專(zhuān)利名稱：一種坎利酮高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)11α-羥基坎利酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)11 α -羥基坎利酮的方法，特別涉及一種以赭曲霉為菌種，采取高密度培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Ila-羥基坎利酮的方法。
背景技術(shù)：
坎利酮(Canrenone)屬于一種留體激素類(lèi)心血管藥物，臨床上主要作為非選擇性醛固酮受體拮抗劑來(lái)治療心血管疾病。心血管疾病主要與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)有關(guān)，利用醛固酮受體拮抗劑則可阻斷RAAS的作用，從而降低心血管疾病的發(fā)生率和死亡率。但由于其對(duì)強(qiáng)心劑地高辛(Digoxin)定量檢測(cè)有負(fù)面干擾，并且在心臟病治療中有可能引起用藥過(guò)量而致死的危險(xiǎn)后果，人們開(kāi)始通過(guò)硝基化、羥基化等途徑，加緊研制其衍生物，以期增強(qiáng)療效，減少副作用。在坎利酮的衍生化類(lèi)型中，11 α -羥基坎利酮可以被用來(lái)制備一系列有用的坎利酮衍生物，因此受到了極大的關(guān)注。Ila-羥基坎利酮由坎利酮通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化在11位上羥基得到。由于其市場(chǎng)潛力巨大，很早就有坎利酮Ila羥基化反應(yīng)的報(bào)道。1971年，B.1unt等曾嘗試用坎利酮生產(chǎn)11 α -羥基坎利酮。1980年，Deshayes在坎利酮投料為1.5g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)95%，但其投料量不大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。1996年，Ng John S.等采用間歇補(bǔ)料，雖然投料量大為增加，但轉(zhuǎn)化時(shí)間加長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率不高，致使成本大大提高。

現(xiàn)有的坎利酮微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)仍然存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高，轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題，極大地限制了該產(chǎn)品的應(yīng)用和推廣。因此尋求一種廉價(jià)、高效的Ila-羥基坎利酮生產(chǎn)方法勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通過(guò)高密度培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)坎利酮高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Ila-羥基坎利酮的方法。高密度培養(yǎng)可以提高單位體積培養(yǎng)液中菌體的濃度，并使其穩(wěn)定在較高濃度，進(jìn)而提高體積產(chǎn)率，相應(yīng)縮小生物反應(yīng)器體積，減少生產(chǎn)設(shè)備投資。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明技術(shù)方案如下:通過(guò)高密度培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)11 α-羥基坎利酮的制備技術(shù)是以赭曲霉(Aspergillus ochraceus) TCCC41060為生產(chǎn)菌株,經(jīng)過(guò)產(chǎn)孢和生產(chǎn)斜面制備、孢子懸液制備、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、流加葡萄糖高密度培養(yǎng)轉(zhuǎn)化底物坎利酮得到產(chǎn)物11 α -羥基坎利酮，具體步驟如下:(I)產(chǎn)孢和生產(chǎn)斜面制備生產(chǎn)菌株為赭曲霉TCCC41060，將該菌置于PDA培養(yǎng)基上，25 30°C恒溫培養(yǎng)3 6d生成黃色孢子，然后轉(zhuǎn)接到酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖(YPDA)培養(yǎng)基斜面上，25 30°C培養(yǎng)5 8d，生成金黃色孢子，即得生產(chǎn)用斜面，于4°C冰箱保藏，保藏時(shí)間在15d以內(nèi)；(2)孢子懸液制備將10mL2%。(w/v)吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計(jì)數(shù)調(diào)整孢子懸浮濃度在 4X IO8 8X IO8 個(gè) /IOOmL0⑶種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成如下，單位g/L:葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，調(diào)pH至
5.0 6.0之間，121°C滅菌20min，每IOOmL種子培養(yǎng)基接入ImL孢子懸液，在搖床溫度25 30°C，轉(zhuǎn)速180 200r/min培養(yǎng)18 24h即得種子培養(yǎng)液；⑷發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下，單位g/L:葡萄糖15，玉米漿20，酵母膏20，K2HP042，調(diào)pH值5.8，1211:滅菌201^11。將步驟(3)所述種子培養(yǎng)液按8%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初始轉(zhuǎn)速150r/min，通氣量70 100L/h，罐壓0.02Mp,培養(yǎng)溫度25 30°C。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量控制發(fā)酵液溶氧在30%以上，培養(yǎng)18 22h，殘?zhí)墙抵?0 14g/L時(shí)，進(jìn)行坎利酮底物投料，投料量15 20g/L ；(5)流加葡萄糖高密度培養(yǎng)進(jìn)行底物轉(zhuǎn)化發(fā)酵28 32h，培養(yǎng)基中的葡萄糖基本耗盡時(shí)，開(kāi)始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；取發(fā)酵液用高 效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)坎利酮轉(zhuǎn)化率大于90%時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。