如本發(fā)明前述的修飾的干細胞或方法，與相應(yīng)的野生型干細胞相比，所述修飾的 干細胞中累積的HLA多肽的量減少。在本發(fā)明的另一些實施方式中，與相應(yīng)的野生型干細 胞相比，所述修飾的干細胞上包含的HLA多肽的量減少。
[0069] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述修飾的細胞的內(nèi)源性HLA基因被破壞。在本 發(fā)明的另一些實施方式中，所述破壞是通過基因定點修飾導(dǎo)入所述修飾的細胞的基因組， 或者所述破壞包括同源性破壞HLA基因。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述破壞阻礙了 功能性HLA RNA在所述修飾的細胞中的表達。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述破壞使 得HLA基因的至少部分缺失。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述HLA多肽包含HLA I型 多肽。在本發(fā)明的另一些實施方式中，，優(yōu)選所述HLA多肽包括HLA A型多肽、HLA B型多 肽、HLA C型多肽中的至少一種，更優(yōu)選所述HLA多肽包括β 2免疫球蛋白多肽。
[0070] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述修飾的細胞的內(nèi)源性ΤΑΡ1基因被破壞。在本 發(fā)明的另一些實施方式中，所述破壞是通過基因定點修飾導(dǎo)入所述修飾的細胞的基因組， 或者所述破壞包括同源性破壞ΤΑΡ1基因。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述破壞阻礙了 功能性TAP1RNA在所述修飾的細胞中的表達。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述破壞使 得ΤΑΡ1基因的至少部分或全部缺失。
[0071] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，本發(fā)明所述的修飾的干細胞或方法中所述修飾的 干細胞包括全能干細胞和/或多能干細胞，優(yōu)選包括胚胎干細胞、誘導(dǎo)的多能干細胞，更優(yōu) 選所述修飾的干細胞包括人胚胎干細胞。
[0072] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，本發(fā)明所述的修飾的干細胞或方法中的免疫原性 降低包括：與用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平相比，用所述修飾的干細胞誘導(dǎo) 炎性應(yīng)答水平的降低，優(yōu)選用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平是用相應(yīng)的野生型干 細胞誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平的至少約20%、至少約50%、或基本上少于用相應(yīng)的野生型干細胞 誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平，優(yōu)選與用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平相比，用所述修 飾的干細胞誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平至少降低0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20倍。在本發(fā)明 的另一些實施方式中，在開始注入所述修飾的干細胞后約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 或14天測定用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答水平。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所 述降低的炎性應(yīng)答水平包括炎性細胞數(shù)量的減少。在本發(fā)明的另一些實施方式中，采用炎 性細胞浸潤分析法來定量所述炎性應(yīng)答水平。
[0073] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述降低的免疫原性包括：與相應(yīng)的野生型干細 胞相比，用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)細胞因子水平的降低，優(yōu)選用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的 細胞因子水平是用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的細胞因子水平的至少約20%、至少約50%、或 者用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的細胞因子水平基本上低于用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的細 胞因子水平。在本發(fā)明的另一些實施方式中，與用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的細胞因子水 平相比，用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的細胞因子水平至少降低0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或20倍。在本發(fā)明的另一些實施方式中，在開始注入所述修飾的干細胞后約2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13或14天測定用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的細胞因子水平。在本發(fā)明的另一 些實施方式中，所述細胞因子水平的降低包括降低干擾素的量。在本發(fā)明的另一些實施方 式中，采用酶聯(lián)免疫吸附斑點分析法相對于相應(yīng)的野生型干細胞定量所述細胞因子水平。
[0074] 在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述降低的免疫原性包括：相對于相應(yīng)的野生型 干細胞，用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的外周血細胞增殖水平降低，優(yōu)選用所述修飾的干細胞 誘導(dǎo)的外周血細胞增殖水平是用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的外周血細胞增殖水平的至少 約10%、至少約20%、至少約30%，更優(yōu)選用所述修飾的干細胞誘導(dǎo)的外周血細胞增殖水平基 本上低于用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的外周血細胞增殖水平。在本發(fā)明的另一些實施方式 中，與用相應(yīng)的野生型干細胞誘導(dǎo)的外周血細胞增殖水平相比，用所述修飾的干細胞誘導(dǎo) 的外周血細胞增殖水平至少降低1. 2、1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20倍。在本發(fā)明的另一 些實施方式中，在開始孵育所述修飾的干細胞和外周血細胞后約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13或14天計算所述水平。在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述外周血細胞增殖水平包 括采用免疫表型分析法定量的外周血單核細胞（PMBC)增殖水平。
