柔紅霉素c-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種柔紅霉素C-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法，柔紅霉素C-14羥化酶突變體的基因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸；并且通過定向進化技術,對目的基因進行隨機突變，并用高通量的篩選方法，獲得酶活力提高的C-14羥化酶酶突變體，安全性更好、生產率更高且保護環(huán)境。
【專利說明】柔紅霉素 c-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程制藥【技術領域】，特別涉及一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體 及其基因工程菌的生產方法。

【背景技術】
[0002] 蒽環(huán)類抗生素 （Anthracycl ines )是一類重要的抗腫瘤藥物，它們均由蒽環(huán)酮的發(fā) 色團通過糖苷鍵和一種或幾種不同的糖連接而成。蒽環(huán)類抗生素主要因下列結構變化的不 同而區(qū)別：蒽環(huán)上的配基不同；糖的數量、種類和排列順序不同；糖苷鍵的位置和立體化學 結構不同。大多數蒽環(huán)類的抗生素具有很強的骨髓抑制和心臟毒性而不能應用于臨床，只 有柔紅霉素-阿霉素型蒽環(huán)類抗生素成為臨床上最有應用價值的抗腫瘤藥物，包括柔紅霉 素、阿霉素、表阿霉素、洋紅霉素等。
[0003] 柔紅霉素（Daunorubicin，DNR)和阿霉素（Doxorubicin)在化學結構上的區(qū)別在 于阿霉素 C-14位為羥基，結構示意圖如說明書附圖1、附圖2所示。在臨床治療效果上，阿 霉素與柔紅霉素相比，相同劑量的療效更強，毒副作用更低，且無交叉耐藥，抗腫瘤譜比柔 紅霉素廣，具有更高的應用價值，成為目前應用最廣泛的抗腫瘤藥物之一。
[0004] 阿霉素是柔紅霉素的C-14位羥化產物，雖然很早就發(fā)現波賽鏈霉菌青灰變種能 夠產生微量的阿霉素，但是至今沒有用于工業(yè)化生產。
[0005] 目前工業(yè)上生產阿霉素主要使用化學半合成法，經過七步反應獲得阿霉素：首先 從取用微生物產生的柔紅霉素，用含溴的二氯甲烷進行氯化；為了防止C-7位糖鏈的斷裂， 加入原甲酸三乙酯；然后在l〇°C環(huán)境下進行反應；所得反應物在室溫下脫縮酮；獲得溴 化柔紅霉素，然后進行轉換反應，在酸性條件下加入甲酸鈉；接著在40°C環(huán)境下進行反應， 先形成柔紅霉素甲酯，然后逐漸水解成阿霉素，此時加入無水乙醇進行沉淀，直至獲得阿霉 素粗品；該粗品再用微晶纖維素進行精制純化，將吸附了阿霉素的纖維柱用二氯甲燒一甲 醇一水為展開劑進行分配層析，層析后的流出液在酸性條件下提取出水溶液，最后在中性 條件下，再將水溶液抽提到二氯甲烷中，經脫水和減壓濃縮步驟，最終得到阿霉素精制品， 所得的產品達到《美國藥典》（USP/NF) 21版標準物質。
[0006] 在實際生產過程中，上述流程總收率從柔紅霉素算起一般為30%左右，因此化學 合成法存在著收率偏低的缺點。并且在后提煉過程中需要消耗大量有機溶劑或使用有毒性 的鹵素，不僅造成生產成本提高，還很容易引起周邊的環(huán)境污染。
[0007] 酶法和微生物轉化法及代謝工程生物合成途徑直接發(fā)酵法，被認為是生物法制備 鹽酸阿霉素的兩種主要方法。前者實際上是一種生物體內轉化過程，在菌體發(fā)酵過程中添 加可能作為前體或底物的化合物，利用生物體內存在的相關基因及其催化體系，進行底物 或前體的利用及轉化，進而達到目標產物的生成效果；作為另外一種方法，代謝工程生物合 成途徑，是利用基因工程或分子生物學技術，通常通過改變生物體內參與反應的相關基因 及其表達產生的酶，將生物體內代謝途徑改變，達到生產所需的化學物質的目的。在上述兩 種方法中，基因編碼柔紅霉素 c-14羥化酶（DoxA)及其對應的C-14羥化酶作為催化制備阿 霉素反應的重要參與者，受到廣泛的關注。
[0008] 然而，雖然目前的現有技術的研究從幾種微生物中分離得到了 doxA基因，但基因 的功能性表達，例如：高酶活的doxA突變體的獲得、穩(wěn)定的C-14羥化酶的高效表達等，依然 處于研究的初級階段。


【發(fā)明內容】

[0009] 因此，研究酶法和微生物轉化及生物合成直接生產阿霉素的新工藝，將是技術進 步和環(huán)境友好的必由之路，不僅能夠大幅提高阿霉素的生產效率，并且較之于傳統的提煉 方法，能夠極大的保護環(huán)境。
[0010] 針對現有生產阿霉素主要使用化學半合成法，而造成生產率低下且污染環(huán)境的上 述缺陷和問題，本發(fā)明實施例的目的是提供一種安全性更好、生產率更高且保護環(huán)境的柔 紅霉素 C-14羥化酶突變體及其基因工程菌的生產方法，通過定向進化技術，對目的基因進 行隨機突變，并用高通量的篩選方法，獲得酶活力提高的C-14羥化酶酶突變體。
