專利名稱：一種花生種胚特異性啟動子及其克隆和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學領域，特別是植物轉基因技術領域，具體涉及了一個新的花生基因的特異性啟動子的克隆。
背景技術：
種子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，人類糧食的80%直接取自植物的種子，稻、麥等種子中富含淀粉，是人類賴以生存的主糧；大豆、花生、油菜、芝麻等種子的含油量高，是食用油的主要來源。種子中儲存物質(zhì)的多少，直接影響作物的產(chǎn)量。因此，提高糧食作物和油料作物產(chǎn)量的根本在于提高其種子中儲藏物質(zhì)的積累量。盡管常規(guī)育種技術所培育的優(yōu)良作物品種，為解決世界糧食安全問題做出了重大貢獻。然而，近20年來許多作物產(chǎn)量呈現(xiàn)徘徊局面，新育成品種在產(chǎn)量潛力上沒有大的突破，常規(guī)育種技術在繼續(xù)提高作物產(chǎn)量方面的潛力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用轉基因技術提高花生等作物產(chǎn)量及種子的含油量具有巨大的應用價值。被子植物胚胎發(fā)育主要經(jīng)歷了 3個相互交錯的階段:第一階段為組織分化期，單細胞的受精卵經(jīng)過多次分裂，并分化形成胚性組織和器官(即幼胚，從球形胚到心形胚期);第二階段為細胞伸長期(胚發(fā)育到魚雷胚期)，此時細胞分裂基本停止，以細胞膨大伸長和儲藏物質(zhì)積累為主要特征；第三階段是成熟脫水期，種子開始脫水標志著胚胎發(fā)育成熟，種子經(jīng)過脫水后代謝活動下降直至靜止。對擬南芥種子發(fā)育表達譜研究的結果發(fā)現(xiàn)，大約289個種子特異性表達基因參與了胚胎發(fā)育，其中發(fā)現(xiàn)48個在不同發(fā)育階段表達和定位在種子不同區(qū)域的轉錄因子基因對種子發(fā)育和儲藏物質(zhì)積累起重要的調(diào)控作用。對這些基因進行功能解析和表達調(diào)控研究具有重要意義?；ㄉ鳛橹匾挠土献魑?，不僅在國內(nèi)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中具有重要地位，而且在世界貿(mào)易中也具有舉足輕重的作用。研究表明，不同植物種子儲藏油脂的含量存在很大差異如主要油料作物油菜為2 8%-48%、大豆15%-22%、花生44%_54%、芝麻45%_57%，并且其主要脂肪酸組成也不同，油菜油中含有大量的芥酸(31-55%)，其他含量較高的不飽和脂肪酸為油酸14-19%、亞油酸12-24%和亞麻酸1-10%;大豆油中含量最高的為亞油酸52-65%和油酸25-36%，并且棕櫚酸(6-8%)、硬脂酸(3-5%)和亞麻酸(2_3%)也占有較大比例；花生種子脂肪酸組成主要是:棕櫚酸，油酸和亞油酸，分別占總脂肪酸含量的10%、36-67%和15-43%，是除橄欖油外單不飽和脂肪酸油酸含量最高的。研究調(diào)控花生種子發(fā)育和儲藏物質(zhì)積累相關基因的表達對于通過基因工程改良其他作物具有一定指導意義。目前在植物基因工程研究中，大多采用的是組成型啟動子，如CaMV35S啟動子、玉米Ubiquitin啟動子等，這些啟動子能夠驅動外源基因在植物的所有組織和器官中高效表達，造成能量浪費，有些外源基因的表達還影響了植物的正常發(fā)育。為在確保植物正常生長的情況下，對目標性狀進行轉基因遺傳改良，調(diào)控基因在一定發(fā)育時期和特定組織中表達非常重要。因此，尋找時空特異性表達啟動子十分重要，也具有重要應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，本發(fā)明克隆獲得了一個新的花生LECl基因的啟動子，該啟動子于種子特定發(fā)育階段驅動基因在種胚或胚乳中特異表達。本發(fā)明構建了該啟動子及6個其5'端系列缺失的啟動子驅動的GUS報告基因的植物表達載體，并轉化擬南芥。實驗表明，包括5'端非翻譯區(qū)和其上游2228bp啟動子驅動的GUS基因特異地在發(fā)育早期的種胚中表達；而缺失5'端975bp-2009bp的1254bp、935bp、721bp、617bp啟動子驅動的⑶S基因在根、莖、葉、花和發(fā)育早期的種子中均有表達，表明_2228bp至-1255bp區(qū)段不僅含有種子特異性表達的正調(diào)控元件，還包括抑制在其他組織中表達的負調(diào)控元件。