專利名稱：一種來(lái)源于矮沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因及其對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸，此外本發(fā)明也涉及到這些基因的克隆方法。
背景技術(shù)：
矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黃花木，屬于豆科(Leguminosae)、黃華族(Thermopsideae)、沙冬青屬(Ammopiptanthus Chengf.)，為第三紀(jì)孑遺植物，被列為國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)植物。主要分布在海拔1800 2800m的干旱荒山和石質(zhì)戈壁類型的內(nèi)蒙古西部和寧夏、甘肅、矮的部分沙漠、荒漠地帶，是該區(qū)唯一的常綠闊葉灌木，分布區(qū)內(nèi)氣候干旱，降水量遠(yuǎn)小于蒸發(fā)量，年平均氣溫6.8°C，氣溫變化極值可達(dá)70°C以上。沙冬青具有很強(qiáng)的抗逆性，在相對(duì)瘠薄的土壤條件下仍能在高達(dá)70°C左右的地表沙溫和低至零下20°C 30°C的環(huán)境中正常生長(zhǎng)發(fā)育。有很強(qiáng)的抗寒、抗旱和耐鹽堿等抗逆特性。國(guó)內(nèi)外關(guān)于沙冬青屬植物的報(bào)道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱機(jī)理及相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)；染色體數(shù)目及核型、減數(shù)分裂期染色體行為、開花物候、和引種栽培試驗(yàn)等。這些研究都證實(shí)了沙冬青抗旱耐凍的特性，因此它是珍貴的抗旱耐凍遺傳資源。I型液泡膜焦磷酸酶是由單個(gè)亞基組成的位于液泡膜上利用焦磷酸鹽(PPi)勢(shì)能作為能量在細(xì)胞內(nèi)部各個(gè)腔室形成質(zhì)子梯度的蛋白。I型液泡膜焦磷酸酶基因的表達(dá)與非生物脅迫有關(guān)，能提高植物耐鹽和干旱脅迫的耐受力；1型液泡膜焦磷酸酶能夠調(diào)節(jié)植物激素的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)由這些植物激素所介導(dǎo)的生長(zhǎng)發(fā)育過程，并且受到植物激素(如，脫落酸)的調(diào)控。矮沙冬青作為優(yōu)秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因?qū)A(chǔ)和應(yīng)用研究具有重要意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因開發(fā)研究的局限性，提供來(lái)源于植物矮沙冬青具有抗旱和耐鹽功能的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，以期應(yīng)用于其它轉(zhuǎn)基因作物中使之具有相應(yīng)的優(yōu)良的抗逆性能。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述基因序列的克隆方法。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種來(lái)源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列以及該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。上述核苷酸序列，可通過包括下述步驟的方法，從植物矮沙冬青葉片中提取總RNA、設(shè)計(jì)引物、進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序等克隆得到:
(I)總RNA的提取和純化:可采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA ;常用的RNA提取方法很多，如試劑盒法、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法、及各種改進(jìn)方法等，均可用于矮沙冬青葉片總RNA的提??；本發(fā)明中可優(yōu)選試劑盒法(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAot2.0提取試劑盒，CAT#90404-50)，進(jìn)行矮沙冬青葉片總RNA提取。純化主要是為了去除總RNA中的DNA污染，獲得純化的矮沙冬青葉片總RNA，以滿足后續(xù)對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)等需要。常用的RNA純化方法包括:DNA酶消化法(簡(jiǎn)稱D法)、酸酚變性法(簡(jiǎn)稱S法)、EDTA法(簡(jiǎn)稱E法)等；本發(fā)明中可優(yōu)選DNA酶(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2.0提取試劑盒，CAT#90404-50)消化法。(2)中間片段的克隆:
A、中間片段cDNA第一 鏈的合成
以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板,使用3’ RACE Adaptor (可優(yōu)選TaKaRa 公司 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴(kuò)增的模板。B、PCR 擴(kuò)增
以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述兼并上游引物(jf3)和兼并下游引物(jx3 )，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴(kuò)增引物可優(yōu)選為: jf3: 5’ -GGTCTTCTATGGCTTTGTTYGG-3，，
jx3: 5’ -TRGCAGARAACCAGTAAGGRAG-3’ ；
擴(kuò)增得到矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測(cè)序，得到中間片段序列。本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:
TaqPlusPCR Master Mix20 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(jx3/jf3)I UL ,
ddH2016 μ L o擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:
95°C,3min ；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min (35 個(gè)循環(huán));
72°C，8 min ;4°C保溫。(3) 3’端的克隆:
C、3，-outer PCR 擴(kuò)增
根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性上游引物GSP3-3’-outer，以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP3-3’-outer和3’端下游引物 3’-RACE outer (可優(yōu)選 TaKaRa 公司 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒)，進(jìn)行3’端outer PCR擴(kuò)增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因3’端的特異性上游outer引物可優(yōu)選為:
GSP3-3’ -outer: 5’ - TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT -3’ ；3’端下游引物3’ -RACE outer可優(yōu)選為:
3’ -RACE outer: 5’ - TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’ ；
擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 3’端。
本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-outer/3，-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個(gè)循環(huán))； 72°C，8 min ;4°C保 溫。D、3，-1nner PCR 擴(kuò)增
根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段端序列，設(shè)計(jì)并合成特異性上游引物GSP3-3’-1nner，以前述步驟C所得3’端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性上游引物GSP3_3’-1nner和3’端下游引物 3’-RACE inner (可優(yōu)選 TaKaRa 公司 3’-FulI RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒)，進(jìn)行3’端inner PCR擴(kuò)增:I型液泡膜焦磷酸酶基因3’端的特異性上游inner引物可優(yōu)選為:
GSP3-3’ -1nner: 5’ - CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT -3’ ；
3’端下游引物3’ -RACE inner可優(yōu)選為:
3’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3’ ；
擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 3’端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測(cè)序，得到3’端完整序列； 本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
3，-outer PCR 產(chǎn)物2 μ L，
2X 引物(GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nner)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個(gè)循環(huán))
72°C，8 min ;4°C保溫。(4) 5’端的克隆:
E、合成5’端的cDNA第一鏈:以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，經(jīng)過對(duì)RNA進(jìn)行預(yù)處理(可優(yōu)選Ambion 公司 FirstChoice’ RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 試劑盒)，加入 5’ RACE Adapter進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，(通過所述預(yù)處理實(shí)現(xiàn)對(duì)非完整mRNA的脫磷酸化和對(duì)完整mRNA的脫帽處理，排除非完整mRNA干擾，使得完整的mRNA能夠高效地與5’ RACE Adapter連接。)
所述5’ RACE Adapter可優(yōu)選為:
5， RACE Adapter: 5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA _3’ ；合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端的cDNA第一鏈。F、5，-outer PCR 擴(kuò)增
根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性下游引物GSP3-5’-outer，以前述步驟E所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP3-5’-outer和5’端上游引物5’ -RACE outer (可優(yōu)選FirstChoice’ RLM-RACE Kit試劑盒)，進(jìn)行5’端outer PCR擴(kuò)增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因5’端的特異性下游outer引物可優(yōu)選為:
GSP3-5’ -outer: 5’ - TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG -3’ ；
5’端上游引物5’ -RACE outer可優(yōu)選為:
5’ -RACE outer: 5’ - GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3’ ；
擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 5’端。本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:
cDNA 模板IyL,
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-outer/5，-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L。擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 個(gè)循環(huán))；
72°C，8 min ;12°C保溫。G、5，-1nner PCR 擴(kuò)增
根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性下游引物GSP3-5’ -1nner,以前述步驟F所得5’端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性下游引物GSP3-5’-1nner和5’端上游引物 5’-RACE inner (可優(yōu)選 FirstChoice’ RLM-RACE Kit 試劑盒),進(jìn)行 5’端 innerPCR擴(kuò)增:· I型液泡膜焦磷酸酶基因5’端的特異性下游inner引物可優(yōu)選為:
GSP3-5， -1nner: 5， - GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA -3，；
5’端上游引物5’ -RACE inner可優(yōu)選為:
5’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3’ ；
擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 5’端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測(cè)序，得到5’端完整序列； 本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:5，-outer PCR 產(chǎn)物I μ L，
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L))1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:
95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 個(gè)循環(huán))；
72。。，8 min，12°C保溫。(5)全長(zhǎng)序列拼接和基因分析:
將上述步驟(2)所得中間片段、步驟(3)所得3’端inner PCR擴(kuò)增序列和述步驟(4)所得5’端inner PCR擴(kuò)增序列用DNAman軟件進(jìn)行完整序列的拼接，然后通過NCBI里ORFfinder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。(6) I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆:
將上述步驟(5)所分析的完整基因序列作為模板，設(shè)計(jì)上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因擴(kuò)增引物可優(yōu)選為:
0RF3-S: 5’ - ATGGGTGCAGCCATTCTCCC -3’，
0RF3-A: 5’ - TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3’ ；
擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為完整的矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測(cè)序，即得其基因序列。本步驟中，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I yL ,
cDNA 模板I μ L ,
5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,
ddH2032.5 μ L。I型液泡膜焦磷酸酶基因擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:
98°C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個(gè)循環(huán))；
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明是一種來(lái)源于植物矮沙冬青具有抗旱和耐鹽功能的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，并首次使用RACE方法在該物種中克隆此基因，得到該基因的完整全長(zhǎng)序列。本發(fā)明克隆的I型液泡膜焦磷酸酶基因使人們對(duì)這個(gè)基因的研究對(duì)象從細(xì)菌及其他植物進(jìn)一步擴(kuò)展到矮沙冬青。并且， 根據(jù)矮沙冬青I型液泡膜焦磷酸酶的基因在酵母功能驗(yàn)證試驗(yàn)中所具備的優(yōu)良的抗旱、耐鹽等性能可以預(yù)料:如果將其通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入玉米等其他植物的基因中，將可培育出具有相應(yīng)的優(yōu)良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。


圖1為AnVPl基因電泳檢測(cè)結(jié)果圖，
圖2為AnVPl基因中間片段電泳檢測(cè)結(jié)果圖，
圖3為AnVPl基因3’端inner PCR電泳檢測(cè)結(jié)果圖，
圖4為AnVPl基因5’端inner PCR電泳檢測(cè)結(jié)果圖，
圖5為表達(dá)載體pRS6-AnVPl雙酶切鑒定的電泳檢測(cè)結(jié)果圖。圖6為酵母鹽脅迫對(duì)照試驗(yàn)中的菌斑生長(zhǎng)情況照片，圖中A、B、C、D、E分別表示培養(yǎng)基中添加的 NaCl 濃度為 O mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L,同一NaCl濃度下的3列，從左至右分別為相應(yīng)菌株的原液、5倍稀釋液和25倍稀釋液。圖7為酵母高溫脅迫對(duì)照試驗(yàn)的菌斑生長(zhǎng)情況照片，圖中A:30° C培養(yǎng)的對(duì)照菌液、B:53° C 高溫處理 2 min、C:53° C 高溫處理 4 min、D:53° C 高溫處理 6 min、E:53° C高溫處理8 min、F:53° C高溫處理10 min,同一處理時(shí)間下的3列，從左至右分別為相應(yīng)菌株的原液、5倍稀釋液和25倍稀釋液。圖8為酵母干旱脅迫對(duì)照試驗(yàn)的菌斑生長(zhǎng)情況照片，圖中同一山梨醇添加量下的3列，從左至右分別為相應(yīng)菌株的原液、5倍稀釋液和25倍稀釋液。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在下述各實(shí)施例中，將矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶簡(jiǎn)稱為。通過各實(shí)施例，最終得到來(lái)源于矮沙冬青的I型液 泡膜焦磷酸酶核苷酸序列(如SEQ ID N0.1所述)及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(如SEQ ID N0.2所述)。實(shí)施例1
本實(shí)施例為矮沙冬青葉片總RNA的提取和純化，總RNA提取使用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAOUIVci提取試劑盒，CAT#90404-50，包括下述步驟:
(I)估算組織細(xì)胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物葉片或50-100 mg植物種子或200-500 mg植物果實(shí)。(2)先將新鮮植物組織剪切成小塊(保存在RNAL0CKER中的植物組織需用紙吸去RNAL0CKER液體后再剪切成小塊)，放入10-15 mL塑料離心管中，加入I mL 65°C預(yù)熱的溶液A (用前需要搖晃混勻)，然后用勻漿器勻漿5-20秒。勻漿時(shí)會(huì)產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。也可以使用液氮硯磨法破碎植物組織，硯磨完后加入I mL溶液A，但效果比較差，因?yàn)檠欣彵举|(zhì)是二氧化硅，在溶液A存在時(shí)會(huì)吸附RNA。(3)將勻漿物或硯磨物轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL塑料離心管中(可以不必轉(zhuǎn)移非液體的細(xì)胞碎片)。有的植物組織(比如果實(shí))含有大量水份，勻漿液會(huì)多于I mL，轉(zhuǎn)移時(shí)也只取I mL。(4)在離心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自備氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。(5)室溫12000 rpm離心3_5分鐘，兩相間有約5mm厚的細(xì)胞破碎物。(6)將上清液(約0.6 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5 mL塑料離心管中，下層有機(jī)相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì),避免觸及或吸取。最好留下100 UL上清液不取。(7)加入等體積的溶液C，充分顛倒混勻。(8)將一半溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱(60911B)中，12000 rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。注意不要跟用于RNA提取的吸附柱(60911D)混用。(9)將剩下的一半溶液轉(zhuǎn)移到同一離心吸附柱中，12000 rpm室溫離心半分鐘，棄
穿透液。(10)將0.7 mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12000 rpm室溫離心10-30秒，