[0011] 為了達到上述目的，本發(fā)明實施例提供如下技術方案：
[0012] 一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的基 因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。
[0013] 一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的 DNA序列中第361-363bp的GAG突變?yōu)镚TG。
[0014] 一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的重 組表達質粒的基因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。
[0015] 本發(fā)明同時還提供一種柔紅霉素 c-14羥化酶突變體的基因工程菌，其特征在于， 所述基因工程菌是由柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的重組表達質粒轉化入宿主細胞而獲 得。
[0016] 作為上述技術方案的優(yōu)選，所述柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的基因工程菌的宿 主細胞是大腸桿菌。
[0017] 作為上述技術方案的優(yōu)選，將所述柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的DNA序列克隆入 宿主細胞，并將該宿主細胞的發(fā)酵菌體用于阿霉素的生產。
[0018] 作為上述技術方案的優(yōu)選，所述柔紅霉素 C-14羥化酶突變體、其基因工程菌、其 重組表達質粒及其編碼基因均可以應用在阿霉素、表阿霉素生產中。
[0019] 本發(fā)明同時提供一種柔紅霉素 c-14羥化酶突變體基因工程菌的生產方法，包括 以下步驟：
[0020] Q1 :菌鏈霉菌C5的C-14羥化酶基因的基因克隆方法，包括以下分步驟：
[0021] Q11:PCR 擴增：
[0022] Q111 :設計一對引物：
[0023] 5' -CTGGATCCATGGGCGGTGGGCGGTCC-3' 和
[0024] 5, -ATAAGCTTCACGGGGCCGGCTTCTCG-3,；
[0025] Q112 :以鏈霉菌C5菌體為模板，設計PCR擴增引物，進行PCR擴增，PCR體系為： 2μ1 PCR buffer，25mMol/L 的MgCl2lyl，2.5m Mol/L 的 dNTPL5yl，取 Ιμ? 上述Q111 步驟中的兩條引物，牙簽挑取少量鏈霉菌C5菌體做為模板，2個單位的Taq酶，二甲基亞砜 1 μ 1，最后用無菌水補足至2〇μ 1 ;
[0026] Q113 :在94°C環(huán)境中變性lOmin后，保持94°C環(huán)境中變性30s，然后在72°C環(huán)境中 退火30s，保持72°C環(huán)境中延伸2min ;
[0027] Q114 :上述Q13步驟共進行30次循環(huán)，隨后在72°C環(huán)境中充分延伸lOmin ;
[0028] Q12 :含doxA基因的大腸桿菌質粒構建
[0029] Q121 :，先在1%的瓊脂糖凝膠中對Q1步驟PCR擴增結束后的物質進行使用電壓 為100伏的核苷酸電泳；
[0030] Q122 :割膠后，用膠回收試劑盒回收1400bp左右的DNA片段，將所獲得的DNA片段 和載體pTrc99A用限制性內切酶BamH I和Hind III進行雙酶切；
[0031] Q123 :酶切產物再次進行電壓為100伏的核苷酸電泳，回收相應大小分別為 900bp、4100bp左右的基因片段和載體，最后將載體和片段按1:3的比例混合后，加入1個單 位的T4連接酶，16°C連接10小時以上；
[0032] Q2 :對doxA基因的隨機突變
[0033] Q21:取引物對：
[0034] 5, -AGCCTGAATCACTTCCGAATTCA-3,和
[0035] 5' -TTCATTGGACCTAATACCGATCA-3' ；
[0036] Q22 :取易錯PCR反應體系50 μ 1，包含物質為：20ng的Q1步驟完成后的含 doxA基因的大腸桿菌質粒，各30pmol的Q21步驟中的一對引物，7mMol/LMgCl2, 50mMol/ L KCl,l〇mMol/L Tris-HCl,0. 2mMol/L dGTP, 0. 2mMol/LdATP,ImMol/L dCTP,ImMol/L dTTP, 0· 05mMol/L MnCl2，和5個酶活力單位的Taq酶；
