新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬病毒遺傳操作領(lǐng)域，具體涉及一種新城疫病毒（NDV）耐熱活疫苗載體系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)包括：a)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，通過將NDV耐熱疫苗株的基因組全長cDNA克隆至pBR322載體中獲得；b)三個輔助質(zhì)粒，分別將NDV耐熱疫苗株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白基因克隆至pcDNA3.1載體中獲得；c)宿主細(xì)胞。本發(fā)明人工獲得的重組新城疫病毒具有耐熱特性，也是首次建立的具有耐熱特性的新城疫病毒活疫苗載體系統(tǒng)。本發(fā)明將在新城疫、禽流感等禽類主要疫病的多聯(lián)（多價）耐熱基因工程活疫苗的研發(fā)、病毒耐熱機(jī)理的研究等方面具有極大的應(yīng)用前景。
【專利說明】新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒遺傳操作領(lǐng)域，涉及一種活病毒載體系統(tǒng)，更具體地，本發(fā)明涉及 新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫（Newcastle Disease, ND)又稱亞洲雞瘟，是一種由新城疫病毒 (Newcastle Disease Virus, NDV)引起的極易傳染的毀滅性疾病，有較高的發(fā)病死亡率， 被國際獸疫局（0ΙΕ)列為兩種A類禽病之一(另一種為禽流感)，屬于國家強(qiáng)制性免疫疫病。 雞新城疫自1926年在印尼的爪哇和英國的新城首次暴發(fā)以后，一直在除大洋洲以外的全 世界范圍內(nèi)流行，給全球造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國，新城疫也是危害最為嚴(yán)重的禽病 之一，我國許多地區(qū)一直都有該病流行。新城疫的控制以免疫預(yù)防為主。近年來隨著疫苗 的廣泛應(yīng)用，新城疫的大規(guī)模暴發(fā)流行已受到明顯控制，但由于存在疫苗冷鏈系統(tǒng)不完善、 使用方法不當(dāng)、免疫程序不科學(xué)等問題，導(dǎo)致典型和非典型新城疫不斷發(fā)生。而新城疫宿主 范圍的不斷擴(kuò)大和變異毒株的出現(xiàn)和流行，都使新城疫的防制工作復(fù)雜化。
[0003]目前，國際上生產(chǎn)和使用的新城疫疫苗有兩大類，即活疫苗和滅活疫苗?；钜呙?包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗，低毒力株疫苗包括Π 系苗（Bl)、III系苗（LaSota 株)、clone 30、V4等；中等毒力疫苗包括I系苗、Roskin株、Komorov株、Hert 33株和 Mukteswar株等。有些低毒力活疫苗具有獨(dú)特的耐熱特性，稱之為耐熱活疫苗，代表株有 V4、I-2、HB92和TS09-C株等。此類疫苗具有耐熱、低毒性、免疫效果好、可同群感染、多途 徑免疫(拌料、噴霧等)等優(yōu)點(diǎn)，適用于雞、鴿、鵪鶉等多種禽類的新城疫防控。與其他非耐熱 疫苗相比，該疫苗在氣溫普遍較高的南方地區(qū)和冷鏈條件較差的農(nóng)村推廣應(yīng)用更有優(yōu)勢， 在新城疫的防控中發(fā)揮了重要作用。
[0004] 隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，NDV的分子基礎(chǔ)研究工作取得了較大進(jìn)展。NDV的 基因組RNA通過與其編碼的核蛋白（NP)、磷蛋白（P)和大聚合酶蛋白（L) 一起構(gòu)成核蛋白 復(fù)合體，啟動RNA的首輪轉(zhuǎn)錄及病毒蛋白的翻譯合成，病毒的各個組份通過自包裝產(chǎn)生具 有感染性的子代病毒。根據(jù)這一原理，1999年歐洲學(xué)者建立了第一個高致病性NDV的反向 遺傳操作系統(tǒng)。研究表明，NDV基因組可在不同位點(diǎn)插入并表達(dá)外源報告基因或免疫源性 基因，經(jīng)細(xì)胞或雞胚連續(xù)高代次傳代仍保持高度的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性。
[0005] 以NDV耐熱弱毒株作為活病毒疫苗載體具有極為突出的優(yōu)點(diǎn)：1)可常溫保存運(yùn) 輸，降低對冷鏈系統(tǒng)的依賴，更適宜在氣溫較高的地區(qū)使用；2)有較高的同群感染率，免疫 效果更佳確實(shí)；3)疫苗毒力極低，對雞胚不致死，可雞胚免疫或0日齡免疫；4)復(fù)制過程為 從RNA到RNA，不存在DNA階段及與細(xì)胞基因組整合的可能性；5河同時誘導(dǎo)體液免疫、粘 膜免疫及細(xì)胞免疫，產(chǎn)生更加全面的免疫保護(hù)；6)可通過拌料、飲水、噴霧等多種方式給苗， 使用方便；7) NDV弱毒具有高滴度的雞胚生長特性，生長成本低廉。在我國采用NDV弱毒 疫苗對新生雛雞進(jìn)行免疫是必不可少的，每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百億羽份 以上。因此，NDV耐熱弱毒株作為活病毒疫苗載體應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)意義十分巨大。
[0006] 從1966年第一株NDV耐熱株V4株被分離得到至今，已有多株NDV耐熱株被選育、 分離得到，如I-2、HB92、TS09-C株等。有些課題組嘗試把耐熱株改造為耐熱載體，但一直未 見有成功的研究報道。如：文獻(xiàn)"新城疫病毒V4株全基因組測序及全長cDNA克隆的構(gòu)建" (姜延龍，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，博士學(xué)位論文，2010年)公開了 V4耐熱株的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的 構(gòu)建，但未能人工拯救出重組的V4耐熱株；文獻(xiàn)"Plasmids driven minigenome rescure system for Newcastle disease virus V4 strain^CMol Biol Rep, 2009,36:1909-1914) 公開了 V4耐熱株的微基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了外源基因在細(xì)胞中的表 達(dá)，但仍未能獲得重組耐熱病毒。