[0075] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。并且，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對本文中所述的各種特征和方面進行有效的組合，這些組 合仍然在本申請所要求保護的范圍之內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0076] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：
[0077] 圖1 :人工設(shè)計的人B2M基因的TALEN識別的DNA序列及位點示意圖（以SEQ ID N0:4和7中所示的靶序列為例）。
[0078] 其中，NI對應(yīng)于A ;HD對應(yīng)于C ;NN對應(yīng)于G ;NG對應(yīng)于T。
[0079] 圖2A :B2M打靶載體TALEN-L86和TALEN-R102的結(jié)構(gòu)圖示意圖。
[0080] 圖2B :TAP1打靶載體TALEN-1L1和TALEN-1R1的結(jié)構(gòu)圖示意圖。
[0081] 圖3 :用人工設(shè)計的人B2M基因的TALEN在293T細胞中的打靶效率。
[0082] 圖4 :用人工設(shè)計的人B2M基因的TALEN建立的B2M敲除的人多能干細胞系測序 比對。
[0083] 圖5 :用人工設(shè)計的人B2M基因的TALEN(L86&R102)在人多能干細胞中的打靶效 率。
[0084] 圖6 :用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot)檢測B2M蛋白和HLA I類蛋白表達水平。
[0085] 圖7A :用FACS檢測正常人多能干細胞及敲除B2M的人多能干細胞的B2M和HLA I 類蛋白表達水平。
[0086] 圖7B :用FACS檢測正常人多能干細胞及敲除TAP1的人多能干細胞的HLA I類蛋 白表達水平。
[0087] 圖8 :將正常人多能干細胞及敲除B2M的人多能干細胞注射入Balb/c小鼠脛骨前 肌2天后進行蘇木精-伊紅染色。
[0088] 圖9 :正常人多能干細胞及敲除B2M的人多能干細胞刺激人外周血細胞的酶聯(lián)免 疫斑點分析（ELISPOT assay)實驗。
[0089] 圖10 :正常人多能干細胞及敲除B2M的人多能干細胞刺激人外周血細胞增殖實 驗。

【具體實施方式】
[0090] 本發(fā)明的發(fā)明人通過長期而深入的研究，利用特定的基因打靶技術(shù)克服了人細胞 (尤其是干細胞）上基因打靶效率低的問題，對人細胞上的HLA I類分子蛋白相關(guān)基因進行 了修飾改造（例如敲除人多能干細胞中編碼β 2-微球蛋白的基因，包括單拷貝敲除和雙拷 貝敲除），使所得人細胞表面的HLA I類分子表達下調(diào)或者不表達，這種方法得到的人細胞 具有低免疫原性。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0091] 相關(guān)定義
[0092] 除非另行定義，文中所使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員所知曉的意義相同。雖然任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明 的實施或測試中，優(yōu)選的方法和材料如本文所描述。為了本發(fā)明的目的，下述術(shù)語定義如 下。
[0093] 文中所用的術(shù)語"一"是指"一"或"多于一"（即"至少一"）個/種本文的語法對 象。例如，"一個/種元素"指一個/種元素或多于一個/種元素。
[0094] 術(shù)語"大約/約"是指總數(shù)、水平、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量 或長度與參照總數(shù)、水平、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度相比變化達 30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 或 1%。
[0095] 術(shù)語"大體上"或"基本上"是指幾乎全部或完全，例如，95%、96%、97%、98%、99%或 大于某給定的量。
[0096] "相當于"是指（a)具有與參照核苷酸序列的全部或者部分大體上相同或互補的核 苷酸序列的多核苷酸；或者編碼與多肽或者蛋白質(zhì)中氨基酸序列完全相同的氨基酸序列的 多核苷酸；或（b)具有與參照多肽或者蛋白質(zhì)大體相同的氨基酸序列的肽或多肽。
[0097] "下降"或者"減少"或者"少于"的量通常是"統(tǒng)計意義上顯著"或生理意義上顯 著的量，可包括本文所描述的量或水平下降約1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 61. 7、1. 8、1. 9、2、 2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、或 50,或更多倍（如 100、500、1000 倍）（包 括這些數(shù)值之間的所有的整數(shù)和小數(shù)點，且大于1，如1. 5、1. 6、1. 7、1. 8等）。
[0098] 在某些情況下，"下降"或者"減少"包括修飾干細胞引發(fā)免疫原性應(yīng)答的能力。在 特定的實施方式中，所述免疫原性應(yīng)答與非修飾或不同修飾的干細胞相比降低至少10%、至 少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%或至少1000%。在某 些實施方式中，所述免疫原性應(yīng)答降低約50%?200%。
[0099] 術(shù)語" β 2微球蛋白"或" β 2微球多肽"是指MHC I類基因的表達產(chǎn)物，例如天然 人β 2微球蛋白（可參見例如Gene ID為567的序列）、與前述表達產(chǎn)物具有至少65% (優(yōu) 選75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)氨基酸序列相同性且具有天然β 2微球蛋 白功能活性的蛋白質(zhì)或多肽。蛋白質(zhì)的"功能活性"是與該蛋白質(zhì)的生理功能相關(guān)的任何 活性。例如，天然β 2微球蛋白的功能活性包括：與其它MHC I類分子（例如α鏈）和MHC I類分子（例如聚類分化群1(CD1))相關(guān)的活性，與同種異體免疫相關(guān)的活性，且包括MHC I類分子的轉(zhuǎn)運。
[0100] 術(shù)語"結(jié)合"是指一種分子識別或附著樣品或組織中的特定第二種分子，但基本上 不能識別或附著該樣品中其它非結(jié)構(gòu)相關(guān)分子。
[0101] 術(shù)語"編碼序列"是指可用于編碼某基因的多肽產(chǎn)物的任何核酸序列。相反，術(shù)語 "非編碼序列"是指不用于編碼某基因的多肽產(chǎn)物的任何核酸序列。
[0102] 術(shù)語"互補性"及"互補"是指通過堿基配對原則相關(guān)的多核苷酸（即核苷酸序 列）。例如，序列"A-G-T"與序列"T-C-A"互補。"互補"可以是"部分的"互補，其中只有 部分核酸的堿基根據(jù)堿基配對規(guī)則匹配?；蛘撸梢允?完全"或"全部"核酸互補。核酸 鏈之間的互補程度對核酸鏈之間雜交的效率及強度有著顯著影響。