[0037] Q23 :設置PCR反應條件為：在94°C環(huán)境下變性lOmin后，再保持94°C變性30s，然 后于72°C環(huán)境下退火30s，保持72°C環(huán)境中進行延伸2min ;
[0038] Q24 :將Q23步驟重復進行30次循環(huán)，然后在72°C環(huán)境下充分延伸lOmin ;
[0039] Q25 :使用1%的瓊脂糖凝膠，進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠后，用膠回收試 劑盒回收1400bp左右的DNA目的片段；
[0040] Q26 :以Q25步驟中回收純化后的DNA片段作為引物，Q1步驟完成后的含doxA基 因的大腸桿菌質粒，作為模版，進行PCR擴增，具體如下：
[0041] Q261:取反應體系物質配比為：20ng的DNA模板，此模板為Q1步驟完成后的重組 大腸桿菌質粒；引物10 μ 1，引物為Q25步驟中回收純化后的DNA片段；2. 5mM dNTP8 μ 1，和 2個酶活力單位的K0D聚合酶；
[0042] Q262 :設置PCR反應條件為：在95°C環(huán)境中變性8min后，在保持95°C環(huán)境中變性 45s，然后在58°C環(huán)境中退火45s，隨后在68°C環(huán)境中延伸5. 5min ;
[0043] Q263 :Q262步驟共重復進行25次循環(huán)，最后在保持68°C環(huán)境中充分延伸lOmin ;
[0044] Q264:最終的PCR產物用Dpn I酶于37°C環(huán)境中，消化1小時后，經65°C環(huán)境中 lOmin處理使Dpn I酶失活，即得到超過6 X 103個克隆的突變體庫；
[0045] Q3 :突變體庫的篩選：
[0046] Q31 :突變體轉化：通過電擊方法將步驟Q2完成后構建得到的突變體轉化到感受 態(tài)細胞E. coli DH10B中；
[0047] Q32:將完成Q31步驟轉化后的感受態(tài)細胞E. coli DH10B細胞涂布于含氨芐抗生 素的LB平板上，于37°C環(huán)境中進行培養(yǎng)；所述LB平板上另外還含有蛋白胨1%、酵母提取 物0. 5%、氯化鈉 1%、瓊脂2% ;
[0048] Q33 :突變體篩選與鑒定：
[0049] Q331 :挑取LB平板上長出的菌體轉接于液體LB試管中，于37°C培養(yǎng)環(huán)境中，置于 220轉/分鐘的搖床中過夜培養(yǎng)，第二天轉接于裝量50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，3小 時后對菌體進行ImMIPTG誘導，繼續(xù)培養(yǎng)18h后，4000轉/分鐘的速率離心15分鐘后，收集 菌體；
[0050] Q332 :對收集的菌體進行柔紅霉素的轉化：2ml的0. 1M磷酸緩沖液中溶解0. 2g柔 紅霉素，加入等量的上述菌體，37°C水浴中、以200轉/分鐘的速率進行震蕩，持續(xù)30分鐘 之后，測定鹽酸表阿霉素的增加量；
[0051] Q34:從完成上述所有步驟的突變體基因工程菌庫中，篩選獲得酶活力得到提高的 突變體基因工程菌。
[0052] 本發(fā)明實施例產生的柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的DNA序列為：
[0053] atgagcggcgaggcgccgcgggtggccgtcgacccgttctcgtgtcccatgatgaccatgcagcgcaaa cccgaggtgcacgacgcattccgagaggcgggccccgtcgtcgaggtgaacgcccccgcgggcggacccgcctgggt catcaccgatgacgccctcgcccgcgaggtgctggccgatccccggttcgtgaaggaccccgatctcgcgcccaccg cctggcggggggtggacgacggtctcgacatccccgttccggagctgcgtccgttcacgctcatcgccgtggacggt gaggaccaccggcgtctgcgccgcatccacgcaccggcgttcaacccgcgccggctggccgtgcggacggatcgcat cgccgccatcgccgaccggctgctcaccgaactcgccgactcctccgaccggtcgggcgaaccggccgagctgatcg gcggcttcgcgtaccacttcccgctgttggtcatctgcgaactgctcggcgtgccggtcaccgatccggcaatggcc cgcgaggccgtcggcgtgctcaaggcactcggcctcggcggcccgcagagcgccggcggtgacggcacggaccctgc