專利名稱：多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程、病毒學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD),是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的以侵害偶蹄動(dòng)物為主的急性、熱性、高度接觸性人畜共患傳染病，在國(guó)際上受到高度重視。該病毒屬于小RNA病毒科FMDV屬，有O型，A型，C型，SAT I型，SAT II型，SATIII型及Asia I型等7個(gè)血清型，70多個(gè)亞型，各型之間無(wú)交叉反應(yīng)。流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)感染證明，有100多種動(dòng)物可以感染?？谔阋咭驯皇澜鐒?dòng)物衛(wèi)生組織(world organization of animal health, 0ΙΕ)列為 A 類動(dòng)物傳染病之首。( 一 ) 口蹄疫的發(fā)生和危害:口蹄疫的發(fā)生早在五六百年前就已經(jīng)有記載，在14-15世紀(jì)就有類似口蹄疫的牛病的描述。最早對(duì)于口蹄疫發(fā)生和流行的描述，應(yīng)追溯到1546年,意大利學(xué)者GirolamoFracastor較為詳細(xì)地記錄了 1514年在意大利Friul1、Venice、Verona等地先后暴發(fā)口蹄疫的情況。自意大利發(fā)生口蹄疫以來(lái)，口蹄疫在歐洲大陸流行了幾百年，17-18世紀(jì)，口蹄疫在法國(guó)、意大利、德國(guó) 、瑞士、奧地利等國(guó)經(jīng)常大規(guī)模流行。英國(guó)也在1839年發(fā)生了口蹄疫。此后歐洲在1845-1894年之間均有口蹄疫的廣泛流行。1991年保加利亞發(fā)生了一次規(guī)模較大的疫情。2001年口蹄疫在英國(guó)流行，同年9月歐洲各國(guó)聲稱口蹄疫在歐洲已經(jīng)被消滅，然而在2007年8月英國(guó)由于實(shí)驗(yàn)室管道泄漏，再次出現(xiàn)口蹄疫。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(foodand agriculture organization of the UnitedNation, FA0)和OIE發(fā)表的家畜衛(wèi)生年鑒統(tǒng)計(jì)資料，1951-1953年亞洲每年都曾發(fā)生口蹄疫的大流行，1959年亞洲有16個(gè)國(guó)家或地區(qū)發(fā)生口蹄疫，1977年有13個(gè)，1979年多達(dá)30個(gè)，1982-1983年有27個(gè)，1984年有16個(gè)，1985年有10個(gè)，1987年又上升為22個(gè)，1989年仍有17個(gè)國(guó)家或地區(qū)流行口蹄疫。到了 90年代后，亞洲口蹄疫疫情更為嚴(yán)峻。最嚴(yán)重的是1997年和2000年中國(guó)臺(tái)灣和日本、韓國(guó)暴發(fā)大規(guī)?？谔阋?，損失嚴(yán)重。中北美國(guó)家是世界上最早消滅口蹄疫的國(guó)家和地區(qū)，美國(guó)于1929年、加拿大于1952年、墨西哥于1954年宣布消滅口蹄疫。此前美國(guó)歷史上口蹄疫曾發(fā)生了 9次，墨西哥在1926年和1946年曾2次暴發(fā)口蹄疫，經(jīng)過(guò)采取許多周密而有效的措施撲滅了疫情。南美國(guó)家口蹄疫的疫情較為嚴(yán)重，多年來(lái)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。不過(guò)經(jīng)過(guò)南美各國(guó)在防制方面的努力，1981年智利宣布為無(wú)口蹄疫國(guó)家；到90年代，OIE曾將烏拉圭、阿根廷、巴拉圭、巴西劃為“疫苗免疫的無(wú)口蹄疫國(guó)家或地區(qū)”。幾年之后，口蹄疫又入侵阿根廷南部地區(qū)，只有智利一直保持著無(wú)口蹄疫國(guó)家的地位?？谔阋叩陌l(fā)生和流行對(duì)當(dāng)?shù)氐陌l(fā)展有著巨大的危害，以我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)1997年3月的疫情為例。這場(chǎng)口蹄疫風(fēng)暴前后歷時(shí)3個(gè)多月，共波及6147個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)，1011674頭豬發(fā)病，184231頭豬死亡，撲殺了 600萬(wàn)頭豬，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)15.52億美元，相關(guān)行業(yè)的間接經(jīng)濟(jì)損失為62.08億美元，國(guó)民經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值損失達(dá)104.76億美元。( 二)RNAi技術(shù)在抗病毒上的應(yīng)用:由于病毒的入侵，很有可能造成宿主細(xì)胞的復(fù)制、代謝及其它正常生理功能受到影響，甚至使宿主細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致宿主的發(fā)病乃至死亡。目前抵抗和消除病毒感染給宿主帶來(lái)的不良后果，主要依賴于抗病毒的藥物和干擾素，然而病毒為了生存會(huì)在進(jìn)化中不斷形成新的耐藥性，而且某些藥物和干擾素對(duì)動(dòng)物機(jī)體會(huì)產(chǎn)生很大的副作用。RNAi能阻斷病毒感染途徑，或抑制其作用過(guò)程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)，是對(duì)抗病毒感染最有效的方式。因此，RNAi的出現(xiàn)給抗病毒研究提供了新思路，為病毒病治療帶來(lái)了新希望。然而，科學(xué)家們至今已針對(duì)FMDV不同基因在細(xì)胞和動(dòng)物等不同水平對(duì)RNAi抗FMDV效果進(jìn)行了研究和探索。據(jù)報(bào)道，在長(zhǎng)期使用SiRNA抑制病毒復(fù)制的治療過(guò)程中會(huì)使病毒基因變異而產(chǎn)生RNAi抗性，導(dǎo)致病毒逃逸。