專利名稱：通過糖多孢紅霉菌sace_7301基因途徑提高紅霉素產(chǎn)量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種提高發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素產(chǎn)量的方法，尤其涉及一種通過增加糖多孢紅霉菌染色體上正向調(diào)控基因SACE_7301提高紅霉素產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
放線菌次級代謝產(chǎn)物具有廣泛的用途，如抗生素、抗癌劑、免疫調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑、昆蟲防治劑。目前發(fā)現(xiàn)的23000種生物活性次級代謝產(chǎn)物中，有10000多種是放線菌產(chǎn)生的。然而，這些次級代謝物原始產(chǎn)量非常低，需要通過篩選才能獲得工業(yè)生產(chǎn)高產(chǎn)菌株。過去工業(yè)生產(chǎn)菌株主要通過隨機物理或化學誘變方法獲得。傳統(tǒng)的隨機誘變技術(shù)不但耗時，而且無法指導對育種進行理性設(shè)計。本發(fā)明目的就是通過基因工程途徑定向改變基因來獲得紅霉素高產(chǎn)菌株，用于紅霉素或中間產(chǎn)物生產(chǎn)。糖多孢紅霉菌是1952年從土壤中分離出的革蘭氏陽性絲狀放線菌，其次級代謝產(chǎn)物紅霉素A是重要的廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，目前紅霉素系列化學衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、泰利霉素等)被廣泛用來治療感染性疾病。由于紅霉素及其衍生物每年的世界銷售量達數(shù)百億美元，吸引了許多科學家來研究如何提高其產(chǎn)量。2007年，Oliynyk等報道了糖多孢紅霉菌NRRL23338的基因組序列，但糖多孢紅霉菌調(diào)控基因研究很少，到目前為止只有bldD(SACE_2077)和SACE_7040的調(diào)控基因研究報道，及我們申報的發(fā)明專利(申請?zhí)?201210099708.8)。原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子可以分為LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、Lac1、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR> NtrC (EBP)、OmpR> DeoR、Cold shock、GntR 和 Crp 等 16 個家族，其中TetR家族成員在DNA結(jié)合域方面具有螺旋_轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)的結(jié)構(gòu)特征。TetR家族在細菌中普遍存在，大約有2000多個成員，但到目前為止人們只發(fā)現(xiàn)100多個成員的特征。糖多孢紅霉菌染色體上有 101個TetR家族基因，其中有些基因可能參與紅霉素生物合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是通過增加糖多孢紅霉菌中正向調(diào)控基因SACE_7301拷貝，提高紅
霉素產(chǎn)量。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:—種構(gòu)建紅霉素高產(chǎn)菌株的技術(shù)方法，所述的方法為:通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_7301基因拷貝數(shù)增加或提高SACE_7301基因表達量，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)工程菌株，用所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素。以SACE_7301為出發(fā)點構(gòu)建紅霉素高產(chǎn)菌株的技術(shù)方法，其特征在于以糖多孢紅霉菌SACE_7301基因或其表達產(chǎn)物為出發(fā)點，尋找到與紅霉素生物合成相關(guān)的新基因或蛋白，通過對尋找到的所有相關(guān)基因進行失活、增加拷貝、提高表達量等辦法構(gòu)建糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)菌株，用于發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素或中間產(chǎn)物。本發(fā)明的優(yōu)點是:
本發(fā)明研究中篩選到了紅霉素生物合成正向調(diào)控子SACE_7301，通過基因工程途徑增加糖多孢紅霉菌染色體上SACE_7301基因拷貝，能夠獲得紅霉素高產(chǎn)菌株，為工業(yè)生產(chǎn)提高紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量提供技術(shù)支持。糖多孢紅霉菌A226中敲除SACE_7301基因時紅霉素產(chǎn)量降低了 34.5%，而在ASACE_7301基因突變株中回補SACE_7301基因，紅霉素產(chǎn)量部分恢復，表明SACE_7301是一個參與紅霉素生物合成的正向調(diào)控子。當在糖多孢紅霉菌A226中增加SACE_7301基因拷貝時，紅霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高9.5%，說明在糖多孢紅霉菌中提高SACE_7301基因拷貝，可以構(gòu)建紅霉素高產(chǎn)菌株。同時，紅霉素生物合成基因調(diào)控是一個網(wǎng)絡，通過基因工程途徑改變SACE_7301基因或產(chǎn)物的上下游調(diào)控因子，也可構(gòu)建紅霉素高產(chǎn)菌株，用于提高發(fā)酵紅霉素產(chǎn)量。