cggggacgtgccggacacgtcggcgctggagagccttctcctcgaagccgtgcacgcggcccggcggaaagacaccc ggaccatgacccgcgtgctctatgaacgcgcacaggcagagttcggctcggtctccgacgaccagctcgtctacatg atcaccggactcatcttcgccggccacgacaccaccggctcgttcctgggcttcctgcttgcggaggtcctggcggg ccgtctcgcggcggacgccgacggggacgccatctcccggttcgtggaggaggcgctgcgccaccacccgccggtgc cctacacgttgtggaggttcgctgccacggaggtggtcatccgcggtgtccggctgccccgcggagcgccggtactg gtggacatcgagggcaccaacaccgacggccgccatcacgacgccccgcacgctttccacccggaccgcccttcgag gcggcggctcaccttcggcgacgggccgcactactgcatcggggagcagctcgcccagctggaatcgcgcacgatga tcggcgtactgcgcagcaggttcccccaagcccgactggccgtgccgtacgaggagttgcggtggtgcaggaagggg gcccagacagcgcggct cactgacctgcccgtctggctgcgttga
[0054] 本發(fā)明實施例使用易錯PCR技術，以來源于柔紅霉素產生菌鏈霉菌 C5(Strept〇myCes Sp.C5)的C-14羥化酶基因作為出發(fā)基因，進行隨機突變，將隨機突變獲 得的突變基因在通用載體中進行表達，獲得突變體酶，進行酶活測定，與未突變的野生型酶 活進行比較，經過BamH I和Hind III雙酶切和DNA測序驗證，證明克隆的基因序列為完全正 確；酶活得到提高的突變體作為候選對象，進行多次平行驗證，篩選得到了一個重組蛋白熱 穩(wěn)定性提高的突變體E121V，所述突變體與野生型酶相比，相同條件下，酶活提高30%以上， 得到了顯著提高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0056] 圖1為本發(fā)明現有技術中柔紅霉素的結構示意圖；
[0057] 圖2為本發(fā)明現有技術中鹽酸阿霉素的結構示意圖；
[0058] 圖3為本發(fā)明實施例中對Q1步驟PCR擴增結束后的物質進行使用電壓為100伏 的核苷酸電泳圖。
[0059] 保藏信息
[0060] 本發(fā)明所涉及要求保護的柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其保藏信息為：
[0061] 保藏地址：中國?湖北省·武漢市武昌珞珈山武漢大學生命科學學院
[0062] 保減單位：中國典型培養(yǎng)物保減中心
[0063] 分類命名：
[0064] 天藍淡紅鏈霉菌ST-2
[0065] Streptomyces coeruleorubidus ST-2 保藏簡稱：CCTCC 保藏日期：2012. 04. 22 保藏中心編號：CCTCC N0.M2012134

【具體實施方式】
[0066] 下面將結合本發(fā)明的附圖，對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所 描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例， 本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā) 明保護的范圍。
[0067] 本發(fā)明使用易錯PCR技術，以來源于柔紅霉素產生菌鏈霉菌C5(Streptomyces sp.C5)的C-14羥化酶基因作為出發(fā)基因，進行隨機突變。鏈霉菌C5的C-14羥化酶基因的 Genebank登陸號為：U50973,由422個氨基酸組成，其編碼DNA序列包括1269bp。
[0068] 本發(fā)明將隨機突變獲得的突變基因在通用載體中進行表達，獲得突變體酶，進行 酶活測定，與未突變的野生型酶活進行比較。酶活得到提高的突變體作為候選對象，進行多 次平行驗證。
[0069] 鏈霉菌C5的野生型C-14羥化酶基因序列為：