[0103] 靶基因的"缺失"可通過靶向基因的DNA實現(xiàn)，如采用領(lǐng)域內(nèi)已知的多種基因定點 修飾技術(shù)（如同源重組或者ZFN技術(shù)等）。這使得修飾的細胞產(chǎn)生或聚積比未修飾或者不 同修飾的細胞更少的特定蛋白質(zhì)產(chǎn)物（例如β 2微球蛋白）。
[0104] 術(shù)語"核酸內(nèi)切酶"是指能催化水解（切割）DNA或RNA分子（優(yōu)選DNA分子）中 核酸之間的鍵的任何野生型或變體酶。核酸內(nèi)切酶的例子包括但不限于：11型限制性內(nèi)切 酶，如FokI、Hhal、HindllI、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI和Alwl。本文中的核酸內(nèi)切酶可為轉(zhuǎn) 錄激活子樣（TAL)效應(yīng)因子核酸內(nèi)切酶（TALEN)。
[0105] 關(guān)于多核苷酸，術(shù)語"外源性的"指的是非天然存在于野生型細胞或生物體內(nèi)，而 通常是通過分子生物學(xué)技術(shù)導(dǎo)入所述細胞或生物體內(nèi)的多核苷酸序列。外源多核苷酸的實 例包括載體、質(zhì)粒和/或編碼所需蛋白質(zhì)的人工核酸構(gòu)建體。
[0106] 關(guān)于多核苷酸，術(shù)語"內(nèi)源性"或"天然"是指可在指定的野生型細胞或者生物體 中發(fā)現(xiàn)的、天然存在的多核苷酸序列。此外，從第一生物體中分離并通過分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn) 移到第二生物體中的特定多核苷酸序列，相對于所述第二生物體通常被認為是"外源性"多 核苷酸。在具體的實施方案中，可通過分子生物學(xué)技術(shù)將多核苷酸序列"導(dǎo)入"已含有此多 核苷酸序列的微生物體中，例如以創(chuàng)建一個或者多個此天然存在的多核苷酸序列的額外拷 貝，從而促進所編碼蛋白質(zhì)或多肽的過表達。
[0107] 如本文所用，術(shù)語"功能"和"功能性的"以及相似的用詞指生物的、酶的或治療性 的功能。
[0108] 術(shù)語"基因"表示在染色體上占據(jù)特定基因座的遺傳單位，它包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯 調(diào)控序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列（即內(nèi)含子，5'和3'的非翻譯序列），或由選自 上述的元件組成。
[0109] "同源性"是指相同氨基酸或者組成型保守取代的百分比。同源性也可通過 序列比對程序（如GAP)來確定（可參見例如Deveraux等·，1984, Nucleic Acids Researchl2, 387-395,納入本文作為參考）。通過這種方法，與本文所述的序列具有類似的 或基本上不同長度的序列可以通過缺口的插入進行比對，這樣的缺口可以通過例如GAP中 所用比對算法來確定。
[0110] 術(shù)語"宿主細胞"包括可作為或者已作為本發(fā)明任何重組載體或者分離得到的多 核苷酸的受體的單個細胞或者細胞培養(yǎng)物。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代，這些后代 由于自然、隨機或者有意的突變和/或變化，可能并不與原始親本細胞完全相同（形態(tài)或者 總DNA互補方面）。宿主細胞包括用本發(fā)明的重組載體或者多聚核苷酸體內(nèi)或者體外轉(zhuǎn)染 或者感染的細胞。包含了本發(fā)明重組載體的宿主細胞被稱為重組宿主細胞。
[0111] 術(shù)語"免疫原性"是指引起體內(nèi)或體外免疫原性應(yīng)答的能力。免疫原性應(yīng)答可由 免疫原（例如免疫原性多肽和/或細胞，如干細胞）引起。可通過各種測定法來檢測和/ 或定量特定免疫原的免疫原性。所述測定法的例子包括酶聯(lián)免疫測定法（ELISA)、基于表面 等離子共振技術(shù)（SPR)的測定法、PBMC免疫表型分析、以及炎性細胞浸潤分析。術(shù)語"干細 胞的免疫原性"是指干細胞引起體內(nèi)或體外免疫應(yīng)答的能力。
[0112] 術(shù)語"野生型"是指一種基因或基因產(chǎn)物，其具有該基因或基因產(chǎn)物從其天然存在 的來源中分離出來時的特征。野生型基因或基因產(chǎn)物（如多肽）在群體中被觀察到的頻率 最高，并由此被命名為"正常"或"野生型"的基因形式。
[0113] 術(shù)語"分離出的"是指大體上或者從本質(zhì)上不包含其天然狀況中通常伴隨的組分。 例如，"分離的多核苷酸"，如本文所用，是指從其天然存在狀態(tài)中側(cè)接的序列中純化出的多 核苷酸，例如，已從DNA片段通常鄰接的序列中移除的DNA片段?；蛘撸?分離的肽"或"分 離的多肽"和類似的，如本文所用，是指體外分離和/或純化的肽或多肽分子，這些分子從其 天然的細胞環(huán)境中，及從與細胞其它組分的關(guān)聯(lián)中分離和/或純化出來。"分離的細胞"，如 本文所用，是指將細胞從其原始存在的環(huán)境（例如生物體、組織、器官、體液、血液等）移出。
[0114] 關(guān)于探針或抗體，術(shù)語"標記的"是指通過偶聯(lián)（即物理連接）可檢測物質(zhì)和所述 探針或抗體來直接標記所述探針或抗體。
[0115] 術(shù)語"基因座"是染色體上DNA序列（例如基因）的特定物理定位。
[0116] 本文所用的"多核苷酸"或者"核酸"代表mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。該 術(shù)語通常是指長度至少為10個堿基的核苷酸多聚形式，包括核糖核苷酸或者脫氧核苷酸 或者這兩類核苷酸中任一類的修飾形式。該術(shù)語也包含DNA和RNA的單鏈或者雙鏈形式。
[0117] 術(shù)語"多核苷酸變體"和"變體"和類似術(shù)語是指顯示與參照多核苷酸序列實質(zhì)性 序列相同性的多核苷酸，或在下文中被定義的嚴格條件下，與參照序列雜交的多核苷酸。這 些術(shù)語也包括與參照多核苷酸具有至少一個核苷酸插入、缺失或取代的區(qū)別的多核苷酸。 因此，術(shù)語"多核苷酸變體"和"變體"包括其中已有一個或多個核苷酸的添加或缺失或被 不同的核苷酸所替換的多核苷酸。在這方面，本領(lǐng)域中很容易理解：可對參照多核苷酸進行 某些改變，包括突變、添加、缺失和取代，由此改變的多核苷酸保留參照多核苷酸的生物功 能或活性，或與參照多核苷酸相比具有提高的活性（即優(yōu)化的）。多核苷酸變體包括，例如， 與本文所述的參照多核苷酸序列具有至少50%(至少51%?至少99%，以及其間的所有整數(shù) 百分比，例如，90%、95%或98%)序列相同性的多核苷酸。術(shù)語"多核苷酸變體"和"變體"還 包括編碼這些酶的天然存在等位變體和直向同源物。
[0118] 術(shù)語"嚴格條件"指某序列（如探針、變體）能與其靶序列雜交，而不與其它序列雜 交的條件。嚴格條件是序列依賴的，在不同環(huán)境中不同。較長的序列在較高溫度下特異性 雜交。在確定的離子強度和pH條件下，嚴格條件一般選擇比特定序列的解鏈溫度（Tm)低 約15°C。此Tm是（在確定的離子強度、pH和核酸濃度下）與靶序列互補的探針有50%與 該靶序列雜交達到平衡時的溫度。（由于在Tm時靶序列通常過量存在，平衡時只有50%的 探針被占據(jù)）。通常嚴格條件是鹽濃度低于約1. 0M鈉離子，典型的是約0. 01?1. 0M鈉離 子濃度（或其它鹽），ρΗ7· 0?8. 3,短探針（10?15個核苷酸）的溫度至少約30°C，長探 針（50全核苷酸以上）的溫度至少約60°C。也可通過加入去穩(wěn)定試劑如甲酰胺來實現(xiàn)嚴格 條件。對于選擇性和特異性雜交，陽性信號通常應(yīng)是背景的至少二倍，優(yōu)選背景雜交的10 倍。示范性嚴格條件如下：50%甲酰胺、5XSSC和1%SDS，42°C培育，或5XSSC、1%SDS，65°C 培育，65 °C用0. 2 X SSC和0. 1%SDS洗滌。對于PCR，通常在溫度約36 °C作低嚴格性擴增，雖 然退火溫度要根據(jù)引物長度在約32?48°C之間變化。對于高嚴格PCR擴增，通常溫度為 約62°C，雖然高嚴格退火溫度范圍為約50°C至約65°C，這取決于引物長度和特異性。高和 低嚴格性擴增的典型循環(huán)條件包括：90?95°C變性30?120秒，退火持續(xù)30?120秒，約 72°C延伸1?2分鐘。低和高嚴謹性擴增反應(yīng)和方法和指南可參見例如：Innis等，（1990) PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR 方案：方法和應(yīng)用指南），學(xué) 術(shù)出版社（Academic Press),紐約。