棄穿透液。(11) 12000 rpm室溫離心10秒以便去除殘留液體。(12)將 10 μ L (10 U)的 RNase-free DNase 加入到 50 μ L 37°C預(yù)熱的 DNA 膜反應(yīng)液中，吹打混勻配制成DNase工作液。(13)將DNase工作液在37°C預(yù)熱I分鐘，然后全部加入到離心吸附柱中，室溫放置5分鐘。注意:5分鐘一般足夠降解大多數(shù)情況下的DNA污染。如果DNA沒有徹底降解(可能由于樣品中殘留的雜質(zhì)抑制了 DNase的活性)，此步的保溫時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)到10分鐘或15分鐘。(14)直接在離心吸 附柱中加入0.7 mL通用洗柱液，蓋上蓋后顛倒數(shù)次混勻。(15) 12000 rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(16)再加0.3 mL通用洗柱液到離心吸附柱，12000 rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(17) 12000 rpm室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留乙醇會(huì)影響RNA的使用。(18)將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到RNase-free收集管中，加入30-50 μ L RNA洗脫液，室溫放置1-2分鐘。(19) 12000 rpm室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品。本產(chǎn)品提供的離心吸附柱吸附力較強(qiáng)，一次洗脫不能全部將膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50 μ LRNA洗脫液一次。實(shí)施例2
本實(shí)施例為矮沙冬青總RNA的反轉(zhuǎn)錄，其反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈用于基因中間片段和 3，端擴(kuò)增的模板，按照 Takara 公司的 3，-Full RACE Core Set Ver.2.0，Code:D314 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成。實(shí)施例3
本實(shí)施例為基因中間片段的克隆，方法如下:
以蒺藜苜蓿(FJ176929.1)為詢問序列，參考百脈根(EF440187.1)、綠豆(AB009077.1)、大豆(AK285283.1)和豇豆(U31467.1)序列設(shè)計(jì)兼并引物 jf3/jx3:jf3: 5， - GCCCAAARGAGCTTTCACTY -3 ；jx3: 5’ - GAAGMARGTGACCRGGAAGG -3’。
以實(shí)施例2的cDNA第一鏈為模板，以設(shè)計(jì)的兼并引物jf3和jx3進(jìn)行如基因cDNA中間片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為:TaqPlusPCRMaster Mix20 μ L， cDNA 模板 2 μ L ,
2Χ 引物(jx3/jf3)I UL ,
ddH2016 μ L ο擴(kuò)增程序?yàn)?95° C，5min；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min (35 個(gè)循環(huán));
72°C，8 min ;4°C保溫。取所得擴(kuò)增產(chǎn)物20 μ L經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min, GoLdenView染色后紫外線檢測(cè)擴(kuò)增片段，結(jié)果如圖2所示。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為如KW基因cDNA中間片段，通過包括下述步驟的方法克隆測(cè)序，得到的中間片段序列如SEQ ID N0.3所述:
①目的片段的回收與純化:
將擴(kuò)增出來(lái)的特異條帶用干凈刀片在紫外光下快而準(zhǔn)確的從瓊脂糖中挖出，置于1.5mL離心管中，用凝膠回收試劑盒(OMEGA公司的E.Z.N.A.TM GeL Extraction Kit)回收膠中的DNA片段；
②連接反應(yīng):
將回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD19_T載體中。連接反應(yīng)采用連接試劑盒(Takara公司)，擴(kuò)增體系總體積10 μ L，16°C連接過夜；
③感受態(tài)細(xì)胞的制備:
1、從LB平板上挑取新活化的疋coLiDH5σ單菌落，接種于3_5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C, 225 r/min振蕩培養(yǎng)12 h左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2-3 h至0D600 = 0.35-0.5左右；
I1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管，冰上放置10min，然后于4°C下3000 r/min離心10 min ；
II1、棄去上清，用預(yù)冷的0.05 moL/L的CaCL2溶液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15-30 min 后，4°C下 3000 r/min 離心 10 min ；
IV、棄去上清，加入4mL預(yù)冷含15%甘油的0.05 moL/L的CaCL2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液；
V、感受態(tài)細(xì)胞分裝成100μ L的小份，貯存于-70°C可保存半年；
④質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化:
1、從_80°C冰箱中取出一管大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞a，置于冰上融化；
I1、在無(wú)菌條件下加入10μ L連接反應(yīng)液，輕輕震搖混勻后，在冰上放置30 min ；
II1、42°C水浴熱擊90S，不要搖動(dòng)，之后迅速放入冰浴冷卻2-3 min ；
IV、加入890μ L無(wú)Amp的LB液體培養(yǎng)基，混勻后，37°C、150 r/min搖床振搖培養(yǎng)，溫育I h;
V、取100μ L已轉(zhuǎn)化的菌液涂于一個(gè)LB/Amp的培養(yǎng)平板上，正面朝上放置30 min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，用封口膜封住，然后倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，37°C避光培養(yǎng)12-16 h ;隨后篩選陽(yáng)性菌落；⑤重組菌落的鑒定與保存:從外觀上看，一般白色且圓的菌落為陽(yáng)性，通過菌液PCR進(jìn)一步鑒定:1、在過夜培養(yǎng)的平板上用滅菌的小槍頭挑取幾個(gè)白色菌落，分別點(diǎn)種于含0.1 g/LAmp的LB液體培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中，37°C，150 r/min振搖培養(yǎng)4_6h ；
I1、取IUL菌懸液作為模板，用引物jfl/jxl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件中裂解時(shí)間延長(zhǎng)至5min，用1%的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。如果產(chǎn)物為目的條帶時(shí)，此菌落為陽(yáng)性克隆，否則為陰性。同時(shí)設(shè)不加菌懸液的陰性對(duì)照；
