專利名稱：轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)的肽的接合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于肽翻譯后接合的新方法，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于在肽中摻入可選擇性連接另一基團(tuán)的連接點(diǎn)。所述接合肽的特性發(fā)生了改變且因此用于治療性應(yīng)用或它們可使所述肽的分析或分離和純化更為容易。
背景技術(shù)：
通過將改變肽的性質(zhì)的基團(tuán)與肽接合而修飾肽的性質(zhì)和特性是熟知的。這種接合通常要求肽中的一些官能團(tuán)與接合基團(tuán)中的另一官能團(tuán)反應(yīng)。通常，氨基，如N-末端氨基或賴氨酸中的ε-氨基已經(jīng)與適宜的?；噭┞?lián)合使用。常常需要甚或要求能夠控制接合反應(yīng)，即控制在哪里連接接合化合物和控制連接多少接合基團(tuán)。這通常被稱作特異性。本發(fā)明的目的是提供一種可以高度特異性使肽接合的方法。一般而言，該方法利用能夠?qū)⒑m宜官能團(tuán)的化合物摻入到肽中的酶，例如，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中所述官能團(tuán)隨后被用作接合點(diǎn)。長時(shí)間以來，已經(jīng)大體知曉了肽的接合，且US4，179，337在20多年前已公開了與
聚乙二醇或聚丙二醇接合的肽。已經(jīng)公開了不同類型的化學(xué)過程，其對(duì)于在肽和與肽接合的部分之間形成鍵是有效的。ΕΡ605963公開了將與醛基團(tuán)形成肟鍵的含水聚合物移植到蛋白上。天然氨基酸均不含醛，因此在接合過程的第一步中羥基須被氧化。W096/41813公開了被用于接合反應(yīng)中的氨基-氧肟形成基團(tuán)官能化的聚合物。W098/05363公開了含肽和水溶性聚合物的化合物，其中兩者通過N-末端氨基酸殘基的肟鍵共價(jià)鍵合。此外，已知酶的使用能夠更特異性使肽接合。ΕΡ243929公開了使用蛋白酶，如羧肽酶將具有官能團(tuán)的化合物摻入到肽的C-末端中，其中所述官能團(tuán)可隨后被用作與幫助肽分析的細(xì)胞毒素基團(tuán)，其它肽或報(bào)道基團(tuán)，如熒光基團(tuán)連接的點(diǎn)。然而，該技術(shù)限制了與C-末端氨基酸殘基連接的點(diǎn)，如果C-末端殘基對(duì)于肽的活性而言很重要，則有時(shí)構(gòu)成嚴(yán)重的限制。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶先前已經(jīng)用于改變肽的性質(zhì)。在食品工業(yè)且特別是牛奶工業(yè)中，許多技術(shù)都是可利用的，例如，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶使肽交叉結(jié)合。其它文獻(xiàn)公開了使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改變生理學(xué)活性肽的性質(zhì)。ΕΡ950665、ΕΡ785276和Sato, Adv.DrugDelivery Rev.，54，487-504，2002公開了在有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在的條件下，含有至少一個(gè)Gln的肽與胺-官能化的PEG或相似配體之間的直接反應(yīng)，且Wada在Biotech.Lett.,23, 1367-1372, 2001中公開了利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶使β _乳球蛋白與脂肪酸直接接
合 ο發(fā)明概述本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)酶，如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可用于在肽中摻入一個(gè)或多個(gè)肽中不易接近的官能團(tuán)，從而形成官能化肽，且發(fā)現(xiàn)該官能化肽可隨后與另一化合物反應(yīng)，所述另一化合物含有接合部分和一個(gè)或多個(gè)能夠與摻入到肽中的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)反應(yīng)，但不與存在于肽中的其它官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)。這類方法能夠提供高度特異性，因?yàn)檗D(zhuǎn)谷氨酰胺酶可僅催化在作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物的氨基酸殘基處摻入化合物，且對(duì)官能團(tuán)進(jìn)行了選擇，使它們僅彼此反應(yīng)，而不與肽中可接近的其它官能團(tuán)反應(yīng)。以這種方式，接合部分僅在可控的部位或地方連接，且通過選擇官能團(tuán)，可控制接合基團(tuán)的數(shù)目。