專利名稱：脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌性陰道炎也稱細(xì)菌性陰道病，細(xì)菌性陰道炎是陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)所致的一種混合感染，是陰道內(nèi)有大量的細(xì)菌、伴有陰道分泌物性質(zhì)改變的一組癥候群，而臨床及病理特征無(wú)炎癥改變。其大多發(fā)生在性活躍期婦女，是廣大婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病。在正常生理情況下，人體陰道內(nèi)存在各種厭氧及需氧菌，其中90%為乳桿菌。乳桿菌可將糖原分解為乳酸，而其產(chǎn)生的過(guò)氧化氫更有一定的分解作用，能抑制陰道內(nèi)其他致病性雜菌的生長(zhǎng)，幫助形成良好的陰道內(nèi)環(huán)境。因此，當(dāng)各種內(nèi)外因素導(dǎo)致陰道黏膜損傷，偏堿性的精液、不適當(dāng)沖洗陰道等破壞了陰道的酸堿平衡，使正常的乳桿菌生長(zhǎng)受抑，其他致病菌大量繁殖，引起陰道內(nèi)菌群失調(diào)，繼而引發(fā)陰道病。所以臨床上將補(bǔ)充乳酸桿菌作為治療方法之一，國(guó)外使用乳酸桿菌療法，主要用于陰道沖洗和制成栓劑置于陰道內(nèi)。脆弱擬桿菌(ifecieroiofes fragilis)作為一種革蘭氏染色陰性、桿狀、兩端鈍圓而濃染，有莢膜、無(wú)芽胞、無(wú)動(dòng)力的專性厭氧細(xì)菌，分產(chǎn)腸毒素型和非產(chǎn)腸毒素型。脆弱擬桿菌作為人及動(dòng)物腸道正常菌群的一部分，主要存于結(jié)腸中，此外，呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道粘膜也可定植生長(zhǎng)。目前研究較多的是脆弱擬桿菌作為一種條件致病菌，當(dāng)宿主粘膜受損時(shí)，可侵犯粘膜下層，引起感染，也可經(jīng)血液流動(dòng)，引起身體其它器官如腸道、腹腔、肝、肺、腦組織化膿性感染并伴發(fā)膿腫和引起急慢性腹瀉等。此外，其對(duì)結(jié)腸、直腸癌的發(fā)生也有促進(jìn)作用。然而，脆弱擬桿菌并非只是一種條件致病菌。1991年張季階發(fā)表了《一種無(wú)毒脆弱擬桿菌的分離鑒定》，報(bào)導(dǎo)了關(guān)于1983年9月從一個(gè)發(fā)育良好的嬰兒糞便中分離出量大而又較純的細(xì)菌，經(jīng)以系列的鑒定、基礎(chǔ)試驗(yàn)和臨床應(yīng)用觀察，屬于脆弱擬桿菌群中的一株無(wú)毒菌，是人體的益生菌，定名為BF839菌株。由此，研究發(fā)現(xiàn)了，脆弱擬桿菌也是一種益生菌。但是，脆弱擬桿菌作為一種益生菌，并且在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物的相關(guān)應(yīng)用，目前尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
提供脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用，所述的脆弱擬桿菌保藏單位名稱為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2013年3月12日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7280，分類命名為 Bac teroides fragiIiS0
其中，所述組合物為至少含有能治療細(xì)菌性陰道炎的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。其中，所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類食品中的任意一種。其中，所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。其中，所述組合物為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。其中，所述脆弱擬桿菌在所述組合物中的含量為KTlOiciCfu /ml。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，脆弱擬桿菌安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，對(duì)于細(xì)菌性陰道炎有很好治療效果、成本低，從而預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備治療細(xì)菌性陰道炎的食品或藥物組合物。
具體實(shí)施方式
·下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1脆弱擬桿菌CGMCC N0.7280菌液的制備 (O由嬰兒糞便中分離脆弱擬桿菌CGMCC N0.7280
按“正常菌群檢查法”稱取0.5克大便，置于先裝有4.5ml生理鹽水的試管中，以此連續(xù)稀釋成10_卜10_6，由高稀積度向低稀積度滴到Bd培養(yǎng)基平板上，置于厭氧產(chǎn)氣盒中加厭氧產(chǎn)氣袋進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。置37°C，2 7天后開(kāi)罐檢查。選取單一菌落進(jìn)行純培養(yǎng)、染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生理生化檢測(cè)。(2)脆弱擬桿菌CGMCC N0.7280的增菌培養(yǎng)及菌液制備
選取純化后的單個(gè)菌落接種于改良的胰蛋白胨肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，所得菌液離心沉淀，轉(zhuǎn)速3000r/min,離心15min,去上清,沉淀物用生理鹽水洗漆后,沉淀物用生理鹽水稀釋，用麥?zhǔn)媳葷峁茏鼍鷶?shù)測(cè)定，稀釋至IO8 cfu /ml, IO9 cfu /ml, IO10 cfu /ml，保存?zhèn)溆?。?shí)施例2脆弱擬桿菌CGMCC N0.7280毒力實(shí)驗(yàn) 采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