缺失5,端1875bp的354bp啟動子驅動的⑶S基因在葉和發(fā)育早期的種胚中表達，在根中有少量表達，而在莖和花中沒有表達。進一步缺失5'端2124bp的105bp啟動子驅動的GUS基因僅在葉緣處表達，其余組織和器官都未檢測到表達。因此，這一啟動子的克隆和缺失分析對于研究植物種子發(fā)育和儲藏物質(zhì)積累，提高種子中儲藏物質(zhì)如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理論意義和實際應用價值。該啟動子能驅動GUS基因在種子發(fā)育早期的種胚中特異表達。營養(yǎng)生長期的根、莖、葉中和進入生殖生長期的花中不表達。其基因序列如Seq ID No:4所示。該啟動子是在已得到的花生AhLEClA基因的基因組序列(該基因其序列為:如SeqID No:2所示)的基礎上，通過染色體步移技術得到的2739bp AhLEClA基因5'端上游序列，如Seq ID No:1所示。經(jīng)轉錄起始位點分析發(fā)現(xiàn)，AhLEClA基因轉錄起始位點位于翻譯起始密碼ATG上游-82nt處，故2739bp5 '端上游序列中包含該基因2625bp的啟動子區(qū)，該區(qū)域的序列如Seq ID No: 3所示。通過PlanCARE和PLACE軟件對該啟動子進行順式調(diào)控元件分析，有2個胚乳特異性調(diào)控元件SKn-1 motif (GTCAT),分別處于-83 _87bp和-479 -483bp處；在-448 _454bp和-1603 _1609bp處分別有一個胚或胚乳特異性作用元件 CANBANAPA(CNAACAC);在-1244 -1253bp、_2078 一2087bp 和-2271 _2280bp處分別有一個種子特異性表 達轉錄因子基因AGL15結合位點CARGCW8GAT (CffffffffffffffffG);此夕卜，還有四個胚特異性的ABA作用相關的DPBFC0RED⑶C3元件(ACACNNG)分布在-116 -12Obp,-450 -456bp、-1326 _1332bp 和-1329 _1335bp 處。獲得的 2625bp 啟動子序列中還包括大量在葉肉細胞、根和花中特異表達的元件CACTFTPPCA1 (YACT)、R00TM0TIFTAP0X1(ATATT)和P0LLEN1LELAT52 (AGAAA),同時包含13個轉錄的負調(diào)控元件WB0XATNPR1(TTGA0.WRKY710S (TGAC)。這些負調(diào)控元件中5個位于啟動子-1255 -2228bp區(qū)段(分別位于-1613 -1616bp、-1649 _1652bp、_1953 _1956bp、_2144 _2147bp、_2156 -2159bp)，-2228 -2625bp還集中分布了 4個WRKY710S元件(-2275 _2278bp、_2281 -2284bp、-2445 -2448bp、-2472 _2475bp )，-1 -1254bp 區(qū)段僅含有 4 個 WRKY7IOS 元件(位于-82 -85bp、-97 -1OObp、-478 -48Ibp和-870 _873bp)。因此，該啟動子驅動的⑶S基因在種胚中特異表達受種子特異性表達調(diào)控元件和抑制在其他組織中表達的負調(diào)控元件的共同調(diào)控。存在的種子特異性表達調(diào)控元件和轉錄負調(diào)控元件的位置如說明書附圖2所
/Jn o為了完成該啟動子的初步功能分析，本發(fā)明以PCAMBIA3301為出發(fā)載體構建了含有AhLEClA基因不同長度啟動子片段的GUS基因植物表達載體，即用AhLEClA基因不同長度啟動子片段取代PCAMBIA3301中驅動⑶S基因表達的35S啟動子，獲得的植物表達載體轉化農(nóng)桿菌后，用花序浸染法轉化擬南芥，即待擬南芥繁殖開花時，配制浸染液，用農(nóng)桿菌浸染將要開放的花序。本發(fā)明分別取營養(yǎng)生長期的轉基因擬南芥幼苗的根、莖和葉以及繁殖期的轉基因擬南芥的花、授粉后10天和20天的種子，通過現(xiàn)有的方法檢測GUS基因的表達情況。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的啟動子區(qū)域中，2228bp的啟動子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可驅動的⑶S基因僅在授粉后10天的種胚中表達，在營養(yǎng)生長期的根、莖、葉和生殖期的花中均不表達，在授粉20天的種子中也沒檢測到GUS基因的表達。