II1、取已經(jīng)鑒定的陽(yáng)性克隆的菌落懸浮液750μ L，加入250 μ L的滅菌甘油，混勻后，用液氮速凍，置于_80°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> IV、最后送英俊生物技術(shù)公司測(cè)序，所得序列在NCBI的BLastn進(jìn)行比對(duì)分析，驗(yàn)證克隆片段是否正確。實(shí)施例4
本實(shí)施例為如基因3’端的克隆，方法如下:
(1)3，-outer PCR 擴(kuò)增:
根據(jù)實(shí)施例3得到的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性上游引物GSP3-3’ -outer，以實(shí)施例2所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP3-3’ -outer和TaKaRa 公司 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中 3’ 端下游引物3’ -RACE outer,進(jìn)行 3’ 端 outer PCR 擴(kuò)增:
GSP3-3’ -outer: 5’ - TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT -3’ ；
3’ -RACE outer: 5’ - TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’ ；
擴(kuò)增體系為:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-outer/3，-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L,
ddH2028.75 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個(gè)循環(huán))
72°C，8 min ;4°C保溫。(2) 3，-1nner PCR 擴(kuò)增:
根據(jù)實(shí)施例3得到 的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性上游引物GSP3-3’-1nner，以上述(I)所得outer PCR產(chǎn)物為模板，利用特異性上游引物GSP3-3’ -1nner和TaKaRa公司3，-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中 3，端下游引物 3，-RACE inner,進(jìn)行3’端inner PCR擴(kuò)增:
GSP3-3’ -1nner: 5’ - CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT -3’ ；
3’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3 ；擴(kuò)增體系為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nner)I yL ,
IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 μ L,
MgCl2 (25 mM)3 μ L,
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L,
ddH2028.75 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個(gè)循環(huán))；
72°C，8 min ;4°C保溫。
取所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為如KW基因3’端cDNA完整序列inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測(cè)序(同實(shí)施例3)，得到的3’端cDNA完整序列如SEQ ID N0.4所述。實(shí)施例5
本實(shí)施例為5’端擴(kuò)增的cDNA第一鏈合成:
以實(shí)施例1純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，經(jīng)過Ambion公司FirstChoiceRLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 試劑盒對(duì) RNA 處理，加入下述 5’ RACE Adapter 后，以 RandomDecamers進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄:
5， RACE Adapter: 5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA _3’ ；合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端的cDNA第一鏈。實(shí)施例6
本實(shí)施例為基因5’端的克隆，包括下述步驟:
(1)5，-outer PCR 擴(kuò)增:
根據(jù)實(shí)施例3得到的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性下游引物GSP3-5’-outer，以實(shí)施例5所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP3-5’ -outer和試劑盒 FirstChoice’ RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上游引物 5，-RACE outer，進(jìn)行 5，端outer PCR 擴(kuò)增:
GSP3-5’ -outer: 5’ - TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG -3’ ；
5’ -RACE outer: 5’ - GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3’ ；
擴(kuò)增體系為: cDNA 模板IyL,
10X PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-outer/5 ，-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA polymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L ,ddH2034.75 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個(gè)循環(huán))；72°C，8 min ;12°C保溫。(2) 5，-1nner PCR 擴(kuò)增:
根據(jù)實(shí)施例3得到的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性下游引物GSP3-5’ -1nner,以上述(I)所得outer PCR產(chǎn)物為模板，利用特異性下游引物GSP3-5’ -1nner和試劑盒FirstChoice，RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上游引物 5’-RACE inner，進(jìn)行 5’端 innerPCR擴(kuò)增:
GSP3-5， -1nner: 5， - GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA -3，；
5’ -RACE inner: 5’ - CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3 ；
擴(kuò)增體系為: 5，-outer PCR 產(chǎn)物I μ L，
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。
·
擴(kuò)增程序?yàn)?