[0119] 術(shù)語"核酸酶"包括核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。
[0120] 術(shù)語"多肽"、"多肽片段"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在此可以互換使用，指的是氨基酸殘 基的聚合物及其變體和合成類似物。因此，這些術(shù)語適用于天然存在的氨基酸聚合物，以及 其中一個或多個氨基酸殘基是人工合成的非天然存在的氨基酸（如相應(yīng)的天然存在氨基 酸的化學(xué)類似物）的氨基酸聚合物。
[0121] 術(shù)語多肽"變體"指的是通過至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或取代而不同于參 照多肽序列的多肽。在某些實施方式中，多肽變體通過一個或多個保守或非保守取代區(qū)別 于參照多肽。在某些實施方式中，多肽變體包含保守取代，就該點而言，本領(lǐng)域中很容易理 解可將一些氨基酸改變?yōu)榫哂写笾骂愃铺匦缘牧硪恍┌被岫桓淖兌嚯牡奶烊换钚?。?肽變體也包括一個或多個氨基酸被添加或缺失，或被不同的氨基酸殘基替代的多肽。
[0122] 術(shù)語"參照序列"通常指的是用于與另一個序列比較的核酸編碼序列或者氨基酸 序列。參照序列包括本文描述的所有的多肽和多核苷酸序列，包括用名稱描述的序列（如， β 2微球蛋白）以及序列表中描述的序列。
[0123] 在此所用的術(shù)語"序列相同性"或者例如包括"與……具有50%序列相同性"，指得 是通過窗口比對，序列在逐個核苷酸基礎(chǔ)或逐個氨基酸基礎(chǔ)上是相同的。因此，"序列相同 性百分比"可通過用比較窗口比較兩條最佳匹配序列來計算，從而確定在兩條序列中存在 相同核酸堿基（如A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基（如丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘 氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天門 冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸）的位置的數(shù)目，以得到匹配位 置的數(shù)目。將匹配位置的數(shù)目除以在比較窗口中的位置的總數(shù)（g卩，窗口大?。瑢⒔Y(jié)果乘 以100,得到序列相同性百分數(shù)。包括與文本所述任何參照序列（參見例如序列表）具有至 少約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 或 100% 序列相同性的核 苷酸和多肽通常多肽變體保持參照多肽的至少一種生物活性。
[0124] 用于描述兩個或兩個以上的多核苷酸或多肽之間序列關(guān)系的術(shù)語包括"參照序 列"、"比較窗口"、"序列相同性"、"序列相同性的百分比"和"實質(zhì)性相同"。"參照序列"包 含的核苷酸和氨基酸殘基的長度至少為12個，但往往是15至18個，并且通常至少25個單 體單元。由于兩種多核苷酸均可以包括：（1)這兩種多核苷酸之間相似的序列（即只是全 長多核苷酸序列的一部分），和（2)這兩種多核苷酸之間有區(qū)別的序列，兩種（或更多種） 多核苷酸之間序列的比較通常是通過在"比較窗口 "內(nèi)比較這兩種多核苷酸的序列來進行， 從而識別和比較局部區(qū)域的序列相似性。"比較窗口"是指至少6個連續(xù)的位置的概念性 片段，通常約50至約100個，更通常約100至約150個連續(xù)的位置，在這些位置中，當序列 和參照序列最佳匹配之后，該序列與具有相同數(shù)目連續(xù)位置的參照序列進行比較。比較窗 口與參照序列（其中不包括添加或缺失）相比，可包括約20%或更少的添加或缺失（即，缺 口），作為兩條序列的最佳序列比對。最佳序列比對可以由計算機執(zhí)行算法（威斯康星遺 傳軟件包 7. 0 版（Wisconsin Genetics Software Package Release7. 0)的 GAP、BESTFIT、 FASTA和TFASTA，遺傳學(xué)計算機組，575科學(xué)驅(qū)動麥迪遜，WI，美國（Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison, WI, USA))實現(xiàn)，或通過檢測和任何這些選擇的方法產(chǎn) 生的最佳比對（即在比較窗口得到最高同源百分比）來確定。也可以參考BLAST程序族， 例如 Altschul 等人，1997 年，Nucl.Acids 1^8.25:3389 公開的程序。在41^8(：11111等人的 "分子生物學(xué)現(xiàn)行操作步驟"（"Current Protocols in Molecular Biology")，John Wiley & Sons Inc, 1994-1998,第15章的19. 3單元中，對序列分析有詳細的討論。
[0125] 術(shù)語"載體"是指其中可插入或克隆入多核苷酸的多核苷酸分子，優(yōu)選為DNA分 子，所述分子從例如質(zhì)粒、噬菌體、酵母或病毒中衍生的。載體優(yōu)選地包含一個或多個獨特 的限制性內(nèi)切酶位點，并且可以在限定的宿主細胞（包括靶細胞或組織或祖細胞或其組 織）中自主復(fù)制，或者整合至宿主基因組使得克隆序列可再生。因此，載體可以是自主復(fù)制 的載體，即作為染色體外實體存在的載體，這種復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，線性或閉合 環(huán)狀質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。該載體可以包含任何裝置用于確保自 我復(fù)制。或者當導(dǎo)入宿主細胞時，該載體可以整合到基因組并隨所整合的染色體一起復(fù)制。 這種載體可含有特定的序列，允許重組發(fā)生在宿主染色體中的特定的、所期望的部位。載體 系統(tǒng)可以包括單個載體或質(zhì)粒，兩個或更多的載體或質(zhì)粒，它們共同包含待引入到宿主細 胞基因組中的總DNA，或轉(zhuǎn)座子。通常，載體的選擇將取決于載體與將引入該載體的宿主細 胞之間的相容性。在本情況下，優(yōu)選地，載體優(yōu)選在干細胞中能夠行使功能，如質(zhì)粒。該載 體可以包括報告基因，如綠色熒光蛋白（GFP)，其既可以在融合到一個或多個編碼多肽架構(gòu) 中，也可以獨立表達。該載體還可以包括選擇標記物，如抗生素抗性基因，其可用于選擇合 適的轉(zhuǎn)化體。
[0126] 術(shù)語"統(tǒng)計學(xué)顯著的"指的是結(jié)果并不是偶然發(fā)生的。統(tǒng)計學(xué)顯著性可以通過本 領(lǐng)域任何已知的方法來確定。通常用P值來衡量顯著性，它表示零假設(shè)為真時，所觀察事件 可能發(fā)生的頻率或概率。如果所得P值小于顯著性水平，則推翻零假設(shè)。在單事件中，顯著 性水平定義為P值小于或等于0. 05。
