Lolp-1蛋白和用于癌癥的診斷等的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及了一種人類腫瘤特異性抗原萊拓福蛋白-1，以及一種用于癌癥的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒。
【專利說明】L0LP-1蛋白和用于癌癥的診斷等的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本文涉及醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及了一種人類腫瘤特異性抗原萊拓福 蛋白-l(Light of life protein-l，L0LP-l蛋白），以及一種用于癌癥的早期診斷、診斷、 治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌、肺癌、腸癌、甲狀腺癌和肝癌等癌癥均是目前多發(fā)和常見的癌癥，并且致 死率非常高。目前尚缺乏有效地針對乳腺癌、肺癌、腸癌、甲狀腺癌和肝癌患者的早期診斷、 診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的方法。因此，急需新的特異性高、敏感性高、易操作 的、對人體無危害、能在癌癥發(fā)病的早期及時(shí)診斷、并且對于治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)檢 測等具有實(shí)用價(jià)值的靶標(biāo)和檢測評估方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述問題，本發(fā)明人從人類原發(fā)性腫瘤組織中分離鑒定出一個(gè)新的特異性蛋 白，即人類腫瘤特異性抗原萊拓福蛋白-1 (Light of life protein-1，L0LP-1蛋白）。該蛋 白質(zhì)由316個(gè)氨基酸組成，在除消化道外的正常成體組織中幾乎不表達(dá)。但經(jīng)本發(fā)明人的 研究發(fā)現(xiàn)L0LP-1蛋白在人類肝癌、肺癌、乳腺癌及甲狀腺癌中過度表達(dá)。相反，L0LP-1蛋 白在人的正常消化道組織中高表達(dá)，但是在腸癌組織中低表達(dá)或不表達(dá)。
[0004] 本發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了深入地研究，獲得了一種新的蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的 核苷酸序列，并利用該蛋白質(zhì)或其核苷酸序列的特異性，開發(fā)用于癌癥的早期診斷、診斷、 治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒，
[0005] 具體而言，本文涉及如下內(nèi)容：
[0006] 1. 一種人類腫瘤特異性抗原萊拓福蛋白-1 (L0LP-1蛋白），其由SEQ ID NO: 1所 示的氨基酸序列構(gòu)成。
[0007] 2.編碼L0LP-1蛋白的DNA，其由SEQIDN0:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列 構(gòu)成。
[0008] 3. -種重組載體，其包括項(xiàng)2的重組載體。
[0009] 4. -種轉(zhuǎn)化體，其是將項(xiàng)3所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
[0010] 5. -種用于癌癥的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒，其 包含特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑。
[0011] 6.項(xiàng)5所述的試劑盒，其中，所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑是特異性識別 L0LP-1蛋白的抗體。
[0012] 7.項(xiàng)6所述的試劑盒，其中所述L0LP-1蛋白由SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列構(gòu) 成。
[0013] 8.項(xiàng)5-7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑可用于檢測血清、尿液、乳汁和腸 液等體液，大便或組織樣本。
[0014] 9.項(xiàng)5所述的試劑盒，其中，所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑是特異性識別 L0LP-1蛋白核酸的引物或探針。
[0015] 10.項(xiàng)9所述的試劑盒，其中，所述L0LP-1蛋白核酸由SEQ ID N0:2所示的核苷酸 序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
[0016] 11.項(xiàng)5-10中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含L0LP-1蛋白或核酸標(biāo) 準(zhǔn)品。
[0017] 12.項(xiàng)5-11中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述癌癥選自下組：肝癌、肺癌、腸癌、甲 狀腺癌和乳腺癌。
[0018] 13.項(xiàng)5-8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒是酶聯(lián)免疫法吸附測定 (ELISA)試劑盒、時(shí)間分辨熒光免疫測定（TRFIA)試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。