由此可見，本發(fā)明克隆的花生AhLEClA基因的啟動子具有早期發(fā)育種胚表達特異性，即表達的時空特異性。通過上述實驗，發(fā)明人證實了，在本發(fā)明提供的2625bp的啟動子區(qū)內(nèi)缺失了 5'端396bp片段的2228bp具有早期發(fā)育種胚表達特異性，通過克隆出的2228bp特異性啟動子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可在早期發(fā)育的胚中特異表達，同時利用這種特異性表達在早期發(fā)育胚中特異表達，可以應用在提高種子儲藏物質(zhì)含量中；構建該啟動子和相關基因的表達載 體，調(diào)控淀粉、油脂或蛋白合成相關基因的表達，可能會影響花生及其它作物的產(chǎn)量；該啟動子是一個時空特異性表達的啟動子，因此，該啟動子的克隆對植物轉基因技術領域啟動子的研究也具有重要意義。


圖1:擴增的花生AhLEClA基因2739bp5,端上游序列擴增的電泳圖，圖中M為Trans5K DNA Marker, LD、LE、LP和LS為不同基因組文庫擴增結果，LP泳道箭頭所指為擴增的目的啟動子片段；由圖中結合實施例可知，擴增得到的序列為2739bp，包括2625bp的啟動子序列、82bp 非編碼區(qū)序列和32bp包括擴增引物序列在內(nèi)的ORF區(qū)序列；圖2:花生AhLEClA基因啟動子區(qū)域可能的順式作用元件；圖3:花生AhLEClA基因啟動子序列與⑶S基因的融合表達載體的構建流程圖；圖4:PCR檢測具不同長度啟動子驅動的GUS基因表達結構部分轉基因擬南芥；圖中編號36為啟動子大小105bp，37為354bp，38為617bp，39為721bp，40為935bp，41為1254bp，42為2228bp ;M均為DL2000DNA Marker，其條帶分子量大小自上而下分別為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ；圖5:本發(fā)明所提供的2228bp啟動子驅動的GUS基因表達結構轉基因擬南芥種子⑶S活性組織化學檢測圖；由圖可見授粉后10天的種子(上面8個)在胚胎發(fā)育的位置染為藍色(箭頭所示)，而授粉后20天的種子(下面8個)在任何部位均未檢測到GUS染色； 圖6為圖5的彩色示意圖；圖7:本發(fā)明所提供的2228bp啟動子驅動的GUS基因表達結構轉基因擬南芥根、莖、葉和花⑶S活性組織化學檢測圖；圖中42-9為轉入2228bp啟動子的基因株系號，CK-P為轉基因陽性對照，CK-N為未轉基因陰性對照；由圖可見，無論根、莖、葉還是花僅有CK-P檢測到⑶S染色，42-9株系和CK-N不同材料的所有樣品均未檢測到藍色染色信號；
圖8為圖7的彩色示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明的實施步驟是根據(jù)花生AhLEClA基因的基因組DNA序列用染色體步移的方法克隆得到該基因的啟動子序列一啟動子順式作用元件分析及功能預測一涉及帶有酶切位點Hind III和Nco I的引物從啟動子DNA上擴增得到不同長度的目的啟動子序列一用同樣的酶Hind III和Nco I酶切載體pCAMBIA3301 —目的片段連接到酶切的pCAMBIA3301載體上一含植物表達載體的農(nóng)桿菌轉化擬南芥一轉基因擬南芥鑒定和篩選純合體轉基因株系一GUS組織化學染色檢測GUS表達部位及強度，分析啟動子功能。本實施例中的其他技術均采用已有技術。實施例1花生AhLEClA基因啟動子的克隆1.1花生基因組DNA的提取用植物DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品)提供的方法提取花生幼葉的DNA，溶解于適量TE (pH8.0)緩沖液中。1.2花生AhLEClA基因啟動子的克隆分別取2.g花生基因組DNA經(jīng)Dral、EcoRV、PvuI1、StuI內(nèi)切酶酶切、苯酚抽提純化后，溶解于20iU TE(pH7.5)緩沖液中。分別取4 ill酶切完全的DNA，按照BDGenome Walker Universal Kit 的要求連接上 Adaptor (序列:5' GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如 Seq ID No: 5 所示)，構建 4 個花生基因組 DNA 文庫(LD、LE、LP、LS)。