圖1為染色體同源重組技術(shù)示意圖硫鏈絲菌肽抗性基因(tsr)替換了糖多孢紅霉菌A226染色體上SACE_7301基因；圖2為SACE_7301基 因在糖多孢紅霉菌染色體上的位置及編碼氨基酸序列參見 NCBI (http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/gene term=SACE 7301 及 http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/134096620 report=genbank&from=8107531&to=8108388)；圖3為Λ SACE_7301突變體鑒定及紅霉素產(chǎn)量分析(A) ASACE_7301 突變體鑒定:SACE_7301 基因(660bp)被 tsr 抗性基因(1360bp)替換后長度增加了 700bp ；M, 5000bp DNA Marker(B)糖多孢紅霉菌出發(fā)菌株A226、突變菌株ASACE_7301及回復菌株Δ SACE_7301/pZMW7301 (對照為 Λ SACE_7301/pZMW)在 TSB 培養(yǎng)基中 30°C發(fā)酵 6 天產(chǎn)物HPLC分析；圖4為SACE_7301基因過表達及紅霉素產(chǎn)量分析(A)A226/ pZMW7301過表達菌株P(guān)CR鑒定:PCR產(chǎn)物為pZMW載體上apr抗性基因(776bp) ；M, 5000bp DNA Marker(B)糖多孢紅霉菌出發(fā)菌株A226、SACE_7301過表達菌株A226/ pZMW7301 (對照為A226/pZMW)在TSB培養(yǎng)基中30°C發(fā)酵6天產(chǎn)物HPLC分析。
具體實施例方式實施例11.1菌株、質(zhì)粒與生長條件試驗中使用到的菌株和質(zhì)粒見表I。大腸桿菌在37° C的液體LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基或在添加1.25%瓊脂的LB平板上培養(yǎng)。紅霉素生產(chǎn)菌糖多孢紅霉菌A226及其工程菌株在30° C胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基或在含有2.2%瓊脂的R3M平板上培養(yǎng)。1.2材料、DNA操作與測序PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫鏈絲菌肽、安普霉素從Sigma公司購買。TSB、酵母提取物、蛋白胨購買于Oxoid公司。甘氨酸、瓊脂粉、氯化鈉和其它生物學試劑都購于試劑公司。大腸桿菌和糖多孢紅霉菌的一般操作技術(shù)按照標準操作。引物的合成和DNA測序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。表I試驗中使用到的菌株和質(zhì)粒
權(quán)利要求
1.SACE_7301基因的新功能:SACE_7301基因產(chǎn)物可以正向調(diào)控紅霉素生物合成。
2.—種構(gòu)建紅霉素高產(chǎn)菌株的技術(shù)方法，其特征在于所述的方法為:通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_7301基因拷貝數(shù)增加或提高SACE_7301基因表達量，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)工程菌株，用所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SACE_7301基因的新功能，其特征在于以糖多孢紅霉菌SACE_7301基因或其表達產(chǎn)物為出發(fā)點，尋找到與紅霉素生物合成相關(guān)的新基因或蛋白，通過對尋找到的所有相關(guān)基因進行失活、增加拷貝、提高表達量等辦法構(gòu)建糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)菌株，用于發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素或中間產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過糖多孢紅霉菌SACE_7301基因途徑提高紅霉素產(chǎn)量，其特征在于所述的方法為通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_7301基因拷貝數(shù)增加或提高SACE_7301基因表達量，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)工程菌株，用所述技術(shù)獲得的菌株發(fā)酵可以提高紅霉素產(chǎn)量。
文檔編號C12N1/21GK103205451SQ20131008276
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者張部昌, 劉敬濤, 吳杭, 袁莉 申請人:安徽大學