[0019] 14.項(xiàng)13所述的試劑盒，其包括：
[0020] 包被有L0LP-1蛋白的特異性捕獲抗體的ELISA板；
[0021] 生物素標(biāo)記的另一種屬來源的L0LP-1蛋白的特異性檢測抗體；該捕獲抗體與檢 測抗體均可與L0LP-1蛋白結(jié)合。
[0022] 15.項(xiàng)14所述的試劑盒，其還包括：
[0023] 包被緩沖液（1XPBS，ρΗ7· 3±0· 1);
[0024] 樣品稀釋液（1XPBS、1%BSA、0. 05%NaN3, ρΗ7· 3±0· 1);
[0025] 封閉液（1 X PBS、3%BSA);
[0026] 洗脫液 PBST(1XPBS、0. 〇5%Tween_2〇);
[0027] Streptavidin-HRP 或者 Streptavidin-Eu。
[0028] 16.根據(jù)項(xiàng)14或15的試劑盒，其中捕獲抗體和檢測抗體是利用L0LP-1蛋白免疫 動(dòng)物獲得的純化抗體或單克隆抗體。
[0029] 17.根據(jù)項(xiàng)14-16中任一項(xiàng)的試劑盒，其中檢測抗體的生物素標(biāo)記效率（生物素/ 抗體）為5-10。
[0030] 18.根據(jù)項(xiàng)5-17中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù) 后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測包括：
[0031] a)利用所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑測量來自受試者的生物學(xué)樣品中 L0LP-1蛋白或核酸的水平；
[0032] b)將a)中測得的水平與正常樣品中的相應(yīng)水平比較。
[0033] 19.根據(jù)項(xiàng)18的試劑盒，其中所述樣品是血清、尿液、乳汁、腸液等體液，大便或組 織樣品。
[0034] 20.特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑在制備用于癌癥早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù) 后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒中的用途。
[0035] 21.根據(jù)項(xiàng)20所述的用途，其中，所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑是特異性識 別L0LP-1蛋白的抗體。
[0036] 22.根據(jù)項(xiàng)20所述的用途，其中所述L0LP-1蛋白由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列構(gòu)成。
[0037] 23.根據(jù)項(xiàng)20-22中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述試劑可用于檢測血清、尿液、乳 汁和腸液等體液，大便或組織樣本。
[0038] 24.根據(jù)項(xiàng)20所述的用途，其中，所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑是特異性識 別L0LP-1蛋白核酸的引物或探針。
[0039] 25.根據(jù)項(xiàng)24所述的試劑盒，其中所述L0LP-1蛋白核酸由SEQ ID N0:2所示的核 苷酸序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
[0040] 26.根據(jù)項(xiàng)20-25中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述試劑盒還包含L0LP-1蛋白或核 酸標(biāo)準(zhǔn)品。
[0041] 27.根據(jù)項(xiàng)20-26中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述癌癥選自下組：肝癌、肺癌、腸 癌、甲狀腺癌和乳腺癌。
[0042] 28.根據(jù)項(xiàng)20-22中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述試劑盒是酶聯(lián)免疫法吸附測定 (ELISA)試劑盒、時(shí)間分辨熒光免疫測定（TRFIA)試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。
[0043] 29.根據(jù)項(xiàng)28所述的用途，其包括：
[0044] 包被有L0LP-1蛋白特異性捕獲抗體的ELISA板；
[0045] 生物素標(biāo)記的另一種屬來源的L0LP-1蛋白的特異性檢測抗體；該捕獲抗體與檢 測抗體均可與L0LP-1蛋白結(jié)合。
[0046] 30.根據(jù)項(xiàng)29所述的用途，其還包括：
[0047] 包被緩沖液（1XPBS，ρΗ7· 3±0· 1);
[0048] 樣品稀釋液（1XPBS、1%BSA、0. 05%NaN3, ρΗ7· 3±0· 1);
[0049] 封閉液（1 X PBS、3%BSA);
[0050] 洗脫液 PBST(1XPBS、0. 〇5%Tween_2〇);
[0051] Streptavidin-HRP 或者 Streptavidin-Eu。
[0052] 31.根據(jù)項(xiàng)29或30的用途，其中捕獲抗體和檢測抗體是利用L0LP-1蛋白免疫動(dòng) 物獲得的純化抗體或單克隆抗體。
[0053] 32.根據(jù)項(xiàng)29-31中任一項(xiàng)的用途，其中檢測抗體的生物素標(biāo)記效率（生物素/抗 體）為5-10。
