專利名稱：人椎間盤髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的細(xì)胞共培養(yǎng)，具體涉及一種人椎間盤髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
髓核細(xì)胞是人椎間盤組織中的主要細(xì)胞，對維持椎間盤正常形態(tài)具有重要的作用，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)退變的椎間盤中髓核細(xì)胞大量凋亡[Jones P, Gardner L, MenageJ, Williams GT, Roberts S:1ntervertebral disc cells as competent phagocytesin vitro:1mplications for cell death in disc degeneration.Arthritis research&therapy2008, 10(4):R86.] ； [Tschoeke SK, Hellmuth M, Hostmann A, RobinsonY,Ertel ff, Oberholzer A, Heyde CE:Apoptosis of human intervertebral discs aftertrauma compares to degenerated discs involving both receptor-mediated andmitochondrial-dependent pathways.Journal of orthopaedic research:officialpublication of the Orthopaedic Research Society2008, 26 (7): 999-1006.],椎間盤作為機(jī)體內(nèi)最大的免疫赦免器官[Buckwalter JA MV, Boden SD, Eyre DR, WeidenbaumM: Rosemont:American Academy of Orthopaedic Surgeons, 2nd ed edn; 2000.],其凋亡與免疫細(xì)胞的影響密切相關(guān)。但目前尚無免疫細(xì)胞與椎間盤髓核細(xì)胞的共培養(yǎng)研究模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人椎間盤髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型構(gòu)建方法即通過建立模型研究人椎間盤免疫赦免的作用機(jī)制。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:I)人髓核細(xì)胞分離及培養(yǎng)首先將髓核組織在無菌條件下分離，棄去其中的纖維環(huán)組織節(jié)軟骨板，將剩余的髓核組織在室溫下置于胰蛋白酶溶液中消化，隨后離心棄去上清液，在室溫下用II型膠原酶靜止消化后，再離心，棄去上清液，細(xì)胞用PBS液沖洗離心后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網(wǎng)濾去剩余組織，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；再以胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37°C含CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每三天換液一次；2)人外周血巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)2.1)外周血單核細(xì)胞(PBMCs)分離利用肝素抗凝管抽取外周血，以1:3的體積比將抽取的外周血加入RPM1-1640培養(yǎng)基并混勻，隨后再以1:1的體積比緩慢加至細(xì)胞分離液Ficoll-Paque中，室溫下以SOOXg離心30分鐘，隨后吸取白膜層即為外周血單核細(xì)胞；2.2)巨噬細(xì)胞分離及培養(yǎng)
將外周血單核細(xì)胞接種于含胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37°C含C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后，棄去培養(yǎng)瓶中上清液，即去除非粘附細(xì)胞，向剩余的粘附細(xì)胞中加入18ng/mL濃度的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL濃度的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，培養(yǎng)5天后，得到的粘附細(xì)胞即為外周血巨噬細(xì)胞；3)人外周血⑶8+T細(xì)胞分離及培養(yǎng)利用⑶8+T-cell Positive Isolation Kit試劑盒,根據(jù)說明，對外周血淋巴細(xì)胞逐步分離，得到外周血中的⑶8+T細(xì)胞；4)人髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型采用半透膜孔徑為0.4μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接觸共培養(yǎng)模型，將第I步得到的髓核細(xì)胞與免疫細(xì)胞(即巨噬細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞)按1:1的體積比共
培養(yǎng)；具體操作為:以1.5X106/孔的數(shù)目將髓核細(xì)胞接種于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基；將1.5X IO6的巨噬細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞接種于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共養(yǎng)48小時后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶λ韬思?xì)胞、巨噬細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。所述步驟I)將剩余的髓核組織先剪成I X Imm3碎塊，在室溫下置于質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化40min,隨后以1000r/min離心5min,棄去上清液,于室溫下用質(zhì)量濃度為0.025%的II型膠原酶靜止消化4h，再以1000r/min離心5min，棄去上清液，細(xì)胞再用PBS液沖洗3次，以1000r/min離心5min后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網(wǎng)濾去剩余組織，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； 再以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每三天換液一次。將外周血單核細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后。本發(fā)明共培養(yǎng)模型較好模擬了體外人髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用，可為體外椎間盤免疫研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)思路。發(fā)明人已在研究=FasL在椎間盤免疫赦免中的作用機(jī)制研究中，采用該共培養(yǎng)模型。此研究通過上調(diào)椎間盤退變患者髓核細(xì)胞中的FasL表達(dá)量，并與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)asL在髓核細(xì)胞中的上調(diào)可有效增加免疫細(xì)胞的凋亡比例。
具體實(shí)施例方式I)人髓核細(xì)胞分離及培養(yǎng)將收集的髓核組織在無菌條件下仔細(xì)分離，棄去纖維環(huán)組織節(jié)軟骨板，將剩余的髓核組織剪成I X Imm3碎塊，于室溫下以濃度為0.25%的胰蛋白酶消化40min，隨后低速離心(1000r/min) 5min,棄去上清液,于室溫下用0.025%的II型膠原酶靜止消化4h,低速離心(1000r/min) 5min后棄去上清液,細(xì)胞再用PBS液沖洗3次,低速離心5min,以45 μ m孔徑的尼龍過濾網(wǎng)濾去剩余組織，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每三天換液一次，密切觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。培養(yǎng)狀態(tài)下的髓核細(xì)胞。