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個(gè)循環(huán))；72°C，8 min ;12°C保溫。
取所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為如KW基因5’端cDNA完整序列inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測(cè)序(同實(shí)施例3)，得到的5’端cDNA完整序列如SEQ ID N0.5所述。實(shí)施例7
本實(shí)施例為基因全長(zhǎng)序列序列拼接和基因分析，包括下述步驟:將上述實(shí)施例3所得中間片段、實(shí)施例4所得3’端inner PCR擴(kuò)增序列和實(shí)施例6所得5’端inner PCR擴(kuò)增序列用DNAman軟件進(jìn)行完整序列的拼接，然后通過NCBI里ORFfinder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。實(shí)施例8
本實(shí)施例為AnVPl基因克隆，方法如下:以實(shí)施例7的基因分析設(shè)計(jì)上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，以實(shí)施例5所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
0RF3-S: 5’ - ATGGGTGCAGCCATTCTCCC -3’，
0RF3-A: 5’ - TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3’ ；
擴(kuò)增體系為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I yL ,
cDNA 模板I μ L ,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,
ddH2032.5 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?
98 °C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個(gè)循環(huán))；
取所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為完整的AnVPl基因序列，如SEQ ID N0.1所述；其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。實(shí)施例9
本實(shí)施例為基因兩端添加酶切位點(diǎn)，方法如下:
根據(jù)實(shí)施例8得到的基因片段，設(shè)計(jì)并合成帶Xho I酶切位點(diǎn)的上游引物vpU和帶BamHI酶切位點(diǎn)的下游引物vpD，進(jìn)行如KW基因的PCR擴(kuò)增:vpU: 5’ - AACCTCGAG(Xho I )ATGGGTGCAGCCATTCTCC -3’ ；vpD: 5’ - CTGGATCC(BamH I )TTTTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACC -3’ ；
擴(kuò)增體系為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2Χ 引物(vpU/vpD)I μ L，
cDNA 模板I μ L ,
5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μ L)0.5 yL ,
ddH2032.5 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?
94。。，2 min ；
98°C, 10 s ；68°C,2 min 30 s (30 個(gè)循環(huán))；
取所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為兩端帶有酶切位點(diǎn)的AnVPl基因，通過克隆測(cè)序(同實(shí)施例3)，驗(yàn)證擴(kuò)增片段是正確的。實(shí)施例10
本實(shí)施例為構(gòu)建轉(zhuǎn)化酵母突變菌株enal (由復(fù)旦大學(xué)蒯本科教授課題組惠贈(zèng))的表達(dá)載體pRS6-AnVPl，方法如下:
(O 實(shí)施例9擴(kuò)增的片段以及表達(dá)載體pRS6 (由本實(shí)驗(yàn)室保存)骨架的制
備:
用限制性內(nèi)切酶Xho I和BamH I按如下體系雙酶切實(shí)施例9擴(kuò)增的片段以及表達(dá)載體pRS6。雙酶切體系:
BamH I1.0 μ L
Xho I1.0 UL
IOXK Buffer2.0 μ L
DNA4.0 μ LddH2012 μ L
30 ° C酶切8小時(shí)后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收與純化(同實(shí)施例3)。(2) 表達(dá)載體pRS6_AnVPl的構(gòu)建:
用T4 DNA連接酶將經(jīng)過Xho I和BamH I雙酶切回收和純化后的AnVPl片段和pRS6線
性表達(dá)載體骨架按如下體系進(jìn)行連接。連接體系:
目的 DNA0.03 pmol
載體 DNA0.01 pmol
IOX連接酶緩沖液 2.0 yL` T4 DNA連接酶LOyL
16 ° C連接8小時(shí)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收與純化(同實(shí)施例3)。實(shí)施例11
本實(shí)施例為表達(dá)載體pRS6-AnVPl的克隆、鑒定與雙酶切檢測(cè)，方法如下:
(1)表達(dá)載體pRS6-AnVPl的克隆與鑒定:(同實(shí)施例3)` (2)表達(dá)載體pRS6-AnVPl的雙酶切檢測(cè):