[0054] 33.根據(jù)項(xiàng)20-32中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后 判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測包括：
[0055] a)利用所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑測量來自受試者的生物學(xué)樣品中 L0LP-1蛋白或核酸的水平；
[0056] b)將a)中測得的水平與正常樣品中的相應(yīng)水平比較。
[0057] 34.根據(jù)項(xiàng)33的試劑盒，其中所述樣品是血清、尿液、乳汁、腸液等體液，大便或組 織樣品。
[0058] 35. -種用于癌癥的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒，其 包含用于特異性檢測SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的引物或探針。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059] 圖1為顯示L0LP-1蛋白在正常人組織中的表達(dá)的圖。圖1 :L0LP_1蛋白和β -肌 動(dòng)蛋白（β-Actin)在人類正常組織中的表達(dá)結(jié)果。利用從圖示中的人類組織中提取的蛋 白質(zhì)，以及本文的L0LP-1蛋白特異性抗體進(jìn)行Western印跡，再用不同熒光標(biāo)記的二抗顯 示抗原抗體反應(yīng)結(jié)果。
[0060] 圖2為顯示L0LP-1蛋白在肝癌中的表達(dá)的圖。圖2 :L0LP-1蛋白在人類肝癌組 織中的表達(dá)，其中圖2(a)為用人類肝癌冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)并利用顯微鏡觀察而 檢測到的L0LP-1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況，圖2(b)為利用顯微鏡觀察的無抗體對照。 其中圖2(a)用L0LP-1蛋白特異性抗體檢測到L0LP-1蛋白。圖2(b)用兔血清IgG取代 L0LP-1蛋白特異性抗體，證明結(jié)果的特異性。
[0061] 圖3為顯示L0LP-1蛋白在肺癌中的表達(dá)的圖。圖3 :免疫組織化學(xué)檢測的L0LP-1 蛋白在人類肺癌組織中的表達(dá)，其中圖3(a)為利用顯微鏡觀察的L0LP-1蛋白在正常肺組 織中的表達(dá)情況，圖3(b)為利用顯微鏡觀察的L0LP-1蛋白在肺癌組織中的表達(dá)情況，即用 肺癌組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測所得結(jié)果。結(jié)果表明L0LP-1蛋白在人類正常肺組織 中不表達(dá)，但在肺癌組織中特異性表達(dá)。
[0062] 圖4為顯示L0LP-1蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)的圖。圖4 :L0LP_1蛋白在人類甲狀 腺癌組織中的表達(dá)，其中圖4(a)為利用顯微鏡觀察的L0LP-1蛋白在正常甲狀腺組織中的 表達(dá)情況，圖4(b)為利用顯微鏡觀察的L0LP-1蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況，即用甲 狀腺癌組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測所得結(jié)果。結(jié)果表明L0LP-1蛋白在人類正常甲狀 腺組織中不表達(dá)，但在甲狀腺癌組織中特異性表達(dá)。
[0063] 圖5為顯示L0LP-1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)的圖。圖5 :L0LP_1蛋白在人類乳腺癌 組織中的表達(dá)，其中圖5(a)為利用顯微鏡觀察的L0LP-1蛋白在正常乳腺組織中的表達(dá)情 況，圖5 (b)為利用顯微鏡觀察L0LP-1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，即用人類乳腺組織 切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測所得結(jié)果。結(jié)果表明L0LP-1蛋白在人類正常乳腺組織中不表 達(dá)，但在乳腺癌組織中特異性表達(dá)。
[0064] 圖6為顯示L0LP-1蛋白在乳腺癌速凍組織中的表達(dá)的圖。圖6 :L0LP_1蛋白在人 類乳腺癌速凍組織中的表達(dá)結(jié)果，其中圖6 (a)為RT-PCR的結(jié)果，是通過從組織中提取RNA、 反轉(zhuǎn)錄為cDNA、再進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得到的結(jié)果。圖6(b)為Western blot的結(jié)果，是從冰凍 組織中提取的蛋白，以本文的L0LP-1蛋白特異性抗體進(jìn)行Western雜交，再用不同熒光標(biāo) 記的二抗顯示抗原抗體雜交結(jié)果。
[0065] 圖7為顯示L0LP-1蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)下降的圖。圖7 :L0LP-1蛋白在人類 結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，其中圖7(a)為利用顯微鏡觀察的L0LP-1蛋白在正常結(jié)腸組織中的 表達(dá)情況，圖7 (b)為利用顯微鏡觀察的L0LP-1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，即用組織 切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測所得結(jié)果。結(jié)果表明L0LP-1蛋白在人類正常結(jié)腸組織中高表 達(dá)，但在結(jié)腸癌組織中未見表達(dá)。