[0127] 術(shù)語"TALEN"是指包含轉(zhuǎn)錄激活子樣（TAL)效應(yīng)因子結(jié)合區(qū)域和核酸內(nèi)切酶區(qū)域 的蛋白質(zhì)，這兩個區(qū)域的融合形成"單體TALEN"。某些單體TALEN本身具有功能，而其它則 需要與另一單體TALEN二聚化。當兩個單體TALEN相同時，二聚化可產(chǎn)生同二聚化TALEN， 而當兩個單體TALEN不同時，二聚化可產(chǎn)生異二聚化TALEN。例如當兩個單體TALEN的RVD 數(shù)不同和/或當至少一種RVD的內(nèi)容（即氨基酸序列）不同時，這兩個單體TALEN不同。術(shù) 語"TAL效應(yīng)因子-DNA修飾酶"是指包含轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子結(jié)合區(qū)域和DNA修飾酶區(qū) 域的蛋白質(zhì)。
[0128] 術(shù)語"樣品"用于本文時具有其最廣義的含義。包含多核苷酸、肽、抗體等等的樣 品可包括體液、細胞制備物或細胞生長的培養(yǎng)基的可溶性部分、基因組DNA、RNA或cDNA、細 胞、組織、皮膚、毛發(fā)等等。樣品的例子包括唾液、血清、活檢樣品、血液、尿液和血漿。
[0129] 術(shù)語"患者"、"對象"和"個體"可互換使用，均是指待處理和/或由其獲得生物樣 品的哺乳動物（例如人）對象。
[0130] 術(shù)語"治療有效量"是指可有效獲得所需治療反應(yīng)的本文所述組合物的量，例如足 以降低移植物免疫排斥或延長術(shù)后存活時間的量。特定的安全有效量或治療有效量可因 以下因素而改變：待治療的具體病狀、患者的身體狀況、待治療的哺乳動物或動物的類型、 治療的持續(xù)時間、同步治療的性質(zhì)（如有）、以及所用的特定劑型和化合物及其衍生物的結(jié) 構(gòu)。
[0131] 術(shù)語"治療"是指將治療劑應(yīng)用于或給予患者、或?qū)⒅委焺?yīng)用于或給予分離自 患者的組織或細胞系，所述患者患有疾病、具有疾病癥狀或具有易患病的體質(zhì)，從而達到治 愈、復(fù)原、緩和、緩解、改變、矯正、改善、改進或影響所述疾病、疾病癥狀或易患病的體質(zhì)。在 本發(fā)明中，所用的術(shù)語"治療"包括預(yù)防性治療。例如，對未鑒別出疾病或紊亂癥狀或臨床 相關(guān)表現(xiàn)的患者的"治療"是預(yù)防性治療，而對鑒別出疾病或紊亂癥狀或臨床相關(guān)表現(xiàn)的患 者的臨床、治愈性或姑息"治療"通常不構(gòu)成預(yù)防性治療。
[0132] 術(shù)語"分化誘導(dǎo)"是指用特定的方法誘導(dǎo)干細胞分化。常用的方法包括擬胚體形 成法、生長因子誘導(dǎo)法、小分子化合物誘導(dǎo)的分化、轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的分化、或其他方法誘導(dǎo) 的分化。轉(zhuǎn)錄因子表達調(diào)控誘導(dǎo)法等。例如用Activin A，Wnt3a等生長因子誘導(dǎo)人胚胎干 細胞向胰腺細胞分化（D，Amour, K.A·，（2006).Nat Biotechnol24, 1392-1401.)等。
[0133] 干細朐和多能干細朐
[0134] 術(shù)語"干細胞"（stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的 多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分 為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）和成體干細胞（somatic stem cell)。根 據(jù)干細胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細胞（totipotent stem cell, TSC)、多能干細胞 (pluripotent stem cell)和單能干細胞（unipotent stem cell)。
[0135] 如本文所用，術(shù)語"多能干細胞"（包括pluripotent stem cell, PSC)和 Multipotent Stem Cell，MSC)是指具有分化出多種細胞組織的潛能的干細胞，例如胚胎干 細胞或誘導(dǎo)多能干細胞（iPS細胞）；也包括發(fā)育潛能受到一定的限制，失去了發(fā)育成完整 個體的能力的一類干細胞，例如造血干細胞。
[0136] 多能干細胞，具有在適當條件下產(chǎn)生不同類型后代細胞的能力特征，按照本領(lǐng)域 所接受的標準試驗，如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或在組織培養(yǎng)中形成所 有三種胚層的能力可鑒定此細胞。
[0137] 可利用自愿捐獻的生殖細胞、體外受精（例如體外受精時多余的配子或囊胚）、體 細胞核移植（例如通過體細胞核移植技術(shù)所獲得的囊胚和單性分裂囊胚）或細胞重編程獲 得多能干細胞?；蛘?，可從成體骨髓和各種組織器官獲得多能干細胞。
[0138] 可用于制備本發(fā)明低免疫原性多能干細胞的多能干細胞原料可包括但不限于：已 建立的胚胎干細胞、生殖細胞起源的干細胞、通過體細胞核移植（SCNT)所獲得的干細胞、 誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS)，優(yōu)選已建立的胚胎干細胞（如 XI細胞系等）、誘導(dǎo)多能干細胞。
[0139] 本文所用的"胚胎干細胞"(ESC)，是當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時，內(nèi)細胞團（inner cell mass)的細胞在體外培養(yǎng)而成、能夠無限增殖、自我更新且具有發(fā)育全能性的一種細 胞。所述細胞不具備發(fā)育成完整個體的潛能，只能分化成人體其它成體細胞類型，從該角度 而言，其本質(zhì)上與其它類型的成體干細胞無異，僅僅是比其它成體干細胞具有更多的潛能 而已。
[0140] 除非另有明確要求，該術(shù)語包括原代組織和建立的具有ES細胞表型特征的細胞 系和此類細胞系的后代，該后代仍能產(chǎn)生具有3個胚層各自表型性狀的后代細胞。優(yōu)選人 已3細胞0^5〇。了11〇1118〇11等.（5(^61?^282:1145，1998 ;美國專利 6,200,806)描述了原型 "人胚胎干細胞"（hES細胞），包括其中所述建立的細胞系。也可采用Thomson等（美國專 利 5, 483, 780，Science282:1145, 1998 ;Curr. Top. Dev. Biol. 38:133,1998)和 Reubinoff 等 (Nature Biotech. 18:399,2000)所述的技術(shù)從人胚泡制備人胚胎干（hES)細胞。
[0141] 關(guān)于組織培養(yǎng)和胚胎干細胞，可參考例如："畸胎瘤和胚胎干細胞：實施方 法(Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach)，'（E. J. Robertson 編，LPL Press Ltd，1987)小鼠開發(fā)技術(shù)指南（Guide to Techniques in Mouse Development)"（P.M.Wasserman 等編，Academic Press，1993)胚胎干細胞 的體外分化（Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro)"（M.V. Wiles，Meth. Engymol. 225:900,1993)胚胎干細胞的特性和應(yīng)用：在人類生物和基因治療中的應(yīng)用前 景（Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Humcn. Biology and Gene Therapy) "（P. D. Rathjen 等，Repord. Fortil. Dev. 10:31，1998)。