將(I)鑒定的陽(yáng)性菌液按0.1:50的比列接種到新鮮的含有Amp的LB液體培養(yǎng)基，37° C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒(按OMEGA公司的質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)并用XhoI和BamHI做雙酶切鑒定(雙酶切體系同實(shí)施例10)，結(jié)果如圖5所示。(3)將酶切正確的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)菌液送英俊生物技術(shù)公司測(cè)序。實(shí)施例12
本實(shí)施例為酵母突變菌株enal的感受態(tài)制備，步驟如下:
(I)酵母菌株enal培養(yǎng)于YPD固體培養(yǎng)基上，30° C倒置培養(yǎng)。(2)挑取一個(gè)2-3 mm的單克隆菌體于3 mL YI3D液體培養(yǎng)基里，30° C，200 r/min搖床培養(yǎng)8-12 h。(3)取5 μ L培養(yǎng)物至50 mL新鮮的YH)液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至菌液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值(OD6qq)為0.15-0.3。(4) 700 r/min, 5min,室溫離心菌體，棄上清，沉淀重懸于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中。(5 ) 30。C 培養(yǎng)至 OD6qq=0.4-0.5。(6)將培養(yǎng)物平均分配到兩個(gè)50 mL的離心管中，700 r/min，室溫離心5 min。棄上清，沉淀懸浮于30 mL去離子水中。(7) 700 r/min,室溫離心 5 min。棄上清,沉淀重懸于 1.5 mL 1.1 X TE/LiAc 中。(8)將菌體重懸物轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，高速離心15 S。(9)棄上清，沉淀重懸于600 μ L的1.1 X TE/LiAC中，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。實(shí)施例13
本實(shí)施例為表達(dá)載體pRS6-AnVPl轉(zhuǎn)化酵母突變菌株enal感受態(tài)，步驟如下:
Cl)單鏈載體DNA (10 mg/mL)的制備:稱I g鮭魚精DNA溶于100 mL TE緩沖液中。用10 mL移液管反復(fù)上下抽動(dòng)使DNA分散均勻，然后置于磁力攪拌器中劇烈攪拌2-3 h直到完全溶解，或?qū)⑷芤好芊?，置冷?kù)內(nèi)攪拌過夜。分裝DNA樣品，置-20° C條件下保存。使用前，放沸水浴中至少5 min，之后置于冰浴中快速冷卻。(2)取2 μL目標(biāo)質(zhì)粒pRS6-AnVPl，同5 μ L單鏈載體DNA于L 5 mL的離心管中，再加入50 μ L酵母感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻。(2)再往里面加入0.5 mL PEG/LiAC，輕輕混勻。(3)30。C 培養(yǎng) 30 min，每隔 10 min 混勻一次。(4)再加入20 μ L DMS0，輕輕混勻。(5)42° C，水浴 20 min，每隔 5 min 混勻一次。(6)高速離心15 s,棄上清。(7)沉淀重懸于I mL YH)液體培養(yǎng)基中，30° C，搖床培養(yǎng)90 min。(8)高速離心15 s,棄上清,重懸細(xì)胞于I mL 0.9% Cw/v) NaCl中。(9)取100 UL 1/10或1/100稀釋度的混合液涂在組氨酸缺失的YNB培養(yǎng)基上，置于30° C，培養(yǎng)2-4 d，并挑選轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例14
本實(shí)施例為酵母鹽脅迫對(duì)照試驗(yàn)，步驟如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突變菌株enal及轉(zhuǎn)基因菌株enal_AnVPl的單克隆，酵母菌株WT、突變菌株enal接種至YPD液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPI接種至HIS缺失的YNB液體培養(yǎng)基中；于30° C，200rpm進(jìn)行過夜培養(yǎng)；
(2)次日按1:100比例擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6tltl=L2-1.5時(shí)，用滅菌水稀釋到各菌液的OD6tltl約為1.0 ;然后用滅菌水做5倍梯度稀釋，各得到三個(gè)不同稀釋度的菌液；
(3)從各稀釋度的菌液中取3μ L，點(diǎn)至分別添加O mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L、0.7mol/LU.0 mol/L NaCl的YB)固體鹽脅迫培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPl設(shè)置3個(gè)平行樣，分別記為 enal-AnVPl-l、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVP1-3 ；
(4)30°C倒置培養(yǎng)2-3d，觀察菌斑生長(zhǎng)情況，并照相保存，結(jié)果如圖6所示:隨著培養(yǎng)基中鹽濃度的增加，各菌種的均逐漸變差，但在同一鹽濃度下enal-AnVPl菌株的生長(zhǎng)情況都優(yōu)于enal菌株，說(shuō)明本發(fā)明所述的AnVPl基因接種到酵母菌體內(nèi)后能正常表達(dá)并是菌株顯示出耐鹽功能。實(shí)施例15
本實(shí)施例為酵母高溫脅迫對(duì)照試驗(yàn)，步驟如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突變菌株enal及轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPI的單克隆，酵母菌株WT和突變菌株enal接種至YPD液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPI接種至HIS缺失的YNB液體培養(yǎng)基中；于30° C，200rpm進(jìn)行過夜培養(yǎng)；