[0070] Msgeaprvavdpfscpmmtmqrkpevhdafreagpvvevnapaggpawvitddalarevladprfvkdp dlaptawrgvddgldipvpelrpftliavdgedhrrlrrihapafnprrlaertdriaaiadrllteladssdrsge paeliggfayhfpllvicellgvpvtdpamareavgvlkalglggpqsaggdgtdpagdvpdtsalesllleavhaa rrkdtrtmtrvlyeraqaefgsvsddqlvymitglifaghdttgsflgfllaevlagrlaadadgdaisrfveealr hhppvpytlwrfaatevvirgvrlprgapvlvdiegtntdgrhhdaphafhpdrpsrrrltfgdgphycigeqlaql esrtmigvlrsrfpqarlavpyeelrwcrkgaqtarltdlpvwlr
[0071] 鏈霉菌C5的野生型C-14羥化酶基因的氨基酸序列為：
[0072] atgagcggcgaggcgccgcgggtggccgtcgacccgttctcgtgtcccatgatgaccatgcagcgcaaa cccgaggtgcacgacgcattccgagaggcgggccccgtcgtcgaggtgaacgcccccgcgggcggacccgcctgggt catcaccgatgacgccctcgcccgcgaggtgctggccgatccccggttcgtgaaggaccccgatctcgcgcccaccg cctggcggggggtggacgacggtctcgacatccccgttccggagctgcgtccgttcacgctcatcgccgtggacggt gaggaccaccggcgtctgcgccgcatccacgcaccggcgttcaacccgcgccggctggccgagcggacggatcgcat cgccgcc atcgccgaccggctgctcaccgaactcgccgactcctccgaccggtcgggcgaaccggccgagctgatc ggcggcttcgcgtaccacttcccgctgttggtcatctgcgaactgctcggcgtgccggtcaccgatccggcaatggc ccgcgaggccgtcggcgtgctcaaggcactcggcctcggcggcccgcagagcgccggcggtgacggcacggaccctg ccggggacgtgccggacacgtcggcgctggagagccttctcctcgaagccgtgcacgcggcccggcggaaagacacc cggaccatgacccgcgtgctctatgaacgcgcacaggcagagttcggctcggtctccgacgaccagctcgtctacat gatcaccggactcatcttcgccggccacgacaccaccggctcgttcctgggcttcctgcttgcggaggtcctggcgg gccgtctcgcggcggacgccgacggggacgccatctcccggttcgtggaggaggcgctgcgccaccacccgccggtg ccctacacgttgtggaggttcgctgccacggaggtggtcatccgcggtgtccggctgccccgcggagcgccggtact ggtggacatcgagggcaccaacaccgacggccgccatcacgacgccccgcacgctttccacccggaccgcccttcga ggcggcggctcaccttcggcgacgggccgcactactgcatcggggagcagctcgcccagctggaatcgcgcacgatg atcggcgtactgcgcagcaggttcccccaagcccgactggccgtgccgtacgaggagttgcggtggtgcaggaaggg ggcccagacagcgcggctcactgacctgcccgtctggctgcgttga
[0073] 實施例1
[0074] 步驟Q1 :鏈霉菌C5的C-14羥化酶基因的克隆
[0075] Q1 :鏈霉菌C5的C-14羥化酶基因的克隆方法，包括以下分步驟：
[0076] Q11:PCR 擴增：
[0077] Q111 :設計一對引物，其中劃橫線部分為引入的BamHI位點和Hindlll位點：
[0078] 5, -CTGGATCCATGGGCGGTGGGCGGTCC-3，和
[0079] 5, -ATAAGCTTCACGGGGCCGGCTTCTCG-3' ;
[0080] Q112 :以鏈霉菌C5菌體為模板，設計PCR擴增引物，進行PCR擴增，PCR體系為： 2μ 1 PCR buffer (S卩PCR反應的緩沖液，目的是提供一個最適酶催反應條件);25mMol/L的 MgCl2ly 1，2. 5m Mol/L的dNTPl. 5μ 1，取1μ 1上述Q111步驟中的兩條引物，牙簽挑取少 量鏈霉菌C5菌體做為模板，2個單位的Taq酶(上海sangon公司購買)，二甲基亞砜1 μ 1， 最后用無菌水補足至20 μ 1 ;