有益效果:本發(fā)明提供了一種通過(guò)高密度培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Ila-羥基坎利酮的制備技術(shù)。通過(guò)控制流加葡萄糖，提高單位體積培養(yǎng)液中赭曲霉菌體的濃度，并使其穩(wěn)定在較高濃度，保證高轉(zhuǎn)化率的同時(shí)，縮短了轉(zhuǎn)化時(shí)間，大大降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明是一種新的、高效的、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的生產(chǎn)11 α -羥基坎利酮微生物轉(zhuǎn)化方法，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的意義。
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例I生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS，TCCC41060)，該菌在PDA斜面置于25°C恒溫培養(yǎng)6d生成黃色孢子。然后轉(zhuǎn)接在YPDA斜面上，30°C培養(yǎng)5d，可生成金黃色孢子。于4°C冰箱保藏，IOd后使用。將10mL2%。(w/v)吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計(jì)數(shù)調(diào)整孢子懸浮濃度為 4X108 個(gè)/100mL。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，調(diào)pH至5.0 6.0之間，121°C滅菌20min，每IOOmL種子培養(yǎng)基接入ImL孢子懸液，在搖床溫度30°C，180r/min培養(yǎng)18h即得種子培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，玉米漿20，酵母膏20，K2HP042，調(diào)pH值5.8，將生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液按8%的接種量接入到7L(裝液量4.5L)發(fā)酵罐中，發(fā)酵初始轉(zhuǎn)速150r/min,通氣量70L/h，罐壓0.02Mp,培養(yǎng)溫度30°C。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量控制發(fā)酵液溶氧在30%以上，培養(yǎng)18h，殘?zhí)墙抵?0g/L，進(jìn)行坎利酮底物投料，投料量15g/L ;培養(yǎng)28h，培養(yǎng)基中的葡萄糖基本耗盡時(shí)，開(kāi)始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；轉(zhuǎn)化48h之后，取樣用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜PhenomsilC18 (5u，250mm X 4.6mm);流動(dòng)相為乙腈:水=6: 4(體積比)；流速1.2mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm ;柱溫25V ;進(jìn)樣量20uL ；面積歸一法檢測(cè)。58h時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)97%。實(shí)施實(shí)例2生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS，TCCC41060)，該菌在PDA斜面置于30°C恒溫培養(yǎng)3d生成黃色孢子。然后轉(zhuǎn)接在YPDA斜 面上，28°C培養(yǎng)6d，可生成金黃色孢子。于4°C冰箱保藏，IOd后使用。將10mL2%。(w/v)吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計(jì)數(shù)調(diào)整孢子懸浮濃度為 6X108f/100mL。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，調(diào)pH至5.0 6.0之間，121°C滅菌20min，每IOOmL種子培養(yǎng)基接入ImL孢子懸液，在搖床溫度28°C，190r/min培養(yǎng)20h即得種子培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，玉米漿20，酵母膏20，K2HP042，調(diào)pH值5.8，將生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液按8%的接種量接入到7L(裝液量4.5L)發(fā)酵罐中，發(fā)酵初始轉(zhuǎn)速150r/min,通氣量80L/h，罐壓0.02Mp,培養(yǎng)溫度28 V。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量控制發(fā)酵液溶氧在30%以上，培養(yǎng)20h，殘?zhí)墙抵?2g/L，進(jìn)行坎利酮底物投料，投料量18g/L ;培養(yǎng)30h，培養(yǎng)基中的葡萄糖基本耗盡時(shí)，開(kāi)始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；轉(zhuǎn)化48h之后，取樣用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜Phenomsi IC18 (5u，250mm X 4.6mm);流動(dòng)相為乙腈:水=6: 4(體積比)；流速1.2mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm ;柱溫25V ;進(jìn)樣量20uL ；面積歸一法檢測(cè)。60h時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)98 %。實(shí)施實(shí)例3生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS，TCCC41060)，該菌在PDA斜面置于28°C恒溫培養(yǎng)4d生成黃色孢子。然后轉(zhuǎn)接在YPDA斜面上，25°C培養(yǎng)5d，可生成金黃色孢子。于4°C冰箱保藏，IOd后使用。將10mL2%。(w/v)吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計(jì)數(shù)調(diào)整孢子懸浮濃度為 8X108f/100mL。