因此在其中一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明人提供一種使肽接合的方法，所述方法包括下列步驟i)在一個(gè)或多個(gè)步驟中，在能夠催化第一化合物摻入到所述肽中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在的條件下，使肽與含一個(gè)或多個(gè)構(gòu)成所述肽的任意氨基酸殘基中不易接近的官能團(tuán)或潛在官能團(tuán)的所述第一化合物反應(yīng)，從而形成官能化肽；和ii)任選活化所述潛在官能團(tuán)；和iii)在一個(gè)或多個(gè)步驟中，使所述官能化肽與含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的第二化合物反應(yīng)，其中所述官能團(tuán)不與構(gòu)成所述肽的氨基酸殘基中易接近的官能團(tuán)反應(yīng)，且其中所述第二化合物中的所述官能團(tuán)能夠與所述第一化合物中的所述官能團(tuán)反應(yīng)，從而在所述官能化肽與所述第二化合物之間形成共價(jià)鍵。本發(fā)明的目的是提供通過本發(fā)明方法接合的肽。本發(fā)明另一目的提供以某種方式被修飾，從而更適于本發(fā)明方法的肽。本發(fā)明另一目 的是提供適用于本發(fā)明方法中的試劑和酶。本發(fā)明另一目的提供含有通過本發(fā)明方法接合的肽的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明另一目的提供用于治療的根據(jù)本發(fā)明方法接合的肽。本發(fā)明另一目的提供用于疾病治療的治療方法，包括給予根據(jù)本發(fā)明方法制備的接合肽。本發(fā)明另一目的提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的接合肽在制備藥物中的用途。本發(fā)明另一目的提供一種通過根據(jù)本發(fā)明方法使所述肽接合而改進(jìn)肽的藥理學(xué)性質(zhì)的方法。定義在本文中，“氨基轉(zhuǎn)移”或類似說法表示谷氨酰胺側(cè)鏈中的氮與來源于另一化合物的氮，特別是來源于另一含氮親核試劑的氮交換的反應(yīng)。在本文中，術(shù)語“不易接近”表示缺少或某種意義上講事實(shí)上缺少某物，使得其不能接近。當(dāng)官能團(tuán)在待接合的肽中不易接近時(shí)，表示該肽缺少所述官能團(tuán)或，如果存在，在某些情況下，被屏敝參與反應(yīng)。作為舉例，所述官能團(tuán)可被隱藏在肽結(jié)構(gòu)中，從而被阻礙參與反應(yīng)，或它可位于肽鏈的被受限柔性阻礙官能團(tuán)參與反應(yīng)的肽區(qū)域中。應(yīng)認(rèn)識(shí)到官能團(tuán)是否易接近取決于反應(yīng)條件?？深A(yù)期在有變性劑存在的條件下或在高溫條件下，肽可伸展從而使不易接近的官能團(tuán)暴露出來。應(yīng)了解“不易接近”是指“在根據(jù)特定的目標(biāo)反應(yīng)選擇的反應(yīng)條件下不易接近”。在本文中，術(shù)語“肟鍵”表示式-C=N-O-的部分。在本文中，術(shù)語“腙鍵”表示式-C=N-N-的部分。
在本文中，術(shù)語“苯腙鍵”表示式
權(quán)利要求
1.一種使肽接合的方法，所述方法包括下列步驟 iv)在一個(gè)或多個(gè)步驟中，在能夠催化第一化合物摻入到所述肽中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在的條件下，使肽與含一個(gè)或多個(gè)構(gòu)成所述肽的任意氨基酸殘基中不易接近的官能團(tuán)或潛在官能團(tuán)的所述第一化合物反應(yīng)，從而形成官能化肽；和V)任選活化所述潛在官能團(tuán)；和 vi)在一個(gè)或多個(gè)步驟中，使所述官能化肽與含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的第二化合物反應(yīng)，其中所述官能團(tuán)不與構(gòu)成所述肽的氨基酸殘基中的易接近官能團(tuán)反應(yīng)，且其中所述第二化合物中的所述官能團(tuán)能夠與所述第一化合物中的所述官能團(tuán)反應(yīng)，從而在所述官能化肽與所述第二化合物之間形成共價(jià)鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在一個(gè)或多個(gè)步驟中，在有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在的條件下，使由下式代表的含Gln-殘基的肽
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中A代表肟、腙、苯腙、縮氨基脲、三唑或異鳴唑烷部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3任何一項(xiàng)所述的方法，其中包含在X中的官能團(tuán)或潛在官能團(tuán)選自或可被活化成酮 _、醛-、-NH-NH2、-O-C(O) -NH-NH2^-NH-C(O) -NH-NH2^-NH-C(S) -NH-NH2,-NHC (O) -NH-NH-C (O) -NH-NH2、-NH-NH-C (O) -NH-NH2、-NH-NH-C (S) -NH-NH2、-NH-C (O) -C6H4-NH-NH2、-C (O) -NH-NH2、- O-NH2、-C (O) -O-NH2、-NH-C (O) -O-NH2、-NH-C (S) -O-NH2、炔、疊氮化物或氧化腈。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任何一項(xiàng)所述的方法，其中存在于Y中的官能團(tuán)選自酮_、醛-、_NH-NH2、-O-C (O) -NH-NH2、-NH-C (O) -NH-NH2、-NH-C (S) -NH-NH2、-NHC (O) -NH-NH-C (O) -NH-NH2、-NH-NH-C (O) -NH-NH2、-NH-NH-C (S) -NH-NH2、-NH-C (O) -C6H4-NH-NH2、-C (O) -NH-NH2、- O-NH2、-C (O) -O-NH2> -NH-C (O) -O-NH2> -NH-C (S) -O-NH2、塊、疊氣化物和氧化臆。