(O小鼠急性毒力實(shí)驗(yàn)
取體重22±2克C57BR/C小鼠(雌雄各半)60只，分成高劑量組、低劑量組和對(duì)照組，各組20只。高劑量組每只小鼠每天灌胃IO12 cfu /ml菌液0.5ml，低劑量組每天灌胃IO9 cfu/ml菌液0.5ml，對(duì)照組每天灌胃0.5ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:小鼠正常生長(zhǎng)，未見(jiàn)死亡，LD50測(cè)不出。(2)大鼠毒力實(shí)驗(yàn)
取150±20克SD大鼠30只(雌雄各半)，分為3組:高低劑量組和對(duì)照組。高劑量組每只大鼠每天灌胃1012cfu/ml菌液2ml,低劑量組每天灌胃109cfu/ml菌液2ml,對(duì)照組每天灌胃2ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天，14天后抽靜脈血測(cè)血象、肝腎功。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見(jiàn)明顯異常。(3)恒河猴毒力實(shí)驗(yàn)取恒河猴10只(雌雄各半)，分為2組:高低劑量組和對(duì)照組。高劑量組每只恒河猴每天口服1012cfu/ml菌液100ml,低劑量組每天口服109cfu/ml菌液100ml。連續(xù)觀察60天。14天、30天、45天、60天后分別抽靜脈血測(cè)血象、肝腎功，測(cè)心電圖。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見(jiàn)明顯異常。實(shí)施例3脆弱擬桿菌CGMCC N0.7280對(duì)于細(xì)菌性陰道炎的治療作用
動(dòng)物模型建立:將大腸埃希菌(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923)菌株復(fù)蘇、傳代，用無(wú)菌生理鹽水配制成濃度為1.8*109/ ml的菌液，按1:1的比例混合成感染菌液。先用無(wú)菌的PBS液(pH8.5)沖洗小鼠陰道3次(每次間隔5 min)，然后用5號(hào)頭皮針硅膠管涂無(wú)菌石蠟油，緩慢插入小鼠陰道約I cnTl.5 cm，每種細(xì)菌注入量均為0.025ml/ 100 g，l次/天。接種細(xì)菌后逐日觀察小鼠陰道病變情況，并取陰道分泌物涂片染色鏡檢。當(dāng)小鼠陰道明顯充血、紅腫并伴有大量膿性分泌物時(shí)，取分泌物涂片，鏡下可見(jiàn)大量的感染菌和壞死細(xì)胞，表明小鼠細(xì)菌性陰道病模型制備成功。除正常對(duì)照組外，其余小鼠均采用該法進(jìn)行造模，，正常對(duì)照組小鼠每天用等量無(wú)菌生理鹽水沖洗陰道I次。分組與治療:60只雌性小鼠隨機(jī)分為6組:模型組、婦炎康組、正常對(duì)照組以及高濃度脆弱擬桿菌組(高濃度組)、中濃度 脆弱擬桿菌組(中濃度組)、低濃度脆弱擬桿菌組(低濃度組)，每組10只。陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組分別用生理鹽水沖洗陰道，陽(yáng)性藥物組應(yīng)用婦炎康凝膠治療，高濃度組應(yīng)用5 *109cfu/ ml濃度的脆弱擬桿菌沖洗陰道，中濃度組應(yīng)用5*108cfu / ml濃度的脆弱擬桿菌沖洗陰道，低濃度組應(yīng)用5*107cfu / ml濃度的脆弱擬桿菌沖洗陰道。各組動(dòng)物每日陰道給藥I次，連續(xù)14天。檢測(cè)指標(biāo):
陰道菌群的測(cè)定與分析:停藥后第I天，取50 μ I的生理鹽水反復(fù)沖洗小鼠陰道8 10次，取30 μ I的陰道沖洗液10倍系列稀釋至10_7，取10 μ I滴種于相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。模型組于造模成功后第I天按上述方法對(duì)小鼠陰道內(nèi)菌群進(jìn)行檢測(cè)。陰道病變治愈程度:停藥后第I天，處死小鼠取陰道組織做病理切片
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:模型組與正常組相比乳桿菌數(shù)量顯著下降，大腸埃希菌和葡萄球菌的數(shù)量顯著上升。與陰性對(duì)照組相比，婦炎康組和脆弱擬桿菌組高、中、低三個(gè)濃度組相比，乳桿菌數(shù)量升高，大腸埃希菌和葡萄球菌的數(shù)量均有不同程度的下降。與婦炎康組相比，高濃度脆弱擬桿菌組的乳桿菌、大腸埃希菌、葡萄球菌有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脆弱擬桿菌能夠抑制大腸埃希菌及葡萄球菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)乳桿菌的生長(zhǎng)。這說(shuō)明脆弱擬桿菌對(duì)于細(xì)菌性陰道病有很好的治療效果，尤其是高濃度的脆弱擬桿菌組(10*9 cfu /ml)的治療效果最明顯。
權(quán)利要求
1.脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為至少含有能治療細(xì)菌性陰道炎的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類食品中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述脆弱 擬桿菌在所述組合物中的含量為IO8IOiciCfu /ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎組合物中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明脆弱擬桿菌安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，對(duì)于細(xì)菌性陰道炎有很好治療效果、成本低，從而預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備治療細(xì)菌性陰道炎的食品或藥物組合物。
文檔編號(hào)A23L1/30GK103156886SQ201310085658
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者智發(fā)朝, 白楊, 劉洋洋 申請(qǐng)人:廣州知光生物科技有限公司