[0081] Q113 :在94°C環(huán)境中變性lOmin后，保持94°C環(huán)境中變性30s，然后在72°C環(huán)境中 退火30s，保持72°C環(huán)境中延伸2min ;
[0082] Q114 :上述Q13步驟共進行30次循環(huán)，隨后在72°C環(huán)境中充分延伸lOmin ;
[0083] Q12 :含doxA基因的大腸桿菌質粒構建
[0084] Q121 :，先在1%的瓊脂糖凝膠中對Q1步驟PCR擴增結束后的物質進行使用電壓 為100伏的核苷酸電泳；
[0085] Q122 :割膠后，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司生產）回收1400bp左 右的DNA片段，此步驟可參考寶生物公司（網址：www. takara. com. cn) 2005-2006產品目錄 說明書描述的方法，將所獲得的DNA片段和載體pTrc99A (Invitrogen公司生產，含有氨芐 霉素抗性基因）用限制性內切酶BamH I和Hind III進行雙酶切；
[0086] Q123 :酶切產物再次進行電壓為100伏的核苷酸電泳，回收相應大小分別為 900bp、4100bp左右的基因片段和載體，最后將載體和片段按1:3的比例混合后，加入1個單 位的T4連接酶，16°C連接10小時以上。
[0087] 實施例2
[0088] 步驟Q2 :對doxA基因的隨機突變
[0089] Q21:取引物對：
[0090] 5, -AGCCTGAATCACTTCCGAATTCA-3,和
[0091] 5' -TTCATTGGACCTAATACCGATCA-3' ；
[0092] Q22 :取易錯PCR反應體系50μ 1，包含物質為：20ng的Q1步驟完成后的含doxA 基因的大腸桿菌質粒，各30?111〇1的021步驟中的一對引物，71111〇1/11%(：12,501111〇1/11((：1， 10mMol/L Tris-HCl，（pH 值為 8.3)，0.2mMol/L dGTP，0.2mMol/L dATP，lmMol/L dCTP， ImMol/L dTTP, 0· 05mMol/L MnCl2，和 5 個酶活力單位的 Taq 酶(上海 sangon 公司）；
[0093] Q23 :設置PCR反應條件為：在94°C環(huán)境下變性10min后，再保持94°C變性30s，然 后于72°C環(huán)境下退火30s，保持72°C環(huán)境中進行延伸2min ;
[0094] Q24 :將Q23步驟重復進行30次循環(huán)，然后在72°C環(huán)境下充分延伸10min ;
[0095] Q25 :使用1%的瓊脂糖凝膠，進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠后，用膠回收 試劑盒(上海華舜生物工程有限公司）回收1400bp左右的DNA目的片段；
[0096] Q26 :以Q25步驟中回收純化后的DNA片段作為引物，Q1步驟完成后的含doxA基 因的大腸桿菌質粒，作為模版，進行PCR擴增，具體如下：
[0097] Q261:取反應體系物質配比為：20ng的DNA模板，此模板為Q1步驟完成后的重組 大腸桿菌質粒；引物10 μ 1，引物為Q25步驟中回收純化后的DNA片段；2. 5mM dNTP8 μ 1，和 2個酶活力單位的K0D聚合酶（toyobo公司）；
[0098] Q262 :設置PCR反應條件為：在95°C環(huán)境中變性8min后，在保持95°C環(huán)境中變性 45s，然后在58°C環(huán)境中退火45s，隨后在68°C環(huán)境中延伸5. 5min ;
[0099] Q263 :Q262步驟共重復進行25次循環(huán)，最后在保持68°C環(huán)境中充分延伸10min ;
[0100] Q264:最終的PCR產物用Dpn I酶于37°C環(huán)境中，消化1小時后，經65°C環(huán)境中 10min處理使Dpn I酶失活，即得到超過6X 103個克隆的突變體庫。
[0101] 實施例3
[0102] Q3 :突變體庫的篩選：
[0103] Q31 :突變體轉化：通過電擊方法將步驟2完成后構建得到的突變體轉化到感受態(tài) 細胞 E.coli DH10B 中（Invitrogen 公司）；
[0104] Q32:將完成Q31步驟轉化后的感受態(tài)細胞E. coli DH10B細胞涂布于含氨芐抗生 素的LB平板上，于37°C環(huán)境中進行培養(yǎng)；所述LB平板上另外還含有蛋白胨1%、酵母提取物 0. 5%、氯化鈉 1%、瓊脂2% ;
[0105] Q33 :突變體篩選與鑒定：