[0142] 本發(fā)明的修飾的細朐及其制各
[0143] 如本文所用，術(shù)語"修飾"或"修飾的"是指通過遺傳工程操作，使得原料細胞細胞 表面的HLA I類分子蛋白或多肽缺失或表達下調(diào)，從而降低所得細胞的免疫原性/排斥性。 所述修飾可使得人細胞中HLA I類分子生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因（例如 B2M基因）表達缺失或下降，例如使所述基因發(fā)生全部或部分基因缺失。
[0144] 如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明的人細胞"、"修飾的人細胞"、"具有低免疫原性的人細 胞"、"HLA減少的人細胞"等可互換使用，均是指通過本發(fā)明的基因工程方法操作使得人細 胞中的HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因表達下降（例如使得B2M基因缺失或 表達下調(diào)，如利用TALEN方法雙拷貝或單拷貝敲除B2M)，從而產(chǎn)生的免疫原性低于正常人 細胞的一類新型細胞。
[0145] 在某些方面，可通過如下方式使得靶基因稱為"非功能性":通過在核苷酸水平的 改變或突變改變所編碼多肽的氨基酸序列以表達修飾的多肽，所述修飾多肽就其活性而言 功能降低或活性降低（例如引入HLA I類分子的轉(zhuǎn)運），無論是通過修飾多肽的活性位點、 其細胞內(nèi)定位、其穩(wěn)定性，或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其它功能特性。對此涉及HLA 表達的多肽編碼序列的的這類修飾可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)實現(xiàn)，如對給定細胞進行 基因組水平的定向誘變和/或天然選擇（即定向進化）。
[0146] 制備本發(fā)明的修飾的人細胞的方法，可包括如下主要步驟：
[0147] A)提供原料人細胞，優(yōu)選人干細胞，更優(yōu)選人多能干細胞；
[0148] B)對所述原料人細胞進行修飾，以使其HLA I類分子生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一 種或多種基因表達下降；
[0149] C)收集所述修飾的人細胞。
[0150] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述方法包括：
[0151] A'）提供人細胞，優(yōu)選人干細胞，更優(yōu)選人多能干細胞，更優(yōu)選人胚胎干細胞；
[0152] B'）敲除所述人多能干細胞中的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen， HLA)蛋白或多肽的組份蛋白的B2M基因或使得該基因的表達下調(diào)；
[0153] C'）從步驟B'）經(jīng)基因工程化操作的細胞中選擇細胞表面HLA I類分子表達缺失 或下調(diào)的多能干細胞系，從而獲得所述人多能干細胞。
[0154] 在本發(fā)明的一些實施方式中，可采用包含如下主要步驟的方法：
[0155] A''）提供原料人細胞，優(yōu)選人干細胞，更優(yōu)選人多能干細胞；
[0156] B''）構(gòu)建打靶載體，所打靶的目標為HLA I類分子組份蛋白的B2M基因；
[0157] C' '）用所述打靶載體轉(zhuǎn)染所述人多能干細胞，通過對單細胞起始的克隆進行傳代 培養(yǎng)，得到因 B2M基因被敲除而使得細胞表面HLA I類分子表達缺失或下調(diào)的人多能干細 胞系；
[0158] D' '）任選地，檢驗步驟C' '）中所得多能干細胞的免疫原性，以確定所述多能干細 胞與正常多能干細胞相比具有降低的免疫原性。
[0159] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B' '）中的打靶載體可為TALEN打靶載體?？筛?據(jù)如下原則初步選擇TALEN識別序列：（1)第0位堿基為T (識別序列第一位之前的堿基為 第0位）；（2)最后一位堿基為T ; (3)識別序列長度在13-19之間；(4)二個識別序列之間 的間隔序列（Spacer)長度控制在13-21之間（12也可，但效率可能較低）。可用于本發(fā)明 的TALEN靶序列包括但不限于：SEQ ID NOs :4-17中所示的序列?？蓪?gòu)建的TALEN的靶 點識別模塊克隆入表達載體，優(yōu)選真核表達載體，例如但不限于：P⑶NA3. 0。
[0160] 近年發(fā)展很快的序列特異性核酸酶可以用于精確的基因組靶向修飾。一般的序列 特異性核酸酶由一個DNA識別結(jié)構(gòu)域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。其作用原理 是：首先由DNA識別域把核酸酶定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后由非特異性核酸內(nèi)切 酶切斷雙鏈DNA，從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB);由此引入的DSB可 激活DNA自我修復(fù)，從而可以引起基因的突變和促進該位點DNA同源重組。
[0161] 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN)是近期發(fā)展很快的一種序列特異性核酸酶，其作用原理是：由特異性識 別DNA的串聯(lián)"蛋白模塊"識別靶DNA序列，并把與之融合表達的非特異性DNA切割蛋白 Fokl的兩個單聚體定位到一起；DNA切割蛋白形成雙聚體時，可以切斷該位置的雙鏈DNA， 從而造成DSB。
[0162] Rudolf Jaenisch小組驗證了 TALEN在人胚胎干細胞和人iPS細胞中的打靶效 果(Rudolf Jaenisch 等，Genetic Engineering of Human Pluripotent Cells Using TALE NuCleaSes("采用TALE核酸酶對人多能干細胞進行的基因工程化操作"）；Nature Biotechnology，第29卷，第8期：731-734,2011年8月）。他們通過比較在五個位點利用 TALEN的打祀效果和之前在相同位置利用鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN)的打 靶效果，得出五組TALEN在打靶效率和精確度上都與從Sangamo BioSciences公司購買的 ZFN相似，進一步驗證了 TALEN是非常好的基因組編輯工具。
[0163] 然而，盡管TALEN技術(shù)是很好的基因修飾工具，并且在不斷改進和成熟中，但并非 根據(jù)原理設(shè)計的每一對TALENs都有基因修飾活性，也需要通過嘗試眾多不同的TALENs組 合，才能找到有活性的TALENs。在本發(fā)明中，發(fā)明人從眾多Talens中篩選出了具有活性的 TALENs，并優(yōu)選其中效率最高的TALENs進行了后續(xù)實驗。
[0164] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟C'）的傳代培養(yǎng)是將多能干細胞克隆按1:1? 20,優(yōu)選1:4?10,更優(yōu)選1:6?8的比例傳代至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上。