[0066] 圖8為顯示L0LP-1蛋白純化及ELISA檢測的靈敏度的圖。圖8 :L0LP-1蛋白純化 及夾心ELISA試劑盒的靈敏性。
[0067] (a)純化的L0LP-1蛋白（考馬士亮藍(lán)染色）分析。
[0068] (b)用純化的L0LP-1蛋白檢測夾心ELISA的靈敏度分析。其中捕獲抗體來自用全 長L0LP-1蛋白免疫山羊獲得的純化抗體；檢測抗體來自用全長L0LP-1蛋白免疫兔獲得的 純化抗體。用純化的、不同量的L0LP-1蛋白作為待檢樣品，以確定最低檢測靈敏度。
[0069] 圖9為顯示L0LP-1蛋白在正常人群和乳腺癌及肝癌患者血清中的濃度分布的圖。 圖9 :示出正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中L0LP-1蛋白濃度分布，其是利用上述的 夾心ELISA檢測得到的分布結(jié)果。
[0070] 圖10為顯示L0LP-1蛋白在肺癌患者血清中的濃度分布的圖。圖10 :示出肺癌患 者血清中L0LP-1蛋白濃度分布。其是利用上述的夾心ELISA檢測得到的分布結(jié)果。
[0071] 圖11為顯示L0LP-1蛋白在甲狀腺癌患者血清中的濃度分布的圖。圖11 :示出甲 狀腺癌患者血清中L0LP-1蛋白濃度分布。其是利用上述的夾心ELISA檢測得到的分布結(jié) 果。
[0072] 圖12 :示出L0LP-1蛋白在腸液中的濃度。

【具體實(shí)施方式】
[0073] 本文涉及一種人類腫瘤特異性抗原萊拓福蛋白-1 (Light of life protein-Ι)， 在本文中有時(shí)也簡稱為L0LP-1蛋白，該蛋白質(zhì)是從人類原發(fā)性腫瘤組織中分離鑒定出來 的一個(gè)新的特異性蛋白（抗原）。該蛋白質(zhì)具有316個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1 所示。
[0074] 本文中利用考馬士亮藍(lán)染色分析對經(jīng)純化的L0LP-1蛋白進(jìn)行分析，純化后的蛋 白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大小如圖8(a)所示，其大小約為37kDa。
[0075] 本文進(jìn)一步涉及編碼L0LP-1蛋白的DNA(有時(shí)也用lolp-1表示），其由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
[0076] 本文所涉及的DNA序列可以通過SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的引物從人體 細(xì)胞（如腸上皮細(xì)胞或肝、肺等腫瘤細(xì)胞）擴(kuò)增獲得L0LP-1蛋白的cDNA。對于擴(kuò)增得到的 cDNA進(jìn)行測序，該序列即為SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0077] 本文還涉及包括SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列的重組載體，以及將所述重組載 體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體。在本文中可以采用上述克隆得到的編碼本文的L0LP-1 蛋白的DNA，將其導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗鞑⑦M(jìn)行表達(dá)，可以得到本文的L0LP-1蛋白。例如，通過基 于本說明書中記載的編碼本發(fā)明的L0LP-1蛋白的基因的堿基序列的信息，設(shè)計(jì)本發(fā)明的 L0LP-1蛋白的基因特異性的探針或引物，使用該探針或引物從人體細(xì)胞（如腸上皮細(xì)胞 或肝、肺等腫瘤細(xì)胞）中擴(kuò)增編碼本文L0LP-1蛋白的DNA，利用基因重組技術(shù)將其裝入載 體，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)，能夠得到本發(fā)明的L0LP-1蛋白。
[0078] 本文涉及的L0LP-1蛋白在人的正常大腦、脾、肝、肺、胸腺、心臟、腎中不表達(dá)或基 本不表達(dá)（參見圖1)，而在罹患肝癌、肺癌、甲狀腺癌和乳腺癌的患者的肝、肺、甲狀腺及乳 腺癌組織中卻有明顯表達(dá)。相反，L0LP-1蛋白在人的正常腸組織中高表達(dá)，但是在腸癌組 織中低表達(dá)或不表達(dá)（參見圖2~圖5,以及圖7)。
[0079] 此外，進(jìn)一步利用半定量RT-PCR及Western blot方法來研究L0LP-1蛋白在人 類乳腺癌中的表達(dá)。RT-PCR的結(jié)果顯示，在正常的乳腺組織中未觀察到編碼L0LP-1蛋白 的DNA向RNA的轉(zhuǎn)錄，而在乳癌患組織中則觀察到了編碼L0LP-1蛋白的DNA向RNA的轉(zhuǎn)錄 (參見圖6(a))。由此可以說明L0LP-1蛋白在DNA向RNA轉(zhuǎn)化的過程中即發(fā)生了變化。
[0080] 此外，Western blot的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)L0LP-1蛋白在正常乳腺組織中未見表達(dá)， 而在乳腺癌組織中高表達(dá)，其中β-Actin作為參照（參見圖6(b))。
[0081] 初步的研究表明L0LP-1蛋白可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖及浸潤，在腫瘤的發(fā) 生、發(fā)展中起極為重要的作用。