根據(jù)已獲得的花生AhLEClA基因的基因組序列，設計該基因的2個嵌套的 3'端特異性引物 LEC1AGSP1-3 (5' `TGGGGATGGATAGAGAAACCAACGAGA 3'，如 Seq IDNo:6 所示)和 LEC1AGSP2-2 (5' TGATAACCGTGAAAGCCTCCTCCAGT 3'，如 Seq ID No:7 所示)。以 APl (5'端接頭引物:5' GTAATACGACTCACTATAGGGC3 '，如 Seq ID No:8 所示)和LEC1AGSP1-3為引物進行第一輪擴增，擴增體系為25iU，模板量為1^1，擴增條件為:940C 25sec，72°C 3min，7 個循環(huán)；94°C 25sec，67°C 3min，32 個循環(huán)；最后 67°C繼續(xù)延伸7min。第二輪巢式PCR模板為I ill第一輪PCR產(chǎn)物10倍稀釋液，引物為5'端巢式接頭引物 AP2 (5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3'如 Seq ID No:9 所示)和 LEC1AGSP2-2，擴增體系與第一輪 PCR 相同，擴增條件 94°C 25sec，72°C 3min，5 個循環(huán)；94°C 25sec，67°C 3min，20 個循環(huán)；最后67 °C繼續(xù)延伸7min。1%瓊脂糖電泳檢測PCR結果。挖取并回收第二輪PCR特異性擴增產(chǎn)物，克隆到PEASY-T3載體中，白色重組克隆經(jīng)EcoRI酶切檢測，片段大小符合要求的克隆用ABI3730測序儀進行雙向測序。1.3RNA提取和轉錄起始位點確定用CTAB法提取不同發(fā)育時期種子的總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測RNA質(zhì)量和分光光度計定量后，等量混合儲存于_80°C冰箱備用。為防止RNA酶污染，研缽、研錘、藥匙均以180°C烘烤6h，所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡，于室溫下過夜后，高溫滅菌處理。用Invitrogen公司GeneRacer Kit提供的方法和試劑，取5 ii g混合好的LH14種子總RNA，按照說明書要求用堿性磷酸酶(CIP)將截斷的mRNA或其他非mRNA5'端去磷酸化，然后將抽提純化并沉淀的全長mRNA脫去帽子結構，并連接上RNA接頭(GeneRacerRNA Oligo:5, CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA 3,，如 Seq ID No:10所示)；以此RNA為模板，用試劑盒提供的隨機引物和SurperScript III RT酶反轉錄合成cDNA ;最終將合成的cDNA克隆至載體pCR4_T0P0中，獲得LH14不同發(fā)育時期種子全長cDNA文庫，用于隨后轉錄起始位點擴增。根據(jù)已獲得的花生AhLEClA基因的cDNA序列，設計2個該基因的3'端特異性引物，引物序列為:TSS GSP1-15' TCTTTTGCGTCGTCGGAGATTTTAGC3'，如Seq ID No: 11所示，TSS GSP2與LEC1AGSP2-2相同。以構建的cDNA文庫為模板，分別以 TSS GSPl-1 引物與 GeneRacer 5' Primer (5' CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3'，如Seq ID No: 12所示)進行第一輪PCR擴增，PCR體系參照BD Advantage 〗PCR Kit要求，擴增條件為:94°C預變性 2min ;94°C 30 sec, 72°C 30sec，5 個循環(huán)；94°C 30 sec, 70°C 30sec,5個循環(huán)；94°C 30 sec, 63°C 30sec,68°C 30sec，20-25個循環(huán)；最后 68°C繼續(xù)延伸 lOmin。第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，用緩沖液稀釋50倍，用于第二輪巢式PCR。