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任何一項(xiàng)所述的方法，其中X選自或可被活化成酮-或醛-衍生物，且 Y 選自-NH-NH2、-O-C (O)-NH-NH2、-NH-C (O)-NH-NH2、-NH-C(S) -NH-NH2, -NHC (O)-NH-NH-C (O) -NH-NH2、-NH-NH-C (O) -NH-NH2、-NH-NH-C (S) -NH-NH2、-NH-C (O) -C6H4-NH-NH2、-C (O) -NH-NH2、- O-NH2、-C (O) -O-NH2、-NH-C (O) -O-NH2、和-NH—C (S) -O-NH2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中包含在X中的潛在官能團(tuán)選自
8.根據(jù)權(quán)利要求2-5任何一項(xiàng)所述的方法，其中X和Y各自代表炔和三唑組成的組、或炔和氧化腈組成的組的不同成員。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-6任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述含氮親核試劑選自4-(氨甲基)苯基乙酮、4-(2-氨乙基)苯基乙酮、N- (4-乙酰基苯基)2-氨基乙酰胺、1-[4-(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮、1-[3-(2_氨基乙氧基)苯基]乙酮、1，4-雙(氨氧基)丁烷、3-氧雜戊燒_1，5-二輕基胺、1，8-二氨氧基-3，6-二氧雜辛燒、1，3-雙(氨氧基)丙-2-醇、1，11-雙(氨氧基)_3，6, 9-二氧雜十一燒、1，3-二氨基-2-丙醇、1，2-雙(氨氧基)乙燒、和1，3-雙(氨氧基)丙烷。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中Z包含一個(gè)或多個(gè)PEG或mPEG基團(tuán)及其氨基衍生物(包括直鏈和支鏈PEG和mPEG基團(tuán))；直鏈、支鏈和/或環(huán)狀C^22烷基、C2_22烯基、C2_22炔基、CV22雜烷基、C2_22雜烯基、C2_22雜炔基，其中可插入一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)芳香化合物二基團(tuán)或雜環(huán)化合物二基團(tuán)，且其中所述C1-C22或C2-C22基團(tuán)可任選被一個(gè)或多個(gè)選自羥基、齒素、羧基、雜芳基和芳基的取代基取代，其中所述芳基或雜芳基可任選進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)選自羥基、鹵素、和羧基的取代基取代；留族基團(tuán)；脂類基團(tuán)；多糖基團(tuán)；葡聚糖；聚酰胺基團(tuán)；聚氨基酸基團(tuán)；PVP基團(tuán)；PVA基團(tuán)；聚(1-3-二草脲酰胺)；聚(1，3，6_三略燒)；乙烯/馬來酸酐聚合物；Cibacron染料；或Cibacron Blue3GA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中Z包含一個(gè)或多個(gè)具有約10kDa-40kDa分子量的PEG或mPEG基團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中Z代表具有約10kDa、20kDa、40kDa或40kDa分子量的PEG或mPEG基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中Z包含一個(gè)或多個(gè)Cich2ci燒基。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中Z包含一個(gè)或多個(gè)C15烷基、C17烷基、CibacronBlue3GA或下式的基團(tuán)
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)所述的方法，其中該酶是從茂原鏈霉菌(Streptomyces mobaraenese)、利迪鏈霉菌(Streptomyces Iydics)或豚鼠肝臟中分離出來的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求2-15任何一項(xiàng)所述的方法，其中P代表選自胰島素、胰高血糖素樣-肽I (GLP-1)、胰高血糖素樣-肽2 (GLP-2)、生長激素、細(xì)胞因子、TFF、黑色素皮質(zhì)激素受體修飾物和因子VII化合物的肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求 16所述的方法，其中P代表生長激素。
全文摘要
提供使肽接合的方法，包括i)在有能夠?qū)⑺龌衔飺饺氲诫闹械霓D(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在的條件下，使肽與含官能團(tuán)的第一化合物反應(yīng)，形成氨基轉(zhuǎn)移肽，并ii)使所述氨基轉(zhuǎn)移肽與，例如，能夠與在酶反應(yīng)中摻入到肽中的官能團(tuán)反應(yīng)的官能化聚合物反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N9/96GK103215328SQ201310086499
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月21日
發(fā)明者N·L·喬安森, M·桑德爾, F·Z·多沃爾德 申請(qǐng)人:諾和諾德醫(yī)療保健公司