[0082] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可分泌L0LP-1蛋白到外周血液循環(huán)中，在罹患肝癌、肺 癌、甲狀腺癌和乳腺癌的患者的血清中檢測到L0LP-1蛋白濃度的增加。因此L0LP-1蛋白 可以作為新的腫瘤血清標(biāo)記物，可用于肝癌、肺癌、甲狀腺癌和乳腺癌的早期診斷、診斷、治 療指導(dǎo)，復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷。相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人的正常腸上皮細(xì)胞可分泌L0LP-1蛋 白到腸液、大便中，但在腸癌患者的腸液、大便中L0LP-1蛋白濃度減少或檢測不到L0LP-1 蛋白。因此，L0LP-1蛋白也可以用于腸癌的早期診斷、治療指導(dǎo)，復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷。
[0083] 本文提供的檢測L0LP-1蛋白的試劑盒，包括特異性識別L0LP-1蛋白的抗體，該抗 體被包被在固體載體上。
[0084] 本文利用夾心ELISA技術(shù)建立了檢測血清L0LP-1蛋白抗原的試劑盒，此試劑盒適 用于肝癌、肺癌、腸癌、甲狀腺癌及乳腺癌的早期診斷和大規(guī)模的人群篩查，并可用于指導(dǎo) 治療、預(yù)后判斷以及監(jiān)測復(fù)發(fā)病人。
[0085] 本文還涉及提供一種檢測L0LP-1蛋白的夾心ELISA試劑盒。該試劑盒主要包 括有：包被有捕獲L0LP-1蛋白的抗體的ELISA板；生物素標(biāo)記的檢測抗體（2 μ g/ml兔抗 L0LP-1蛋白抗體或單克隆抗體）；捕獲抗體與檢測抗體均可與L0LP-1蛋白抗原結(jié)合。
[0086] 所述檢測L0LP-1蛋白的夾心ELISA試劑盒還包括有：包被緩沖液（1 XPBS， ρΗ7· 3±0· 1);樣本稀釋液 / 抗體稀釋液（1XPBS、1%BSA、0. 05%NaN3, ρΗ7· 3±0· 1);封閉液 (1XPBS、3%BSA);洗脫液 PBST(1XPBS、0. 05%Tween-20);辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的鏈 霉抗生物素蛋白（Streptavidin-HRP)或者鏈霉抗生物素蛋白-Eu(Streptavidin-Eu);標(biāo) 準(zhǔn)品（不同濃度的純 L0LP-1 蛋白，分別為：0、0· 3125、0· 625、L 25、2. 5、5、10、20ng/ml)。 [0087] 所述捕獲抗體來自用全長L0LP-1抗原免疫羊獲得的純化抗體或免疫小鼠獲得的 單克隆抗體；檢測抗體來自用全長L0LP-1抗原免疫兔獲得的純化抗體或單克隆抗體。檢測 抗體的生物素標(biāo)記效率（生物素/抗體）為5-10:1，即每一個(gè)抗體分子結(jié)合5-10個(gè)生物 素。
[0088] 本文的另一個(gè)目的是提供上述試劑盒的制備方法。
[0089] 為此目的，本發(fā)明提供一種制備上述檢測L0LP-1蛋白抗原的夾心ELISA試劑盒的 方法，包括以下步驟：
[0090] 用包被緩沖液將捕獲抗體稀釋成7-10μ g/ml，在ELISA板的每孔中加入100μ 1上 述抗體稀釋液，4° C過夜；取出，置于37° C30分鐘；甩去液體，用PBST洗滌5次；空干，每 孔加入100 μ 1封閉液，37° C2小時(shí)；甩去液體，用PBS洗2次；在室溫下，自然風(fēng)干2小時(shí)； 用錫箔紙真空密封，放于4° C，備用。
[0091] 使用時(shí)，將血清樣本1:10稀釋，每孔加入100 μ 1稀釋血清和標(biāo)準(zhǔn)品（0、0. 3125、 0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml L0LP-1 蛋白純蛋白稀釋品），37° C 孵育 1 小時(shí)。去 除樣本液，用PBST洗5次，用抗體/綴合物緩沖液（Antibody/Conjugate buffer)稀 釋生物素標(biāo)記的兔抗L0LP-1蛋白抗體（1:500)，然后每孔加入100 μ 1抗體稀釋液， 37 ° C孵育1小時(shí)。去除抗體液，用PBST洗5次，用Antibody/Conjugate buffer稀 釋5壯印丨&￥丨虹11-!11^(1:5000)，然后每孔加入10(^1稀釋液，37°(：孵育1小時(shí)。去除 Streptavidin-HRP稀釋液，用PBST洗5次，每孔加入100 μ 1 TMB(HRP底物），37° C孵育 30分鐘。每孔加入50 μ 1終止液（Stop solution)終止反應(yīng)。在30分鐘內(nèi)，用450nm波 長讀取0D值，以620nm作為參考。以標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出稀釋血清中L0LP-1蛋 白的濃度，然后將濃度乘以10,得到血清樣本中的終濃度。
[0092] 任選地，該試劑盒還可以包含下述：與正?；蚣膊颖井a(chǎn)生的信號相關(guān)的信息、標(biāo) 準(zhǔn)化材料、如用于對照的來自正常和/或疾病樣本的L0LP-1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、適當(dāng)?shù)拿浮⒕彌_液 和溶液。任選地，所述試劑盒還可包含任何描述如何實(shí)施本文方法的說明書、任選地提供用 于解析實(shí)施本文方法時(shí)獲得的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)圖、數(shù)據(jù)和軟件。