而為了解決這一問(wèn)題，人們開(kāi)始針對(duì)病毒基因組保守區(qū)或同時(shí)以不同基因序列作為靶基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開(kāi)了 一種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體，利用該多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體可生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，用于對(duì)現(xiàn)有普通品種進(jìn)行改良從而提高易感物種對(duì)口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上減少口蹄疫帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開(kāi)了多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于公開(kāi)了多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:—種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體,其中,所述表達(dá)載體為載體一或載體二，其中載體一為 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ;或載體二為L(zhǎng)V-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP0上述技術(shù)方案所述的一種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體，其中，多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體中Consl如序列I所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。上述技術(shù)方案所述的多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下述步驟:(I)、根據(jù)GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守區(qū)，化學(xué)合成3個(gè)shRNA串聯(lián)的 Consl-Cons2-Cons3 片段，連入 pMD_18T 載體，得到 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP載體；其中Consl-Cons2-Cons3中在Consl的5’端設(shè)有XbaI\SacI雙酶切位點(diǎn)，在Consl和Cons2之間設(shè)有Clal/Xhol雙酶切位點(diǎn)，在Cons2和Cons3之間設(shè)有BglII\MluI雙酶切位點(diǎn)，在Cons3的3’端設(shè)有LoxP\NotI雙酶切位點(diǎn)；(2)、以水?；蚪M為模板，以SEQ N0.4/SEQ N0.5為引物擴(kuò)增出水牛7SK的啟動(dòng)子bu7SK ;以水?；蚪M為模板，以SEQ N0.6/SEQ N0.7為引物擴(kuò)增出水牛U6的啟動(dòng)子buU6 ;以?；蚪M為模板，以SEQ N0.8/SEQ N0.9為引物擴(kuò)增出牛U6的啟動(dòng)子boU6 ；(3)、對(duì)步驟⑵中得到的啟動(dòng)子片段和步驟⑴得到的載體分別進(jìn)行雙酶切后連接，依次將啟動(dòng)子bu7SK、啟動(dòng)子buU6和啟動(dòng)子boU6連入步驟(I)的pl8T-Consl-Cons2-Cons3_LoxP 載體中，得到載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6_Cons3-LoxP ；(4)、用 Xbal/Notl 雙酶切載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LοχΡ,得到 Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP-NotI ；以慢病毒載體質(zhì)粒pSicoR為載體骨架，用Xbal/Notl雙酶切載體骨架后，用T4連接酶將Xba1-bu7SK_Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI 連接入 Xbal/Notl 雙酶切后的 pSicoR 質(zhì)粒中，得到多個(gè)抗口蹄疫 shRNA 串聯(lián)表達(dá)載體一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ；(5)、將載體一與慢病毒包裝質(zhì)粒pNRF和pVsvg在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，得到載體二 LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。上述技術(shù)方案所述多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其中，步驟(3)具體方法如下:(a)、首先用內(nèi)切酶 Xbal/SacI 將 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開(kāi)，將 bu7SK啟動(dòng)子用 T4 連接酶連接至 Consl 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP ；(b)、其次用內(nèi)切酶 Clal/Xhol 將 Pl8T-1xi7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開(kāi)，將buU6 啟動(dòng)子用 T4 連接酶連接至 Cons2 的 5’端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2_Cons3-LoxP ；(c)、最后用內(nèi)切酶Mlul/Bglll 將 pI8T-1xi7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3_LoxP 切開(kāi)，將boU6啟動(dòng)子用T4連接酶連接至Cons3的5’端，得到pl8T-bu7SK-Consl-buU6_Cons2-boU6-Cons3_LoxP。上述技術(shù)方案所述的多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體在檢測(cè)由該載體表達(dá)的shRNA抑制口蹄疫病毒復(fù)制方面的應(yīng)用或者在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠方面的應(yīng)用。