[0007] 現(xiàn)有關(guān)于新城疫活疫苗的文獻(xiàn)也較多，但均未見涉及到具有耐熱特性的新城疫活 疫苗載體的報道。例如：專利號為200510097997.8的文獻(xiàn)"新城疫LaSota疫苗株反向遺 傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用"公開了以新城疫病毒LaSota疫苗株為基礎(chǔ)的非耐熱活疫苗載體，但 未涉及耐熱活疫苗載體；專利號為200610075781. 6的文獻(xiàn)"表達(dá)禽流感病毒H5亞型HA蛋 白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株"公開了以新城疫LaSota疫苗株載體構(gòu)建的禽流感、新 城疫二聯(lián)基因工程活疫苗，也未涉及到耐熱活疫苗載體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有耐熱特性的新 城疫病毒活疫苗載體系統(tǒng)及其應(yīng)用。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含：a)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒能夠表 達(dá)新城疫病毒耐熱株的基因組全長cDNA序列，通過將新城疫病毒耐熱疫苗株的基因組全 長cDNA克隆至pBR322載體中獲得；b)三個輔助質(zhì)粒，所述的三個輔助質(zhì)粒能夠分別表達(dá) 新城疫病毒耐熱株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白，通過將新城疫病毒耐熱疫苗株的核 蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白基因分別克隆至pcDNA3. 1載體中獲得；c)新城疫病毒耐熱 株復(fù)制許可的宿主細(xì)胞。優(yōu)選BHK-21細(xì)胞。
[0010] 按上述方案，所述的新城疫病毒耐熱株是耐熱疫苗株，為新城疫病毒TS09-C耐熱 疫苗株。
[0011] 按上述方案，所述宿主細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞。
[0012] 按上述方案，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的新城疫病毒耐熱株的基因組cDNA序列位于T7啟 動子之后，在編碼自我剪切的丁型肝炎核酶序列和T7終止子之前。
[0013] 按上述方案，所述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒插入并表達(dá)有外源基因，所述的外源基因在所述轉(zhuǎn) 錄質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)在磷蛋白基因和基質(zhì)蛋白基因之間。
[0014] 按上述方案，所述外源基因包括標(biāo)記基因或病毒的抗原基因。
[0015] 按上述方案，所述標(biāo)記基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。
[0016] 應(yīng)用上述耐熱活疫苗載體系統(tǒng)人工獲得重組新城疫病毒耐熱株的方法，其特征在 于，其包括以下步驟：1)將所述耐熱活疫苗載體系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染新城 疫病毒耐熱株復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；2)收獲細(xì)胞液，過濾后在宿 主細(xì)胞或SPF雞胚上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即可人工獲得重組新城疫病毒耐熱株。
[0017] 按上述方案，所述步驟1)中的轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法。
[0018] 按上述方案，所述重組新城疫病毒耐熱株在56度熱處理1小時后，耐熱株的血凝 素活性無明顯下降。
[0019] TS09-C耐熱疫苗株參照中國專利201110163109. 3獲得。
[0020] 本發(fā)明的技術(shù)原理在于：轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包含有新城疫病毒耐熱株的全長基因組序列， 三個輔助質(zhì)粒能夠分別表達(dá)新城疫病毒耐熱株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白。將能夠 表達(dá)T7 RNA聚合酶的痘苗病毒預(yù)感染宿主細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和三個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 該細(xì)胞。首先，痘苗病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)T7 RNA聚合酶；然后，T7 RNA聚合酶識別 轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上的T7啟動子序列，并啟動RNA的復(fù)制過程，在T7終止子處終止復(fù)制，復(fù)制出的 RNA序列即為新城疫病毒耐熱株的全基因組RNA序列；病毒基因組RNA與三個輔助質(zhì)粒表 達(dá)出的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白一起構(gòu)成核蛋白復(fù)合體，啟動病毒RNA的首輪轉(zhuǎn)錄 及病毒蛋白的翻譯合成，病毒的各個組份通過自包裝產(chǎn)生具有感染性的子代病毒。