取I Ul第一輪PCR產(chǎn)物，以 TSS GSP2 和 GeneRacerisV Nested PrimerC 5' GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA3'，如Seq ID No: 13所示)進行第二輪PCR，擴增條件為:94°C預變性2min ;94°C 30 sec,65°C 30 sec, 68°C 10 sec，35個循環(huán)；最后68°C繼續(xù)延伸lOmin。1.5%瓊脂糖電泳檢測PCR結果。挖取并回收第二輪PCR特異性擴增產(chǎn)物，克隆到PEASY-T3載體中，白色重組克隆經(jīng)EcoRI酶切檢測，片段大小符合要求的克隆用ABI3730測序儀進行雙向測序。1.4啟動子序列分析應用在線植物轉錄元件分析工具PLACEChttp: //www.dna.affrc.g0.1o/PLACE/)、PlantCARE (http://bioinformatics, psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對花生AhLEClB啟動子序列進行分析。1.5不同長度花生AhLEClA基因啟動子片段的擴增設計克隆不同長度AhLEClA基因啟動子所需的引物，引物Pl為3'端下游引物位于5' UTR區(qū)，序列如Seq ID No: 14所示；引物P2-P8為Y端上游引物，序列如Seq IDNo: 15-21所示。引物Pl中下劃線部分CCATGG為Nco I酶切位點，其余部分為5' UTR序列；引物P2-P8中下劃線部分AAGCTT為Hind III酶切位點，其余部分為啟動子序列。利用引物Pl分別和P2-P8，以已克隆的含有AhLEClA基因2265bp啟動子的重組質(zhì)粒為模板，擴增不同長度的啟動子片段，擴增片段長度分別為2228bp、1254bp、935bp、721bp、617bp、354bp和 105bp。PCR 擴增體系為 20 ii 1:包括 10XPCR buffer 2u l，dNTP mixure(各 2.5mM)l y 1，上、下游引物各Iu 1，模板DNAliil，Taq酶0.25iU，加ddH20補足20iU。反應程序為:預變性 94°C 2min;變性 94°C 30 sec，退火 55°C 30 sec，延伸 72°C 30 sec_2min (根據(jù)擴增片段長度調(diào)整)，30個循環(huán)；最后72°C繼續(xù)延伸lOmin。擴增結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小正確，回收目的片段，并測序驗證序列正確。表1.AhLEClA基因啟動子缺失分析引物
權利要求
1.一種花生LECl基因特異性啟動子，其特征在于:其基因序列如Seq ID No:4所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的特異性啟動子，其特征在于:該啟動子能驅動GUS基因在植物發(fā)育早期的種胚中特異表達。
3.根據(jù)權利要求1所述的特異性啟動子，其特征在于:該啟動子還包括含有如SeqIDNo:4所不基因序列的其他序列。
4.如權利要求所述花生LECl基因特異性啟動子，在研究植物種子發(fā)育和儲藏物質(zhì)積累上的應用。
5.如權利要求所述花生LECl基因特異性啟動子，在提高種子中儲藏物質(zhì)和作物產(chǎn)量上的應 用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，克隆獲得了一個新的花生LEC1基因的啟動子，其基因序列如SeqIDNo:4所示，該啟動子于種子特定發(fā)育階段驅動基因在種胚或胚乳中特異表達。本發(fā)明構建了該啟動子及6個其5′端系列缺失的啟動子驅動的GUS報告基因的植物表達載體，并轉化擬南芥。最終證實包括5′端非翻譯區(qū)和其上游啟動子驅動的GUS基因特異地在發(fā)育早期的種胚中表達，這一啟動子的克隆和缺失分析對于研究植物種子發(fā)育和儲藏物質(zhì)積累，提高種子中儲藏物質(zhì)如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理論意義和實際應用價值。
文檔編號C12N15/82GK103205427SQ20131008808
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權日2013年3月19日
發(fā)明者單雷, 唐桂英, 徐平麗, 柳展基, 陳營 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院高新技術研究中心, 單雷