上述技術(shù)方案所述的應(yīng)用，其中，檢測(cè)步驟為:用載體二轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分別感染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV和非轉(zhuǎn)基因BHK-21細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定病毒拷貝數(shù)，以制作病毒復(fù)制曲線，將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV與非轉(zhuǎn)基因BHK-21細(xì)胞的病毒復(fù)制曲線做比較，確定多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體二在BHK細(xì)胞中對(duì)口蹄疫病毒復(fù)制的抑制作用。上述技術(shù)方案所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用為在小鼠上進(jìn)行對(duì)載體表達(dá)的shRNA抑制口蹄疫病毒復(fù)制的檢測(cè)；本技術(shù)方案的具體操作方法為:用所述載體二注射到乳鼠頸后皮下，24h后再頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察乳鼠死亡情況，確定多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體二在乳鼠中對(duì)口蹄疫病毒抵抗作用。上述技術(shù)方案所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用為在轉(zhuǎn)基因乳鼠上進(jìn)行對(duì)載體表達(dá)的shRNA抑制口蹄疫病毒復(fù)制的檢測(cè)；本技術(shù)方案的具體操作方法為:頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察乳鼠死亡情況，確定多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體一在轉(zhuǎn)基因乳鼠中對(duì)口蹄疫病毒抵抗作用。本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明利用水牛7SK、U6及牛U6啟動(dòng)子串聯(lián)表達(dá)針對(duì)口蹄疫病毒基因的3個(gè)shRNA，構(gòu)建了多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體及慢病毒表達(dá)載體，用慢病毒載體生產(chǎn)抗口蹄疫的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及嵌合體小鼠，并采用原核注射法，將非慢病毒多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入動(dòng)物基因組中，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)口蹄疫病毒有一定抵抗能力，建立了抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)對(duì)抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和嵌合體小鼠的分析檢測(cè)，確定細(xì)胞中有shRNA的表達(dá)，且轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒的復(fù)制有明顯抑制作用，嵌合體乳鼠對(duì)口蹄疫病毒也具有明顯的抵抗力。通過(guò)對(duì)抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因乳鼠的分析檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)基因乳鼠對(duì)口蹄疫病毒有一定抵抗力，尤其是在LD50滴度上相比普通乳鼠，死亡率較低。本發(fā)明通過(guò)多個(gè)針對(duì)口蹄疫病毒不同保守區(qū)的shRNA在細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，既能有效減少口蹄疫病毒的免疫逃逸，又能達(dá)到廣譜抑制口蹄疫病毒的效果。因此，應(yīng)用本發(fā)明可望通過(guò)轉(zhuǎn)基因家畜的制備，對(duì)現(xiàn)有普通品種進(jìn)彳丁改良從而提聞易感物種對(duì)口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上減少口蹄疫帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。


:1、圖1為pl8T_3shRNA質(zhì)粒啟動(dòng)子酶切鑒定電泳圖；2、圖2為載體一酶切鑒定圖；3、圖 3 為載體一目的片段 bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP 測(cè)序圖；4、圖 4 為多個(gè)抗口蹄疫 shRNA 串聯(lián)表達(dá)載體一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2_boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP 的結(jié)構(gòu)圖；5、圖5為包裝慢病毒載體轉(zhuǎn)染后72h熒光細(xì)胞照片；6、圖6為圖5的常光照片；7、圖7為純化后慢病毒滴度測(cè)定時(shí)第八孔熒光照片；8、圖8為圖7的常光照片；9、圖9為生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV的熒光照片；

10、圖10為圖9的常光照片；11、圖11是應(yīng)用莖-環(huán)法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)3個(gè)抗口蹄疫shRNA在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV中的表達(dá)圖；12、圖12是FMDV在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV中的復(fù)制曲線；13、圖13是經(jīng)載體二慢病毒載體預(yù)處理后的乳鼠對(duì)口蹄疫病毒的抵抗力檢測(cè)圖；14、圖14為F2代轉(zhuǎn)基因小鼠與普通小鼠交配獲得F3代后代PCR檢測(cè)；15、圖15為F2代轉(zhuǎn)基因小鼠之間交配獲得F3代后代PCR檢測(cè)；16、圖16是轉(zhuǎn)基因乳鼠對(duì)口蹄疫病毒的抵抗力檢測(cè)結(jié)果圖；17、圖17是接種口蹄疫病毒72h后，轉(zhuǎn)基因小鼠各組織病毒含量測(cè)定結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