[0093] 本發(fā)明人在研究中，發(fā)現(xiàn)L0LP-1蛋白在肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌組織中高 表達(dá)，在同一患者的癌旁組織中低表達(dá)或不表達(dá)（參見圖廣圖6)。相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人 的正常腸上皮細(xì)胞高表達(dá)L0LP-1蛋白，但在腸癌組織中L0LP-1蛋白減少或檢測不到。本 發(fā)明人建立的檢測L0LP-1蛋白的夾心ELISA試劑盒、時(shí)間分辨熒光免疫測定（TRFIA)試劑 盒、及化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，可適用于肝癌，肺癌、腸癌、甲狀腺癌和乳腺癌早期診斷和人群 篩查、治療效果判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后判斷等方面，具有快速、客觀和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)。
[0094] 本文還提供一種檢測L0LP-1蛋白的試劑盒，其包括特異性檢測L0LP-1蛋白的試 齊U，該特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑是特異性識別L0LP-1蛋白核酸的引物或探針。
[0095] 本文還涉及一種用于癌癥的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試 劑盒，其包含用于特異性檢測SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的引物或探針。
[0096] 其中可以使用上述引物，通過常規(guī)的分子克隆方法擴(kuò)增SEQ ID N0:2所示的核苷 酸序列。所述探針可以與SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列雜交。
[0097] 探針和引物按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法設(shè)計(jì)和合成即可，只要其可以特異性識別 L0LP-1蛋白核酸序列即可。探針或引物是指核酸序列。引物的實(shí)例例如為本文中所提及的 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4。
[0098] 此外，上述探針和引物可被固定在一種或多種固體載體上。所述固體載體是指能 通過疏水、離子或共價(jià)交聯(lián)結(jié)合探針和/或引物的任何固體材料，例如有珠子、膜、過濾器 材、生物芯片等。連接在固體載體上的探針和/或引物可以用于形成本文的試劑盒。
[0099] 本文提供的檢測L0LP-1蛋白的試劑盒，包括特異性識別L0LP-1蛋白核酸的引物 或探針，其可以被固定于固體載體上。
[0100] 任選地，該試劑盒還可以包含下述：與正?；蚣膊颖井a(chǎn)生的信號相關(guān)的信息、 標(biāo)準(zhǔn)化材料、如用于對照的來自正常和/或疾病樣本的核酸標(biāo)準(zhǔn)品、適當(dāng)?shù)拿?、緩沖液和溶 液。任選地，所述試劑盒還可包含任何描述如何實(shí)施本文方法的說明書、任選地提供用于解 析實(shí)施本文方法時(shí)獲得的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)圖、數(shù)據(jù)和軟件。
[0101] 此試劑盒適用于肝癌、肺癌、腸癌、甲狀腺癌及乳腺癌的早期診斷和大規(guī)模的病人 篩查，并可用于指導(dǎo)治療、預(yù)后判斷以及監(jiān)測復(fù)發(fā)病人。
[0102] 本文中的早期診斷是指在當(dāng)腫瘤還很小，沒有轉(zhuǎn)移，病人還沒有出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)， 通過檢測血清中的L0LP-1蛋白水平的改變（例如，在血清中檢測到出現(xiàn)該L0LP-1蛋白）， 來進(jìn)行診斷；或者對患者腸液、大便中的L0LP-1蛋白水平進(jìn)行檢測以判斷其是否發(fā)生改變 (例如，樣品中L0LP-1蛋白的濃度減少或檢測不到L0LP-1蛋白），來進(jìn)行診斷。腫瘤的早 期診斷是提1?治愈率，減少死亡率的關(guān)鍵。
[0103] 本文中的診斷是指利用人血清中L0LP-1蛋白水平的改變的檢測結(jié)果，或者腸液、 大便中的L0LP-1蛋白水平的改變的檢測結(jié)果來對肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌、腸癌進(jìn) 行診斷。具體地，將檢測到的L0LP-1蛋白水平與相應(yīng)的非癌對照進(jìn)行比較，若L0LP-1蛋白 水平高于非癌對照，則表明患者患有或風(fēng)險(xiǎn)罹患肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌；或L0LP-1 蛋白水平低于非癌對照，則表明患者患有或有風(fēng)險(xiǎn)罹患腸癌。這里，"非癌對照"可以是來 自同一患者的與待診斷的癌癥具有相同組織來源的非癌性組織或細(xì)胞中L0LP-1蛋白的水 平，也可以是從已知的正常人的相應(yīng)組織中L0LP-1蛋白的平均水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 合適地確定非癌對照的水平。
[0104] 本文中的治療指導(dǎo)是指檢測接受治療的肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌、腸癌病人 血清中或腸液、大便中的L0LP-1蛋白水平的改變，可判斷療效。對于肝癌、肺癌、甲狀腺癌 及乳腺癌的患者而言，如果與實(shí)施治療之前相比，實(shí)施治療之后血清中的L0LP-1蛋白的水 平降低則表示治療有效，而L0LP-1蛋白水平升高則預(yù)示病情惡化。
[0105] 本文中的監(jiān)測復(fù)發(fā)是指定期檢測已治愈的肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌病人血 清中L0LP-1蛋白水平的改變，如果相比于基線水平L0LP-1蛋白的水平升高則預(yù)示癌癥復(fù) 發(fā)。
