隸屬于r型水合酶的基因片段及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種隸屬于R型水合酶的基因片段及其編碼蛋白與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的隸屬于R型水合酶的基因片段編碼的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有水解巴豆酰輔酶A活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的MaoC-Del63-71蛋白對(duì)于底物巴豆酰輔酶A（Crotonyl-CoA）具乙酰輔酶A水合酶活性，其酶活達(dá)91.2U/mg，顯著高于原始MaoC蛋白的酶活（58.1U/mg）。本發(fā)明所提供的MaoC-Del63-71蛋白及其編碼基因可用于有效合成聚羥基脂肪酸酯（PHA），為進(jìn)一步應(yīng)用綠色塑料聚羥基脂肪酸酯（PHA）提供了一定的技術(shù)儲(chǔ)備。
【專利說(shuō)明】隸屬于R型水合酶的基因片段及其編碼蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種隸屬于R型水合酶的基因片段及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別涉及一種隸屬于R型水合酶的基因片段MaoC-Del63-71及其編碼蛋白與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在過(guò)去的50年內(nèi)，石油化工塑料已是應(yīng)用最多的材料，主要是因?yàn)檫@類塑料具有多種結(jié)構(gòu)、多種性能，且原材料價(jià)格低廉。目前這類塑料產(chǎn)量年增長(zhǎng)速度為9.9%，但給人類帶來(lái)了嚴(yán)峻的“能源問(wèn)題”和“環(huán)境問(wèn)題”。
[0003]生物降解塑料是近些年發(fā)展起來(lái)的被全球公認(rèn)的一種真正綠色環(huán)保塑料，易于被環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)降解，從根本上解決“白色污染”問(wèn)題。目前全球研發(fā)的生物降解塑料品種已有幾十種，其中聚羥基脂肪酸酯(PHA)是其中最為活躍的研究熱點(diǎn)。PHA作為一種“生物可降解塑料”除用于環(huán)境友好型包裝之外，還可用于熱敏膠、壓敏膠和水溶膠及拉成纖維等。此外，基于PHA具生物可降解和生物相容性，PHA可作為醫(yī)用植入材料和可控藥物緩釋載體，PHA的寡聚物可作為酮體供體的營(yíng)養(yǎng)添加劑，PHA的手性單體作為藥物或手性合成的中間體，PHA膜蛋白可用于某些微量蛋白的分離；PHA合成基因還可用于調(diào)節(jié)微生物的新陳代謝，調(diào)節(jié)微生物于逆境條件下的生存能力，由此可用于改造工業(yè)微生物菌株，提高微生物發(fā)酵的效率等。
[0004]PHA的生物合成是一個(gè)受多種酶參與催化、由不同的代謝途徑控制的復(fù)雜過(guò)程。PHA合成需要β-酮基硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶和PHA聚合酶等。此外，(R)-專一的烯酰輔酶A水合酶(PhaJ )能通過(guò)脂肪酸的β_氧化提供合成PHA的前體物，它的使用為脂肪酸在重組菌株中合成PHA提供了有力的工具。
[0005]隸屬于R型水合酶((R) -hydratase)的一種新酶類單胺氧化酶C類水合酶(MaoC-like hydratase, MaoC)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新乙酰輔酶A水合酶(Enoyl-CoAhydratase),該酶在脂肪酸β _氧化至PHA的合成過(guò)程中提供(R)-專一的輕燒基輔酶A(R-3_hydroxyacy1-CoA)。MaoC已經(jīng)被證明對(duì)底物巴豆酰輔酶A(Crotonyl-CoA)具乙酰輔酶A水合酶(Enoyl-CoA hydratase)的活性。MaoC因具乙酰輔酶A水合酶(Enoyl-CoAhydratase)活性而成為與PHA合成相關(guān)的眾多酶類成員之一。
[0006]作為生態(tài)環(huán)境友好型塑料，PHA是最具環(huán)保和最具發(fā)展前景的綠色塑料之一，該類塑料的不斷開(kāi)發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬將會(huì)給人類生活帶來(lái)極其深遠(yuǎn)的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種隸屬于R型水合酶的基因片段及其編碼蛋白與應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所提供的隸屬于R型水合酶的基因片段的編碼蛋白，名稱為MaoC-Del63_71,是由類單胺氧化酶C類水合酶(MaoC-like hydratase, MaoC)蛋白(GenBank:⑶190361)進(jìn)行部分氨基酸缺失后所得的蛋白，具體是如下(a)或(b ):
[0009](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，即經(jīng)PCR擴(kuò)增刪除了 MaoC蛋白(GenBank:⑶190361)的第63-71位氨基酸后所得的蛋白；
[0010](b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有水解巴豆酰輔酶A活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0011]序列表中序列2由289個(gè)氨基酸殘基組成。
[0012]為了便于MaoC-Del63-71蛋白的純化，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[0013]表:標(biāo)簽的序列
[0014]
【權(quán)利要求】
1.蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有水解巴豆酰輔酶A活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子為編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因；所述基因是如下I)-4)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列I的DNA分子； 2)序列表中序列I所不的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、重組細(xì)胞、重組菌或重組病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求 4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為T7啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為在pET28a(+)載體的多克隆位點(diǎn)處插入權(quán)利要求2或3所述核酸分子后得到的重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述核酸分子，或權(quán)利要求4-7中任一所述的重組載體、表達(dá)盒、重組細(xì)胞、重組菌或重組病毒在如下任一中應(yīng)用: (1)水解巴豆酰輔酶A； (2)制備水解巴豆酰輔酶A的產(chǎn)品； (3)作為乙酰輔酶A水合酶； (4)制備具有乙酰輔酶A水合酶活性的產(chǎn)品； (5)合成聚羥基脂肪酸酯； (6)制備合成聚羥基脂肪酸酯的產(chǎn)品。
9.活性成分為權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述核酸分子，或權(quán)利要求4-7中任一所述的重組載體、表達(dá)盒、重組細(xì)胞、重組菌或重組病毒的如下任一產(chǎn)品: (I)水解巴豆酰輔酶A的產(chǎn)品； (2 )具有乙酰輔酶A水合酶活性的產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的制備方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，得到權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)；所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、非人動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞； 所述蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列具體如序列表中序列I所示。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK103589707SQ201310090127
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月20日
【發(fā)明者】張修國(guó), 王會(huì)征 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)