:為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明所述的多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體、該表達(dá)載體的構(gòu)建方法以及該表達(dá)載體的應(yīng)用作進(jìn)一步的說(shuō)明。一、實(shí)驗(yàn)材料和方法所用載體、細(xì)胞系和試劑來(lái)源:pMD18T載體(購(gòu)自Takara公司)，pSicoR、pNRF和pVsvg載體由本實(shí)驗(yàn)室保存，Consl-Cons2-Cons3-LoxP序列合成由南京金斯瑞公司完成，水牛7SK、U6和牛U6啟動(dòng)子由發(fā)明人自行克隆。引物合成以及序列測(cè)定由上海生工有限公司完成，Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶、QRT-PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自Takara公司，小提質(zhì)粒以及膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，去內(nèi)毒小提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及胞質(zhì)內(nèi)注射用外源基因膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，293T細(xì)胞系為申請(qǐng)人保存，BHK-21細(xì)胞系由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供，細(xì)胞、乳鼠用口蹄疫病毒由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供。所用基因組提取、總RNA提取、PCR擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄、酶切、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法、QRT-PCR等實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見(jiàn)《分子克隆(第三版)》(2000年，科學(xué)出版社)或相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)由廣州賽業(yè)公司代理。實(shí)施例1:抗口蹄疫shRNA設(shè)計(jì)和多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體及慢病毒載體的構(gòu)建:根據(jù)NCBI上公布的各血清型口蹄疫的全基因組序列(AF189157、AY304994、AY593751和AF274010)，利用BLAST軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，在3B和3D基因中選擇三段保守區(qū)域:(1)3B 區(qū)域中 5，-CCT GTC GCT TTG AAA GTG AAA GC-3，位于 4900_4922nt ； (2) 3D區(qū)域中 5，-GAG ATT CCA AGC TAC AGA TCA CTT TAC CTG CGT TGG GTG MC GCC GTG TGCGGTGAC GC-3，位于 6934-6992nt ； (3) 3D 區(qū)域中 5，-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTTGAG CC-3，位于6892-6917nt。三段根據(jù)口蹄疫病毒基因組中3B和3D保守區(qū)域設(shè)計(jì)的shRNA的雙鏈DNA序列如序列表1-3所示，其中Consl為序列1，Cons2為序列2，Cons3為序列3 ；化學(xué)合成3 個(gè) shRNA 串聯(lián)的片段 Consl-Cons2_Cons3,其中 Consl-Cons2_Cons3 中在Consl的5’端設(shè)有XbaI\SacI雙酶切位點(diǎn)，在Consl和Cons2之間設(shè)有Clal/Xhol雙酶切位點(diǎn)，在Cons2和Cons3之間設(shè)有BglII\MluI雙酶切位點(diǎn)，在Cons3的3’端設(shè)有LoxP\NotI雙酶切位點(diǎn)，該片段包含酶切位點(diǎn)的完整序列為EcoRl-Xbal-Sacl-Consl-Cla1-Xho1-Cons2-Bgl I 1-Mlu1-Cons3-LoxP-Not 1-HindI II ;經(jīng) EcoRI/Hindl 11 雙酶切，連入 pMD_18T 載體構(gòu)建成P18T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP，酶切體系如表I所示，T4連接體系如表5所示:。表I EcoRI/Hindlll 酶切體系`(IX)
權(quán)利要求
1.一種多個(gè)抗口蹄疫ShRNA串聯(lián)表達(dá)載體,其特征在于:所述表達(dá)載體為載體一或載體二，其中載體一為 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ;或載體二為 LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體，其特征在于:多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體中Consl如序列I所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下述步驟: (1)、根據(jù)GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守區(qū)，化學(xué)合成3個(gè)shRNA串聯(lián)的 Consl-Cons2-Cons3 片段，連入 pMD_18T 載體，得到 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 載體；其中Consl-Cons2-Cons3中在Consl的5’端設(shè)有XbaI\SacI雙酶切位點(diǎn)，在Consl和Cons2之間設(shè)有Clal/Xhol雙酶切位點(diǎn)，在Cons2和Cons3之間設(shè)有BglII\MluI雙酶切位點(diǎn)，在Cons3的3’端設(shè)有LoxP\NotI雙酶切位點(diǎn)； (2)、以水?；蚪M為模板，以SEQN0.4/SEQ N0.5為引物擴(kuò)增出水牛7SK的啟動(dòng)子bu7SK ;以水?；蚪M為模板，以SEQ N0.6/SEQ N0.7為引物擴(kuò)增出水牛U6的啟動(dòng)子buU6 ；以?