[0106] 本文中的預(yù)后判斷是指肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌病人血清中L0LP-1蛋白的 水平往往與腫瘤的大小及瘤組織中L0LP-1蛋白的表達(dá)水平有關(guān)，二者均為預(yù)后不良的征 兆。再有接受治療的肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌病人血清中L0LP-1蛋白的變化，也預(yù)示 治療的效果及病人的預(yù)后。對于肝癌、肺癌、甲狀腺癌及乳腺癌患者而言，測定患者血清中 L0LP-1蛋白的水平，并與預(yù)后良好的對照水平進(jìn)行比較，如果與預(yù)后良好的對照相比患者 血清中L0LP-1蛋白的水平升高，則提示患者的預(yù)后不良，反之，則預(yù)后良好。
[0107] 實(shí)施例
[0108] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本文作進(jìn)一步說明，但本文并不限于以下實(shí)施例。下述 實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所述引物合成及測序工作均由上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，所有的限制性內(nèi)切酶均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公 司（Thermo Fisher Scientific inc.)。實(shí)驗(yàn)中使用的試劑購自西格瑪奧德里奇中國公司 (Sigma-Aldrich Co. LLC)〇
[0109] 實(shí)施例1 :L0LP_1蛋白cDNA序列的獲得
[0110] 通過如下方法獲得了 L0LP-1蛋白的cDNA序列。用Trizol (Invitrogen, USA)提 取人肝癌細(xì)胞內(nèi)總RNA，溶解在去離子水中，測定濃度。用下例反應(yīng)體系去除污染的DNA :
[0111] RNA 2.0 Mg DNA 酶(DNase) 0.5 μ? RNA酶抑制劑 1.0 μ? dH20 添加至 11μ1
[0112] 將該反應(yīng)體系放置在室溫15分鐘
[0113] 加多聚 Oligo(dT) 1μ 1
[0114] 然后在75° C加熱10分鐘，后置于冰上速凍。
[0115] 按照下述組成逆轉(zhuǎn)合成cDNA :
[0116] 5x緩沖液 4μ1 0.1 M DTT 2 μ?
[0117] 20mM dNTP 1 μ? RTase (逆轉(zhuǎn)錄酶)1 μ?
[0118] 添加后置于42° C孵育45分鐘。
[0119] 按照如下條件進(jìn)行PCR
[0120] dH20 36μ! 1 Οχ緩沖液 5 μ? 50mM MgCU 1.5 μ? dNTP 1 μ? 引物各 1 μ? cDNA 5 μ? DNA多聚酶 0.5 μ?
[0121] 94° C變性5分鐘，然后94° C變性45秒，56° C復(fù)性45秒，72° C延長90秒， 共30個(gè)循環(huán)。然后利用常規(guī)方法純化DNA并進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO: 2所示。
[0122] 其中所使用的PCR引物為：
[0123] SEQ ID N0:3 :5，端：CAGAAAGCAGGACGTGGGACATC
[0124] SEQ ID N0:4 :3，端：GCACGTCGATTCGCGTCTATGAC
[0125] 實(shí)施例2 :L0LP_1蛋白的純化
[0126] 將LOLP-lcDNA克隆到含組氨酸標(biāo)簽的pQE原核細(xì)胞蛋白表達(dá)載體，導(dǎo)入活化的大 腸桿菌，分選陽性克隆，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)、擴(kuò)增，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，收集菌液、離心收集細(xì) 菌。用超聲破碎細(xì)菌、離心取上清，與Ni-NTA反應(yīng)結(jié)合含組氨酸標(biāo)簽的L0LP-1蛋白，洗滌、 收集蛋白，測定濃度。
[0127] 通過上述方法得到的該純化的蛋白與常規(guī)lx加樣緩沖液在95° C加熱5分鐘，用 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖8 (a)所示，得到了大小與 預(yù)期大小相同的為37kDa的L0LP-1蛋白。
[0128] 實(shí)施例3:制備檢測L0LP-1蛋白抗原的夾心ELISA試劑盒
[0129] 實(shí)施例3中所使用的捕獲抗體和檢測抗體是利用實(shí)施例2表達(dá)并純化而獲得的 全長L0LP-1蛋白分別免疫山羊和家兔后獲得血清，并用L0LP-1抗原制備的親和柱純化 后獲得的。兔抗L0LP-1蛋白抗體被生物素標(biāo)記。本文獲得的捕獲抗體和檢測抗體的靈敏 度和特異性都很強(qiáng)，如圖8 (b)所示，夾心ELISA可檢測到0. 03125ng/ml的L0LP-1蛋白。 其中生物素標(biāo)記試劑盒購自Pierce公司。Streptavidin-HRP購自alpha Diagnostic公 司。檢測L0LP-1蛋白的ELISA板由按照本文所描述的方法制備；所用試劑配制如下：包 被緩沖液（1XPBS，pH7. 3±0. 1);樣本稀釋液/抗體稀釋液（1XPBS、1%BSA、0. 05%NaN3， 口!17.3±0.1);封閉液（1\?85、3%85六） ；洗脫液？85了（1\?85、0.059^￥6611-20);檢測抗體 (1 μ g/ml兔抗L0LP-1蛋白抗體）；標(biāo)準(zhǔn)品（不同濃度L0LP-1蛋白抗原：0、0. 3125、0. 625、 1. 25、2· 5、5、10、20ng/ml)。