2)人外周血巨噬細(xì)胞分離及培養(yǎng)2.1)外周血單核細(xì)胞(PBMCs)分離外周血單核細(xì)胞分離采用密度梯度離心法，利用肝素抗凝管抽取志愿者外周血15mL,以1:3比例加入RPM1-1640培養(yǎng)基并混勻，隨后再以1:1比例緩慢加至細(xì)胞分離液(FicolΙ-Paque)上。室溫下以800Xg離心30分鐘。隨后吸取白膜層即為外周血單核細(xì)胞。2.2)巨噬細(xì)胞分離及培養(yǎng)將上一步收集的外周血單核細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24h后，棄去培養(yǎng)瓶中上清液，即去除非粘附細(xì)胞，向剩余的粘附細(xì)胞中加入18ng/mL濃度的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和 20ng/mL濃度的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，培養(yǎng)5天后，得到的粘附細(xì)胞即為外周血巨噬細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀以PE標(biāo)記的CD68抗體檢測巨噬細(xì)胞純度。3)人外周血⑶8+T細(xì)胞分離及培養(yǎng)CD8+T細(xì)胞采用免疫磁珠法分離,利用Q)8+T-cell Positive Isolation Kit試劑盒，根據(jù)說明，對外周血淋巴細(xì)胞逐步分離，得到90%外周血中的CD8+T細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀以APC標(biāo)記的⑶8a抗體檢測⑶8+T細(xì)胞純度。4)人髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型。采用半透膜孔徑為0.4 μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接觸共培養(yǎng)模型，將第I步得到的髓核細(xì)胞與免疫細(xì)胞(即巨噬細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞)按1:1的體積比共
培養(yǎng)；具體操作為:以1.5X106/孔的數(shù)目將髓核細(xì)胞接種于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基；將1.5X IO6的巨噬細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞接種于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共養(yǎng)48小時后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶λ韬思?xì)胞、巨噬細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。
權(quán)利要求
1.人椎間盤髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型構(gòu)建方法，其特征在于: 1)人髓核細(xì)胞分離及培養(yǎng) 首先將髓核組織在無菌條件下分離，棄去其中的纖維環(huán)組織節(jié)軟骨板，將剩余的髓核組織在室溫下置于胰蛋白酶溶液中消化，隨后離心棄去上清液，在室溫下用II型膠原酶靜止消化后，再離心，棄去上清液，細(xì)胞用PBS液沖洗離心后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網(wǎng)濾去剩余組織，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； 再以胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37°C含CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每三天換液一次； 2)人外周血巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 2.1)外周血單核細(xì)胞(PBMCs)分離 利用肝素抗凝管抽取外周血，以1:3的體積比將抽取的外周血加入RPM1-1640培養(yǎng)基并混勻，隨后再以1:1的體積比緩慢加至細(xì)胞分離液Ficoll-Paque中，室溫下以800Xg離心30分鐘，隨后吸取白膜層即為外周血單核細(xì)胞； 2.2)巨噬細(xì)胞分離及培養(yǎng) 將外周血單核細(xì)胞接種于含胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37°C含C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后，棄去培養(yǎng)瓶中上清液，即去除非粘附細(xì)胞，向剩余的粘附細(xì)胞中加入18ng/mL濃度的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/mL濃度的巨噬細(xì)胞集落刺激因子( M-CSF)，培養(yǎng)5天后，得到的粘附細(xì)胞即為外周血巨噬細(xì)胞； 3)人外周血⑶8+T細(xì)胞分離及培養(yǎng) 利用⑶8+T-cell Positive Isolation Kit試劑盒,根據(jù)說明，對外周血淋巴細(xì)胞逐步分離，得到外周血中的CD8+T細(xì)胞； 4)人髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型 采用半透膜孔徑為0.4 μ m的Transwell inserts插入式小室建立非接觸共培養(yǎng)模型，將第I步得到的髓核細(xì)胞與免疫細(xì)胞(即巨噬細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞)按1:1的體積比共培養(yǎng)； 具體操作為:以1.5X IO6/孔的數(shù)目將髓核細(xì)胞接種于六孔板，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基；將1.5X IO6的巨噬細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞接種于Transwellinserts小室，并插入六孔板中，共養(yǎng)48小時后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶λ韬思?xì)胞、巨噬細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人椎間盤髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟I)將剩余的髓核組織先剪成I X Imm3碎塊，在室溫下置于質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化40min,隨后以1000r/min離心5min,棄去上清液,于室溫下用質(zhì)量濃度為0.025%的II型膠原酶靜止消化4h，再以1000r/min離心5min，棄去上清液，細(xì)胞再用PBS液沖洗3次，以1000r/min離心5min后以45 μ m孔徑的尼龍過濾網(wǎng)濾去剩余組織，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)； 再以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每三天換液一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人椎間盤髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型構(gòu)建方法，其特征在于:將外周血單核細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后。
全文摘要
人椎間盤髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的體外模型構(gòu)建方法，即通過建立模型研究人椎間盤免疫赦免的作用機(jī)制。本發(fā)明共培養(yǎng)模型較好模擬了體外人髓核細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用，可為體外椎間盤免疫研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)思路。發(fā)明人已在研究FasL在椎間盤免疫赦免中的作用機(jī)制研究中，采用該共培養(yǎng)模型。此研究通過上調(diào)椎間盤退變患者髓核細(xì)胞中的FasL表達(dá)量，并與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)asL在髓核細(xì)胞中的上調(diào)可有效增加免疫細(xì)胞的凋亡比例。
文檔編號C12N5/0783GK103215223SQ201310085259
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者王海強(qiáng), 劉志恒, 李新奎, 李昂, 高揚(yáng), 孫振, 陳宇飛, 張威林, 張泳照, 萬中元 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)