如果在 轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中插入了綠色熒光蛋白等外源基因，那么外源基因?qū)殡S著轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的新城疫 全基因組序列進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，并被包裝到病毒粒子里面。隨著病毒粒子的釋放、再 次感染與增殖，外源基因?qū)⒃谒拗骷?xì)胞內(nèi)大量復(fù)制與表達(dá)。本發(fā)明采用了更為高效的磷酸 鈣轉(zhuǎn)染法，提高了質(zhì)粒對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明對表達(dá)NP基因的輔助質(zhì)粒的序列進(jìn)行了 修飾，提高了 NP基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率。而且，以新選育的、能在BHK-21細(xì)胞上高效增 殖的TS09-C耐熱株為基礎(chǔ)，增加了病毒成功拯救的幾率。
[0021] 本發(fā)明的有益效果為： 1)本研究以新城疫病毒耐熱疫苗株TS09-C株(本 申請人:于中國專利201110163109. 3 中公開)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了出了 TS09-C株的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒，功構(gòu)建出了新城疫病毒耐熱 活疫苗載體系統(tǒng)，并成功獲得了具有耐熱特性的重組病毒。耐熱試驗(yàn)結(jié)果表明，重組耐熱病 毒的耐熱特性明顯高于TS09-C親本株。在此基礎(chǔ)上還構(gòu)建了插入有綠色熒光蛋白基因的 轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，并成功拯救出了能夠表達(dá)綠色熒光蛋白的具有耐熱性的新城疫病毒耐熱毒株， 證實(shí)了該載體表達(dá)外源基因的能力。利用本發(fā)明建立的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)， 可構(gòu)建出能夠表達(dá)其他病原的主要抗原基因的重組新城疫耐熱活疫苗。
[0022] 2)相對于傳統(tǒng)的新城疫疫苗，此類疫苗具有如下優(yōu)點(diǎn)：a)可同時預(yù)防兩種疾??； b)可4° C甚至常溫保存，極大地降低運(yùn)輸成本；c)同群感染率高；d)使用方便，可通過 拌料、噴霧、點(diǎn)眼、滴鼻等方式免疫。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是新城疫耐熱活疫苗載體系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
[0024] 圖2是新城疫耐熱活疫苗載體系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的酶切鑒定圖。Μ代表DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3和4分別代表了 Notl、BamHI、XhoI和EcoRI的酶切鑒定結(jié)果。
[0025] 圖3是重組新城疫病毒耐熱株的間接免疫熒光檢測結(jié)果。（a)代表重組病毒的檢 測結(jié)果；（b)代表陰性細(xì)胞的檢測結(jié)果。
[0026] 圖4是重組新城疫病毒耐熱株的透射電鏡檢測結(jié)果。箭頭所標(biāo)注的是典型的新城 疫病毒顆粒。
[0027] 圖5是重組新城疫病毒耐熱株的細(xì)胞生長曲線圖?？v坐標(biāo)代表病毒滴度，以 lgTCID5(l/ml為單位；橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時間，以小時為單位。
[0028] 圖6是插入有綠色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。pGFP2AUBI-M代表插 入有GFP基因的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒；pTS09-C代表未插入外源基因的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒。
[0029] 圖7是重組新城疫病毒耐熱株在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)GFP蛋白的熒光圖片。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于 下面的實(shí)施例。
[0031] 實(shí)施例1 新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)的構(gòu)建 新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)主要由能夠表達(dá)新城疫病毒耐熱株的基因組全長序 列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒、能夠分別表達(dá)新城疫病毒耐熱株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白的三個 輔助質(zhì)粒和宿主細(xì)胞組成，下面主要闡述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和三個輔助質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0032] 1.轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建 轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建策略如圖1所示，首先是分片段擴(kuò)增全基因組序列，共分為A-G 7個片 段擴(kuò)增全基因組序列。其中在A片段的上游加入了 T7啟動子，G片段的下游加入了丁型肝 炎病毒核酶序列和T7終止子。通過普通PCR、融合PCR和引物自延伸的方法擴(kuò)增獲得7個 片段后，先構(gòu)建3個中間質(zhì)粒pBR-ABC、pBR-DE和pBR-FG。再將ABC片段和DE片段切割下 來插入到PBR-FG片段的前面，形成轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒。