[0130] 實(shí)施例4 :正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中L0LP-1蛋白濃度分布
[0131] 檢測ELISA板的制備：用包被緩沖液將實(shí)施例3中得到的捕獲抗體稀釋成 7-10 μ g/ml，在ELISA板的每孔中加入100 μ 1上述抗體稀釋液，4° C過夜；取出，置于 37° C30分鐘；甩去液體，用PBST洗滌5次；空干，每孔加入100 μ 1封閉液，37° C2小時(shí)； 甩去液體，用PBS洗2次；在室溫下，自然風(fēng)干2小時(shí)；用錫箔紙真空密封，放于4° C，備用。
[0132] 血清樣本的檢測：血清樣本用PBS以1 : 10稀釋，每孔加入ΙΟΟμΙ樣品稀釋 液或標(biāo)準(zhǔn)品（不同濃度 L0LP-1 蛋白抗原：0、0· 3125、0· 625、1· 25、2· 5、5、10、20ng/ml)， 37° C，60分鐘；甩去液體，用洗滌緩沖液洗滌5次，空干；檢測抗體用抗體稀釋液以1:500 稀釋，每孔加入100 μ 1實(shí)施例3制備的檢測抗體稀釋液，37° C，60分鐘；甩去液體，用 洗漆緩沖液洗漆5次，控干；Streptavidin-HRP用抗體稀釋液以1:80000稀釋，每孔加入 100μ IStr印tavidin-HRP稀釋液，37° C，60分鐘；甩去液體，用洗滌緩沖液洗滌5次，空 干；100 μ 1加入底物--3, 3, 5, 5-四甲基聯(lián)苯胺（ΤΜΒ)，37° C，避光孵育30分鐘；加入 50μ 12Μ H2S04中止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀以450nm波長測定0D值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計(jì)算出血清樣本中L0LP-1蛋白的濃度，并X10,得到血清L0LP-1蛋白終濃度。
[0133] 檢測結(jié)果分析
[0134] 選取71例健康人、50例乳腺癌患者和50例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行血清樣本檢測，結(jié) 果用Graphpad4.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，平均L0LP-1蛋白水平在兩組人 群中有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈〇. 001)。如表1所示，在這71例正常人群中，血清L0LP-1蛋 白的濃度范圍為(Tl lng/ml，平均值為5. 19ng/ml，最高值為10. 7ng/ml。其中，74. 6%的樣 本的L0LP-1蛋白濃度集中在：T9ng/ml (如圖9)。乳腺癌患者血清L0LP-1蛋白的濃度范圍 為9. 5?68. 4ng/ml，平均值為20. 72ng/ml。88%的患者血清L0LP-1蛋白的濃度高于10ng/ ml，最高值達(dá)到了 68. 4g/ml。肝癌患者血清L0LP-1蛋白的濃度范圍為12. r89ng/ml，平均 值為 32. 5ng/ml。
[0135] 表1.血清L0LP-1蛋白濃度分布（ng/ml)
[0136]

【權(quán)利要求】
1. 一種人類腫瘤特異性抗原萊拓福蛋白-1 (Light of life protein-1，L0LP-1蛋白）， 其由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列構(gòu)成。
2. 編碼L0LP-1蛋白的DNA，其由SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
3. -種用于癌癥的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒，其包含 特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑是特異性 識別L0LP-1蛋白的抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中所述L0LP-1蛋白由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列構(gòu)成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑可用于檢測血清、尿液、乳 汁和腸液等體液，大便或組織樣本。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述特異性檢測L0LP-1蛋白的試劑是特異性 識別L0LP-1蛋白核酸的引物或探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中所述L0LP-1蛋白核酸由SEQ IDN0:2所示的核 苷酸序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述癌癥選自下組：肝癌、肺癌、腸 癌、甲狀腺癌和乳腺癌。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒是酶聯(lián)免疫法吸附測 定（ELISA)試劑盒、時(shí)間分辨熒光免疫測定（TRFIA)試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。
11. 一種用于癌癥的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測的試劑盒，其包含 用于特異性檢測SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的引物或探針。
【文檔編號】C12N15/12GK104059140SQ201310090071
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月20日
【發(fā)明者】祝躍球 申請人:湖南萊拓福生物科技有限公司