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，調(diào)pH至5.0 6.0之間，121°C滅菌20min，每IOOmL種子培養(yǎng)基接入ImL孢子懸液，在搖床溫度25°C，200r/min培養(yǎng)24h即得種子培養(yǎng)液；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，玉米漿20，酵母膏20，K2HP042，調(diào)pH值5.8，將生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液按8%的接種量接入到7L(裝液量4.5L)發(fā)酵罐中，發(fā)酵初始轉(zhuǎn)速150r/min,通氣量100L/h，罐壓0.02Mp,培養(yǎng)溫度25°C。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量控制發(fā)酵液溶氧在30%以上，培養(yǎng)22h，殘?zhí)墙抵?4g/L，進(jìn)行坎利酮底物投料，投料量20g/L ;培養(yǎng)32h，培養(yǎng)基中的葡萄糖基本耗盡時(shí)，開(kāi)始以100mL/h的流速流加lL10g/L的葡萄糖溶液；轉(zhuǎn)化48h之后，取樣用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜PhenomsilC18 (5u，250mm X 4.6mm);流動(dòng)相為乙腈:水=6: 4(體積比)；流速1.2mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm ;柱溫25V ;進(jìn)樣量20uL ；面積歸一法檢測(cè)。56h時(shí)轉(zhuǎn)化率大于96%。
權(quán)利要求
1.一種坎利酮高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Ila-羥基坎利酮的方法，其特征在于以赭曲霉(Aspergillus ochraceus, TCCC41060)為生產(chǎn)菌株,經(jīng)過(guò)產(chǎn)孢和生產(chǎn)斜面制備、孢子懸液制備、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、流加葡萄糖高密度培養(yǎng)轉(zhuǎn)化底物坎利酮得到產(chǎn)物Ila-羥基坎利酮，具體步驟如下 (1)產(chǎn)孢和生產(chǎn)斜面制備 生產(chǎn)菌株為赭曲霉TCCC41060，將該菌置于PDA培養(yǎng)基上，25 30°C恒溫培養(yǎng)3 6d生成黃色孢子，然后轉(zhuǎn)接到酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基斜面上，25 30°C培養(yǎng)5 8d，生成金黃色孢子，即得生產(chǎn)斜面，于4°C冰箱保藏，保藏時(shí)間在15d以內(nèi)； (2)孢子懸液制備 將IOml質(zhì)量體積比20 %吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計(jì)數(shù)調(diào)整孢子懸浮濃度在 4X IO8 8X IO8 個(gè) /IOOml ； (3)種子培養(yǎng) 每IOOml種子培養(yǎng)基接入Iml孢子懸液，在搖床溫度25 30°C，轉(zhuǎn)速180 200r/min培養(yǎng)18 24h即得種子培養(yǎng)液； (4)發(fā)酵培養(yǎng) 將步驟(3)所述種子培養(yǎng)液按8%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初始轉(zhuǎn)速150r/min,通氣量70 100L/h，罐壓O. 02Mp,培養(yǎng)溫度25 30°C，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量控制發(fā)酵液溶氧在30%以上，培養(yǎng)18 22h，殘?zhí)墙抵?0 14g/L時(shí)，進(jìn)行坎利酮底物投料，投料量15 20g/L; (5)流加葡萄糖高密度培養(yǎng)進(jìn)行底物轉(zhuǎn)化 發(fā)酵28 32h，培養(yǎng)基中的葡萄糖基本耗盡時(shí)，開(kāi)始以100mL/h的流速流加IL IOg/L的葡萄糖溶液；取發(fā)酵液用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)坎利酮轉(zhuǎn)化率大于90%時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種坎利酮高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)11α -羥基坎利酮的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成如下，單位g/L :葡萄糖20，大豆蛋白胨20，酵母膏20，調(diào)pH至5. O 6. O 之間，121°C滅菌 20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種坎利酮高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)11α -羥基坎利酮的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下，單位g/L :葡萄糖15，玉米漿20，酵母膏20，K2HP042，調(diào)pH值 5. 8，121°C 滅菌 20min。
全文摘要
一種坎利酮高效轉(zhuǎn)化的微生物方法屬于微生物制備技術(shù)，涉及一種以赭曲霉為菌種，采取高密度培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)11α-羥基坎利酮的方法。解決了現(xiàn)有的坎利酮微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)中存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高，轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題。本發(fā)明采用高密度培養(yǎng)提高單位體積培養(yǎng)液中菌體的濃度，并使其穩(wěn)定在較高濃度，保證高轉(zhuǎn)化率的同時(shí)，縮短了轉(zhuǎn)化時(shí)間，大大降低了生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12P33/10GK103255192SQ20131009706
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者別松濤, 王家明, 路福平 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)