[0165] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟C' '）中細胞表面HLA I類分子表達缺失或下調(diào) 可采用選自下組的一種或多種方法和/或指標檢測，當然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可采用本 領(lǐng)域中已知的其它方法或結(jié)合選自下組的方法對此進行檢測：
[0166] 1)測序檢驗β 2-微球蛋白基因缺失；
[0167] 2)用蛋白質(zhì)印跡法檢測β 2-微球蛋白蛋白在多能干細胞內(nèi)表達缺失；和
[0168] 3)采用流式細胞技術(shù)檢測β 2-微球蛋白、HLA I類分子蛋白在人多能干細胞表面 表達缺失。
[0169] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法，檢驗所得干細胞的免疫原性可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 已知的方法進行，例如對上述細胞及普通干細胞引起的小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)強度進行檢測。 小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)強度檢測可包括以下步驟：
[0170] 1)將本發(fā)明的多能干細胞和普通人干細胞分別注射入Balb/c小鼠肌肉內(nèi)；
[0171] 2) -段時間后取出注射過細胞的小鼠肌肉進行切片；
[0172] 3)對上述切片進行HE染色，統(tǒng)計炎癥細胞數(shù)量。
[0173] 由此，本發(fā)明中提供了一種主要組織相容性抗原缺失或下調(diào)的人干細胞及其制備 方法，它具有低免疫原性。
[0174] 移棺用細朐及其制各
[0175] 在獲得了本發(fā)明的修飾的干細胞及其制備方法的基礎(chǔ)上，本發(fā)明中還進一步提供 了免疫原性降低的移植用細胞及其制備方法。
[0176] 所述移植用細胞可直接為本發(fā)明的修飾的人細胞或可通過誘導(dǎo)本發(fā)明的修飾的 干細胞分化獲得，例如所述分化的誘導(dǎo)可為定向分化誘導(dǎo)。分化誘導(dǎo)的方法是本領(lǐng)域中熟 知的，例如可參考擬胚體形成、生長因子誘導(dǎo)的分化、小分子化合物誘導(dǎo)的分化、轉(zhuǎn)錄因子 誘導(dǎo)的分化、或其他方法誘導(dǎo)的分化。
[0177] 本發(fā)明的移植用細胞可包括：胰腺細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、心肌細胞、皮膚細胞 等細胞；可用于例如：胰腺移植、肝細胞移植、腎臟細胞移植、心肌細胞移植、皮膚細胞移植 等細胞移植。
[0178] 與相應(yīng)的野生型細胞相比，所述移植用細胞與移植相關(guān)的免疫原性降低，優(yōu) 選所述免疫原性的降低在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異（P〈〇. 05)，更優(yōu)選具有極顯著差異 (P〈0. 001)。
[0179] 本發(fā)明修飾的人細朐以及移棺用細朐的應(yīng)用
[0180] 如前所述，本發(fā)明的修飾的人細胞以及移植用細胞具有低免疫原性。因此，其可成 為一種新型的、具有低免疫排斥反應(yīng)的移植供體的來源，將為移植治療提供一種嶄新的材 料和方法。本發(fā)明的修飾的細胞可用于組織器官再生、修復(fù)、和疾病治療等方面（例如治療 細胞功能障礙或組織破壞），對干細胞全能性的機理研究以及器官移植、藥物篩選、基因治 療等臨床應(yīng)用研究具有重要價值。
[0181] 本發(fā)明的細胞可用于如下用途，包括但不限于：帕金森氏病、亨廷頓舞蹈癥、阿茲 海默癥、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮癥等神經(jīng)退行性疾病，以及脊髓損傷、中風(fēng)、 燒傷、心臟病、肝病、糖尿病、造血功能缺陷癌癥等的器官移植及損傷再生。
[0182] 本發(fā)明細胞使用的通用原則可參見例如"細胞治療：干細胞移植、基因治療和細 胞免疫療法（Cell Therapy:Stem Cell Transplantation, Gene Therapy and Cellular Immunotherapy)G. Morstyn & ff. Sheridan 編，Cambridge University Press, 1996 和 "造血干細胞療法（Hematopoietic Stem Cell Therapy) "E.D. Ball, JLister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000 等。
[0183] 可提供包含本發(fā)明干細胞或移植用細胞的試劑盒或組合物以用于進一步的研究 和應(yīng)用。例如，本發(fā)明的組合物中可包含：(a)本發(fā)明的修飾的人細胞或移植用細胞；(b)藥 學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體或培養(yǎng)基。本發(fā)明的試劑盒中可包含：（a'）本發(fā)明的修飾的 人細胞或移植用細胞；(b'）藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體或培養(yǎng)基；（c'）任選的一個或 多個容器；（d'）任選的一個或多個適于給予本發(fā)明細胞的裝置；（e'）任選的使用說明書， 等等。
[0184] 本發(fā)明的豐要優(yōu)點
[0185] 本發(fā)明獲得了如下的主要技術(shù)進步：
[0186] 1.克服了本領(lǐng)域中的技術(shù)難點，首次成功敲除了人細胞中的β 2-微球蛋白基因；
[0187] 2.通過遺傳工程學(xué)修飾改造獲得了細胞表面HLA表達下調(diào)或甚至不表達的人細 胞，該細胞具有低免疫原性，有望成為新型的可降低或避免免疫排斥反應(yīng)的移植供體，為器 官移植提供了新材料和方法。
[0188] 由于本文的公開內(nèi)容且基于本領(lǐng)域中的常識，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可了解到本發(fā) 明的其它優(yōu)點。
[0189] 實施例
[0190] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明做出適當?shù)男薷?、變動，這些修改 和變動都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0191] 以下實施例中所使用的技術(shù)，包括PCR擴增與檢測、細胞轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)技術(shù) 以及細胞培養(yǎng)、檢測技術(shù)、免疫學(xué)方法等，除非特別說明，均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的 常規(guī)技術(shù)（例如參考《分子克隆實驗指南》（第三版，紐約，冷泉港實驗室出版社，New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989;《蛋白質(zhì)方法》（Protein Methods) (Bollag 等，John Wiley&Sonsl996);《免疫方法手冊》（Immunology Methods Manual) (I.Lefkovits 編，Academic Press, 1997)和《細胞和組織培養(yǎng)：生物技術(shù)中的試驗方法》（Cell and Tissue Cluture:Laboratory Procedures in Biotechnology)(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sonsl998))或按照供應(yīng)商所建議的條件）；所使用的儀器設(shè)備、試劑和細胞系等， 除非是本說明書特別注明，均為一般本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過公共途徑獲得的。