[0106] Q331 :挑取LB平板上長出的菌體轉接于液體LB試管中，于37°C培養(yǎng)環(huán)境中，置于 220轉/分鐘的搖床中過夜培養(yǎng)，第二天轉接于裝量50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，3小 時后對菌體進行ImMIPTG誘導，繼續(xù)培養(yǎng)18h后，4000轉/分鐘的速率離心15分鐘后，收集 菌體；
[0107] Q332 :對收集的菌體進行柔紅霉素的轉化實驗：2ml的0. 1M磷酸緩沖液中 (pH7. 0)溶解0. 2g柔紅霉素，加入等量的上述菌體，37°C水浴中、以200轉/分鐘的速率進 行震蕩，持續(xù)30分鐘之后，測定鹽酸表阿霉素的增加量；
[0108] Q34:從完成上述所有步驟的突變體基因工程菌庫中，篩選獲得酶活力得到提高的 突變體基因工程菌。
[0109] 通過上述方法，本發(fā)明人篩選得到了一個重組蛋白熱穩(wěn)定性提高的突變體，記為 E121V。所獲得的突變體與出發(fā)基因的區(qū)別分別為：
[0110] E12IV的第121位的氨基酸由谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸，相對應地，其編碼DNA序列中 361 - 363bp 的 GAG 變?yōu)?GTG ;
[0111] 所述突變體與野生型酶相比，相同條件下，酶活提高30%以上，得到了顯著提高， 表格2中提供了該突變體基因工程菌中酶和doxA野生型酶相比較的數據。
[0112] 對上述基因工程菌中突變體的氨基酸序列和基因序列進行測定，發(fā)現與出發(fā)基 因，即相比，有一個位置的氨基酸發(fā)生了變化，相應的編碼DNA也發(fā)生了改變，如表1所示：
[0113] 表1、獲得的突變體氨基酸序列和基因序列變化結果
[0114]

【權利要求】
1. 一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的基因 編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。
2. 根據權利要求1所述的一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的DNA序列中第361-363bp的GAG突變?yōu)镚TG。
3. 根據權利要求1所述的一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征在于，柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的重組表達質粒的基因編碼的C-14羥化酶序列中，第121位的谷氨酸突 變?yōu)槔i氨酸。
4. 一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是由 柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的重組表達質粒轉化入宿主細胞而獲得。
5. 根據權利要求4所述的一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的基因工程菌，其特征在 于，所述柔紅霉素 C-14羥化酶突變體的基因工程菌的宿主細胞是大腸桿菌。
6. 根據權利要求1所述的一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征在于，將所述柔紅 霉素 C-14羥化酶突變體的DNA序列克隆入宿主細胞，并將該宿主細胞的發(fā)酵菌體用于阿霉 素的生產。
7. 根據權利要求1、2、3、4、5或6任一所述的一種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體，其特征 在于，所述柔紅霉素 C-14羥化酶突變體、其基因工程菌、其重組表達質粒及其編碼基因均 可以應用在阿霉素、表阿霉素生產中。
8. -種柔紅霉素 C-14羥化酶突變體基因工程菌的生產方法，包括以下步驟： Q1 :菌鏈霉菌C5的C-14羥化酶基因的基因克隆方法，包括以下分步驟： Qll :PCR 擴增： Q111 :設計一對引物： 5' -CTGGATCCATGGGCGGTGGGCGGTCC-3' 和 5' -ATAAGCTTCACGGGGCCGGCTTCTCG-3' ； Q112 :以鏈霉菌C5菌體為模板，設計PCR擴增引物，進行PCR擴增，PCR體系為：2 μ 1 PCR buffer，25mMol/L 的 MgCl2l μ 1，2. 5m Mol/L 的 dNTPl. 