；蚪M為模板，以SEQ N0.8/SEQ N0.9為引物擴(kuò)增出牛U6的啟動(dòng)子boU6 ； (3)、對(duì)步驟⑵中得到的啟動(dòng)子片段和步驟⑴得到的載體分別進(jìn)行雙酶切后連接，依次將啟動(dòng)子bu7SK、啟動(dòng)子buU6和啟動(dòng)子boU6連入步驟(I)的pl8T-Consl-Cons2-Cons3_LoxP 載體中，得到載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6_Cons3-LoxP ；(4)、用Xbal/Notl 雙酶切載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到 Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP-NotI ；以慢病毒載體質(zhì)粒 pSicoR 為載體骨架，用Xbal/Notl雙酶切載體骨架后，用T4連接酶將Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI連接入Xbal/Notl雙酶切后的pSicoR質(zhì)粒中，得到多個(gè)抗口蹄疫shPRNA 串聯(lián)表達(dá)載體一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ； (5)、將載體一與慢病毒包裝質(zhì)粒pNRF和pVsvg在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，得到載體二LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)具體方法如下: (a)、首先用內(nèi)切酶Xbal/SacI 將 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開(kāi)，將 bu7SK 啟動(dòng)子用 T4 連接酶連接至 Consl 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP ； (b)、其次用內(nèi)切酶Clal/Xhol 將 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開(kāi)，將 buU6啟動(dòng)子用 T4 連接酶連接至 Cons2 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3-LoxP ; (c)、最后用內(nèi)切酶Mlul/Bglll 將 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3-LoxP 切開(kāi)，將boU6啟動(dòng)子用T4連接酶連接至Cons3的5’端，得到pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2_boU6-Cons3-LoxP。
5.由權(quán)利要求1或2所述的多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體在檢測(cè)由該載體表達(dá)的shRNA抑制口蹄疫病毒復(fù)制方面的應(yīng)用或者在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠方面的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測(cè)步驟為:用載體二轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分別感染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV和非轉(zhuǎn)基因BHK-21細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定病毒拷貝數(shù)，以制作病毒復(fù)制曲線，將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV與非轉(zhuǎn)基因BHK-21細(xì)胞的病毒復(fù)制曲線做比較，確定多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體二在BHK細(xì)胞中對(duì)口蹄疫病毒復(fù)制的抑制作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用為在小鼠上進(jìn)行對(duì)載體表達(dá)的shRNA抑制口蹄疫病毒復(fù)制的檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)，其特征在于:用所述載體二注射到乳鼠頸后皮下，24h后再頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察乳鼠死亡情況，確定多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體二在乳鼠中對(duì)口蹄疫病毒抵抗作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)方法，其中，所述應(yīng)用為在轉(zhuǎn)基因乳鼠上進(jìn)行對(duì)載體表達(dá)的shRNA抑制口蹄疫病毒復(fù)制的檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)，其特征在于:頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察乳鼠死亡情況，確定多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體一在轉(zhuǎn)基因乳鼠中對(duì)口蹄疫病 毒抵抗作用。
全文摘要
本發(fā)明一種多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于基因工程、病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建了多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體，并利用慢病毒介導(dǎo)方法將該載體轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞中獲得對(duì)口蹄疫病毒復(fù)制有抑制作用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，后將該慢病毒載體注入動(dòng)物皮下，獲得抗口蹄疫嵌合體動(dòng)物。此外，利用多個(gè)抗口蹄疫shRNA串聯(lián)表達(dá)載體制備出抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)O型口蹄疫病毒具有一定抗性，在5LD50病毒滴度下乳鼠的存活率獲得明顯提高。因此，應(yīng)用本發(fā)明可望通過(guò)抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的制備，對(duì)現(xiàn)有普通品種進(jìn)行改良從而提高易感物種對(duì)口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上減少口蹄疫帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103184235SQ20131008910
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者石德順, 張曉溪, 崔奎青, 劉慶友, 李湘萍 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)