[0192] 除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有 專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均 等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之 用。
[0193] I.實施例中所用的細胞及其來源
[0194] 1.人多能干細朐
[0195] 本實驗的起始原料為"已建立的未分化人胚胎干（hES)細胞系"X1(參見mi Z 等，Derivation and characterization of human embryonic stem cell lines from the Chinese population("中國人群來源的人胚胎干細胞系的衍生和表征"），J Genet Genomics. 2011 年 1 月，38(1) :13-20)。
[0196] 本 申請人:已于2013年3月12日，將該人胚胎干（hES)細胞系提交中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC，中國北京）保藏，其保藏號為CGMCC7353。
[0197] 并且，本 申請人:承諾從申請日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料，前提為①簽訂生 物材料轉(zhuǎn)移協(xié)議；②僅限于合法的、非商業(yè)目的使用。
[0198] 2.小鼠杯胎成纖維（MEF)細朐
[0199] MEF細胞可從眾多商業(yè)公司購買，例如本發(fā)明中的MEF細胞購自Millipore公司。
[0200] II.實施例中所用的培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)產(chǎn)品
[0201] 1.用于人多能干細朐的培養(yǎng)某
[0202] 具體組成為：79%的D-MEM/F12培養(yǎng)液（購自 Invitrogen，10330) ;20%的Knockout SR(購自 Invitrogen，l〇828) ;lmM L-谷氨酸（購自 Invitrogen，25〇3〇) ;1% 的非必需氨基 酸（購自 Invitrogen，11140050) ;0· ImM 的 β -疏基乙醇（購自 Sigma，M7522) ;10 μ g 的 bFGF(購自 Invitrogen，13256-029)。
[0203] 2.用于小鼠杯胎成纖維（MEF)細朐的培養(yǎng)某
[0204] 具體組成為：89%的D-MEM培養(yǎng)液（購自Invitrogen，11965) ;10%的胎牛血清（購 自 HyClone，SH30396.03) ;lmM 的 L-谷氨酸（購自 Invitrogen，25030) ;1% 的非必需氨基 酸（購自 Invitrogen，11140050)。
[0205] 3.實施例中所用細朐培養(yǎng)產(chǎn)品
[0206] 以下實施例中，通用的細胞培養(yǎng)產(chǎn)品均購自Invitrogen公司。
[0207] III.實施例中所用的抗體
[0208] HLA-ABC、β 2m :購自BD (用于細胞流式檢測實驗）；
[0209] HLA-ABC、β 2m :購自 Santa Cruz (用于 western 檢測實驗）
[0210] 實施例1. TALEN靶序列的設(shè)計
[0211] 1.從NCBI上下載人β 2-微球蛋白基因組序列（Gene ID: 567)及TAP1基因組序 列（Gene ID:100507463)。
[0212] 2.設(shè)計引物，PCR擴增基因組上打靶位點片段并測序，其中，PCR引物及測序引物 見表1-1和表1-2 :[0213] 表 1-1

【權(quán)利要求】
1. 一種修飾的人細胞，其特征在于，與相應(yīng)的野生型細胞相比，所述修飾的人細胞的細 胞表面人類白細胞抗原HLA蛋白或多肽缺失或表達下調(diào)，從而使得所述修飾的人細胞具有 降低的免疫原性。
2. 如權(quán)利要求1所述的修飾的人細胞，其特征在于，所述人細胞是人干細胞，優(yōu)選人多 能干細胞。
3. 如權(quán)利要求1所述的修飾的人細胞，其特征在于，所述修飾的人細胞中HLA生物合成 或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種基因缺失或表達下降。
4. 如權(quán)利要求3所述的修飾的人細胞，其特征在于，所述基因選自：β 2-微球蛋白基因 Β2Μ、ΤΑΡ1基因、ΤΑΡ2基因、ΤΑΡΒΡ基因、或NLRC5基因，優(yōu)選β2-微球蛋白基因 Β2Μ。
5. 如權(quán)利要求4所述的修飾的人細胞，其特征在于，通過雙拷貝敲除或Β2Μ + ~單拷貝敲除實現(xiàn)所述β 2-微球蛋白的缺失或表達下降。
6. -種制備權(quán)利要求1?5中任一項所述的修飾的人細胞的方法，所述方法包括： Α)提供原料人細胞； Β)對所述原料人細胞進行修飾改造，以使其HLA生物合成或轉(zhuǎn)運途徑中的一種或多種 基因缺失或表達下降； C) 收集所述修飾的人細胞。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟Β)是使得所述原料人細胞中的HLA I類分子組分蛋白的Β2Μ基因缺失或使得該基因的表達下調(diào)。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟C)包括：從步驟Β)中所得細胞中 選擇細胞表面HLA I類分子表達缺失或下調(diào)的人細胞，從而獲得細胞表面的HLA I類分子 缺失或表達下調(diào)的修飾的人細胞。
9. 如權(quán)利要求6?8中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還任選包括： D) 檢驗步驟C)中所得修飾的人細胞的免疫原性，以確定所述修飾的人細胞與野生型 細胞相比具有降低的免疫原性。
10. -種具有降低的免疫原性的移植用細胞，所述移植用細胞是由權(quán)利要求1?5中任 一項所述修飾的人細胞獲得、誘導(dǎo)分化或轉(zhuǎn)分化來的，或是由采用權(quán)利要求6?9中任一項 所述方法制得的修飾的人細胞獲得、誘導(dǎo)分化或轉(zhuǎn)分化來的。
11. 一種制備權(quán)利要求10所述的移植用細胞的方法，所述方法包括：誘導(dǎo)權(quán)利要求 1?5中任一項所述修飾的人細胞分化為所需的移植用細胞；或采用權(quán)利要求6?9中任一 項所述方法制得的修飾的人細胞，并誘導(dǎo)所得的修飾的人細胞分化為所需的移植用細胞， 其中所述修飾的人細胞是修飾的人干細胞，優(yōu)選修飾的人多能干細胞。
12. 權(quán)利要求1?5中任一項所述修飾的人細胞、通過權(quán)利要求6?9中任一項所述的 方法制得的修飾的人細胞、權(quán)利要求10所述的移植用細胞或通過權(quán)利要求11所述的方法 制得的移植用細胞在制備用于疾病治療的移植物或藥物組合物中的用途。
【文檔編號】C12N15/85GK104046593SQ201310082427
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月14日
【發(fā)明者】肖磊, 陳霽君, 盧鵬飛 申請人:浙江大學(xué)