[0033] 1. 1病毒RNA的提取及RT反應(yīng) 參照試劑盒說明書進(jìn)行NDV TS09-C株的基因組RNA提取，提取的RNA溶解于17--1 DEPC水，加入1--1隨機(jī)引物，75°C 5min，立即冰浴，然后加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5XRT Buffer 5--l，dNTPs (10mmol/L) 1--1 和 M-MLV 1--1。42°C 60min，95°C 5min，-20°C保存待進(jìn)行 PCR反應(yīng)。
[0034] 1· 2七個片段的PCR擴(kuò)增及克隆 PCR 反應(yīng)體系由 10 X Buf f er、MgCl2 (25mmo 1/L)、dNTPs、上、下游引物（lOmmo 1/L)、Taq 酶、RT產(chǎn)物和水組成。其中上、下游引物由于擴(kuò)增片段的不同而不同，具體序列見表1。常規(guī) 的 PCR 擴(kuò)增條件為：95°C 5min;30 X (94°C 30sec，55°C 2min，72°C 5min);72°C lOmin。 以瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。將特異的陽性條帶以DNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收，以 相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，連入已經(jīng)酶切處理的克隆載體中，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，挑選 菌斑進(jìn)行PCR及酶切鑒定。
[0035] 表1.用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的引物信息表

【權(quán)利要求】
1. 新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：a)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒能 夠表達(dá)新城疫病毒耐熱株的基因組全長cDNA序列；b)三個輔助質(zhì)粒，所述的三個輔助質(zhì) 粒能夠分別表達(dá)新城疫病毒耐熱株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白；及c)新城疫病毒 耐熱株復(fù)制許可的宿主細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的新城 疫病毒耐熱株是耐熱疫苗株，為新城疫病毒TS09-C耐熱疫苗株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，其特征在于，所述宿主細(xì) 胞為BHK-21細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì) 粒中的新城疫病毒耐熱株的基因組cDNA序列位于T7啟動子之后，在編碼自我剪切的丁型 肝炎核酶序列和T7終止子之前。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)錄 質(zhì)粒插入并表達(dá)有外源基因，所述的外源基因在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)在磷蛋白基因 和基質(zhì)蛋白基因之間。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，其特征在于，所述外源基 因包括標(biāo)記基因或病毒的抗原基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的新城疫病毒耐熱活疫苗載體系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記基 因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。
8. 應(yīng)用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的耐熱活疫苗載體系統(tǒng)人工獲得重組新城疫病毒耐 熱株的方法，其特征在于，其包括以下步驟：1)將所述耐熱活疫苗載體系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒 和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染新城疫病毒耐熱株復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；2)收 獲細(xì)胞液，過濾后在宿主細(xì)胞或SPF雞胚上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即可人工獲得重組新城疫病毒 耐熱株。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟1)中的轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組新城疫病毒耐熱株在56度熱處 理1小時后，耐熱株的血凝素活性無明顯下降。
【文檔編號】C12R1/93GK104059942SQ201310090099
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月20日
【發(fā)明者】溫國元, 邵華斌, 楊峻, 王紅琳, 羅青平, 張蓉蓉, 艾地云, 羅玲, 商雨, 郭靜, 陳晨 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所