專利名稱：一種提高16α，17α-環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領域，具體是指在11 α -羥基-16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮制備方法中一種提高16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法。
背景技術(shù)：
:11 α -羥基-16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮(簡稱霉菌)，是一種重要的激素類藥物中間體，廣泛應用于激素類藥物的合成，是氫化可的松、可的松、強的松和膚輕松等留體激素類藥物的重要原料。16 α , 17 α -環(huán)氧黃體麗(16 α , 17 a -Epoxyprogesterone, EP)全名 16,17a-環(huán)氧-4-孕留烯-3，20-二酮，又名沃氏氧化物，是一種無臭、白色結(jié)晶粉末，在甲醇、乙醇、苯
中溶解度小。
權(quán)利要求
1.一種提高16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，包括以下步驟 (1)斜面制備 將赭曲霉試管菌種接種于土豆斜面培養(yǎng)基，25-28°C恒溫培養(yǎng)4-7d生成黃色孢子，然后轉(zhuǎn)接在酵母膏斜面培養(yǎng)基斜面上，25-28°C培養(yǎng)7-10d，可生成金黃色孢子，即得生產(chǎn)用斜面，于冰箱中4°C恒溫保存2-3個月備用； (2)孢子懸液制備 將含2%。(w/v)吐溫80的無菌水加入步驟(I)保存的生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，配制、調(diào)整孢子懸液濃度為4X IO6-SX IO6個/mL ； (3)靜息細胞制備 將步驟(2)中的孢子懸液按8-10%的接種量接入液體培養(yǎng)基，28-30°C培養(yǎng)24-30h后，發(fā)酵液抽濾，用3-5倍的無菌水洗滌菌體兩遍，即得菌體靜息細胞； (4)兩相體系中的轉(zhuǎn)化 向加塞瓶中加入雙液相培養(yǎng)基和步驟(3)中的靜息細胞，同時加入16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮和濃度為30%的H2O2溶液，于28-30°C，180-200r/min振蕩培養(yǎng)46_48h ； (5)過濾 將步驟(4)中的發(fā)酵液于室溫用500-800目濾布預涂硅藻土，采用板框過濾機進行過濾，操作壓力為O. 14-0. 24Mpa ;所述硅藻土粒度為100目-300目； (6)萃取 將步驟(5)中的濾液于80°C加熱30min，冷卻至室溫，以乙酸乙酯萃取3次； (7)結(jié)晶 萃取后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機相濃縮，室溫冷卻結(jié)晶； (8)重結(jié)晶精制 結(jié)晶產(chǎn)物再用82% (v/v)氯仿-甲苯混合溶劑進行重結(jié)晶精制，60°C烘干至恒重，既得Ila-羥基-16 a，17 a -環(huán)氧黃體酮白色針狀結(jié)晶體。
2.如權(quán)利要求I所述的一種提高16a，17 a -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述赭曲霉(Aspergillus ochraccus)菌種保藏于天津科技大學工業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏編號為TCCC41060。
3.如權(quán)利要求I所述的一種提高16α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述雙液相培養(yǎng)基由無菌水和鄰苯二甲酸二丁酯按質(zhì)量比為3 1-4 I混合而成。
4.如權(quán)利要求I所述的一種提高16α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述靜息細胞的添加量為雙液相培養(yǎng)基的7-10%。
5.如權(quán)利要求I所述的一種提高16α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述雙液相培養(yǎng)基每IOOml添加l_2gl6 α，17 α -環(huán)氧黃體酮。
6.如權(quán)利要求I所述的一種提高16α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述H2O2溶液的添加量為雙液相培養(yǎng)基的O. 8-1. 2%。
7.如權(quán)利要求I所述的一種提高16α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述土豆斜面培養(yǎng)基組成為土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，純凈水IOOOmL, pH 值 6. 8，121°C蒸汽滅菌 20min。
8.如權(quán)利要求I所述的一種提高16α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述酵母膏斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨20g/L，酵母膏20g/L，瓊脂20g/L,純凈水 IOOOmL, pH 值 5. 8，121 °C 蒸汽滅菌 20min。
9.如權(quán)利要求I所述的一種提高16 α，17 α -環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基組成為葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、MgS042g/L,純凈水IOOOmL, pH 值 5. 8，121°C蒸汽滅菌 20min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用赭曲霉在兩相系統(tǒng)中催化生產(chǎn)11α-羥基-16α，17α-環(huán)氧黃體酮的方法。通過添加有機溶劑鄰苯二甲酸二丁酯，有效地解決底物和產(chǎn)物的溶解問題，增加與細胞的接觸面積，簡化分離過程，縮短了轉(zhuǎn)化的時間，大大提高了底物的轉(zhuǎn)化率，16α，17α-環(huán)氧黃體酮轉(zhuǎn)化率可達84％以上，為生產(chǎn)出高收率、高純度的11α-羥基-16α，17α-環(huán)氧黃體酮奠定了堅實的實踐生產(chǎn)基礎，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了企業(yè)經(jīng)濟效益。
文檔編號C12P33/10GK103255194SQ20131009697
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者別松濤, 王家明, 路福平 申請人:天津科技大學