5μ 1，取 1 μ 1 上述 Q111 步驟中 的兩條引物，牙簽挑取少量鏈霉菌C5菌體做為模板，2個單位的Taq酶，二甲基亞砜1 μ 1， 最后用無菌水補足至20 μ 1 ; Q113 :在94°C環(huán)境中變性lOmin后，保持94°C環(huán)境中變性30s，然后在72°C環(huán)境中退火 30s，保持72°C環(huán)境中延伸2min ; Q114 :上述Q13步驟共進行30次循環(huán)，隨后在72°C環(huán)境中充分延伸lOmin ; Q12 :含doxA基因的大腸桿菌質粒構建： Q121 :，先在1%的瓊脂糖凝膠中對Q1步驟PCR擴增結束后的物質進行使用電壓為100 伏的核苷酸電泳； Q122 :割膠后，用膠回收試劑盒回收1400bp左右的DNA片段，將所獲得的DNA片段和載 體pTrc99A用限制性內切酶BamH I和Hind III進行雙酶切； Q123 :酶切產物再次進行電壓為100伏的核苷酸電泳，回收相應大小分別為900bp、 4100bp左右的基因片段和載體，最后將載體和片段按1:3的比例混合后，加入1個單位的 T4連接酶，16°C連接10小時以上； Q2 :對doxA基因的隨機突變 Q21 :取引物對： 5' -AGCCTGAATCACTTCCGAATTCA-3' 和 5' -TTCATTGGACCTAATACCGATCA-3' ； Q22 :取易錯PCR反應體系50μ 1，包含物質為：20ng的Q1步驟完成后的含doxA基因的 大腸桿菌質粒，各30pmol的Q21步驟中的一對引物，7mMol/LMgCl2,50mMol/L KC1，lOmMol/ L Tris-HCl,0. 2mMol/L dGTP, 0. 2mMol/LdATP,ImMol/L dCTP,ImMol/L dTTP, 0. 05mMol/L MnCl2，和5個酶活力單位的Taq酶； Q23 :設置PCR反應條件為：在94°C環(huán)境下變性lOmin后，再保持94°C變性30s，然后于 72°C環(huán)境下退火30s，保持72°C環(huán)境中進行延伸2min ; Q24 :將Q23步驟重復進行30次循環(huán)，然后在72°C環(huán)境下充分延伸lOmin ; Q25 :使用1%的瓊脂糖凝膠，進行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠后，用膠回收試劑盒 回收1400bp左右的DNA目的片段； Q26 :以Q25步驟中回收純化后的DNA片段作為引物，Q1步驟完成后的含doxA基因的 大腸桿菌質粒，作為模版，進行PCR擴增，具體如下： Q261:取反應體系物質配比為：20ng的DNA模板，此模板為Q1步驟完成后的重組大腸 桿菌質粒；引物10 μ 1，引物為Q25步驟中回收純化后的DNA片段；2. 5mM dNTP8 μ 1，和2個 酶活力單位的K0D聚合酶； Q262 :設置PCR反應條件為：在95°C環(huán)境中變性8min后，在保持95°C環(huán)境中變性45s， 然后在58°C環(huán)境中退火45s，隨后在68°C環(huán)境中延伸5. 5min ; Q263 :Q262步驟共重復進行25次循環(huán)，最后在保持68°C環(huán)境中充分延伸lOmin ; Q264 :最終的PCR產物用Dpn I酶于37°C環(huán)境中，消化1小時后，經65°C環(huán)境中l(wèi)Omin 處理使Dpn I酶失活，即得到超過6X103個克隆的突變體庫； Q3 :突變體庫的篩選： Q31 :突變體轉化：通過電擊方法將步驟Q2完成后構建得到的突變體轉化到感受態(tài)細 胞 E.coli DH10B 中； Q32 :將完成Q31步驟轉化后的感受態(tài)細胞E. coli DH10B細胞涂布于含氨芐抗生素 的LB平板上，于37°C環(huán)境中進行培養(yǎng)；所述LB平板上另外還含有蛋白胨1%、酵母提取物 0. 5%、氯化鈉1%、瓊脂2% ; Q33 :突變體篩選與鑒定： Q331 :挑取LB平板上長出的菌體轉接于液體LB試管中，于37°C培養(yǎng)環(huán)境中，置于220 轉/分鐘的搖床中過夜培養(yǎng)，第二天轉接于裝量50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，3小時后 對菌體進行ImMIPTG誘導，繼續(xù)培養(yǎng)18h后，4000轉/分鐘的速率離心15分鐘后，收集菌 體； Q332 :對收集的菌體進行柔紅霉素的轉化：2ml的0. 1M磷酸緩沖液中溶解0. 2g柔紅霉 素，加入等量的上述菌體，37°C水浴中、以200轉/分鐘的速率進行震蕩，持續(xù)30分鐘之后， 測定鹽酸表阿霉素的增加量； Q34 :從完成上述所有步驟的突變體基因工程菌庫中，篩選獲得酶活力得到提高的突變 體基因工程菌。
【文檔編號】C12R1/19GK104059892SQ201310086638
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權日:2013年3月18日
【發(fā)明者】余宏, 徐超波, 王波, 陳歡斌, 張道生 申請人:江蘇禾昌生物科技有限公司