(2)次日按1:100比例擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_=1.2-1.5時(shí)，用滅菌水稀釋到各菌液的OD6tltl約為1.0;然后按100 μ L/管分裝至1.5ml的EP管，于53° C水浴鍋進(jìn)行高溫處理2min、4min、6min、8min、IOmin ;以30° C培養(yǎng)的菌液做對(duì)照；
(3)將處理后的菌液于4°C冰箱冷卻3 min，做5倍梯度進(jìn)行稀釋，各得到三個(gè)不同稀釋度的菌液，從各稀釋度的菌液中取3 μ L，點(diǎn)至YPD固體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPl設(shè)置 3 個(gè)平行樣，分別記為 enal-AnVPl-Ι、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVPl-3 ；
(4)30°C倒置培養(yǎng)2-3d，觀察菌斑生長(zhǎng)情況，并照相保存，結(jié)果如圖7所示。隨著水浴時(shí)間的增加，各菌種的生長(zhǎng)情況均逐漸變差，但在同樣的水浴時(shí)間下enal-AnVPl菌株的生長(zhǎng)情況都優(yōu)于enal菌株和WT菌株，說(shuō)明本發(fā)明所述的AnVPl基因接種到酵母菌體內(nèi)后能正常表達(dá)并使菌株顯示出耐高溫功能。實(shí)施例16
本實(shí)施例為酵母干旱脅迫對(duì)照試驗(yàn)，步驟如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突變菌株enal及轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPl的單克隆，酵母菌株WT和突變菌株enal接種至YPD液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPl接種至HIS缺失的YNB液體培養(yǎng)基中；于30° C，200rpm進(jìn)行過夜培養(yǎng)；
(2)次日按1:100比例擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_=1.2-1.5時(shí)，用滅菌水稀釋到菌液的OD6tltl約為1.0 ;然后用滅菌水做5倍梯度稀釋，各得到三個(gè)不同稀釋度的菌液；
(3)從各稀釋度的菌液中取3μ L，點(diǎn)至分別添加O mol/L、2.0 mol/L、3.0 mol/L D-山梨醇(Sorbitolum)的YPD固體滲透脅迫培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因菌株enal-AnVPl設(shè)置3個(gè)平行樣，分別記為 enal-AnVPl-l、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVP1-3 ；
(4)30°C倒置培養(yǎng)2-3d，觀察菌斑生長(zhǎng)情況，并照相保存，結(jié)果如圖8所示。隨著培養(yǎng)基中山梨醇濃度的增加，各菌種的生長(zhǎng)情況均逐漸變差，但在同一山梨醇濃度下enal-AnVPI菌株的生長(zhǎng)情況都優(yōu)于enal菌株和WT菌株，說(shuō)明本發(fā)明所述的AnVPl基因接種到酵母菌體內(nèi)后能正常表達(dá)并使菌株顯示出耐旱功能。序列表
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，該基因具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于:該基因的所述的核苷酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。
3.依照權(quán)利要求1所述的一種來(lái)源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步驟: (1)總RNA的提取和純化: 采用通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA。
(2)中間片段的克隆: A、中間片段cDNA第一鏈的合成 以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，以含有接頭的3’ RACE Adaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴(kuò)增的模板。
B、PCR擴(kuò)增 以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述上游引物jf3和下游引物jx3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增得到矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測(cè)序，得到中間片段序列。
(3)3，端的克隆: C、3，-outerPCR 擴(kuò)增 根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性上游引物GSP3-3’-outer，以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP3-3’-outer和3’端下游引物3’ -RACE outer,進(jìn)行3’端outer PCR擴(kuò)增: 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 3’端。
D、3，-1nnerPCR 擴(kuò)增 根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段端序列，設(shè)計(jì)并合成特異性上游引物GSP3-3’-1nner，以前述步驟C所得3’端的outer PCR產(chǎn)物為模板，利用特異性上游引物GSP3_3’-1nner和3’端下游引物3’ -RACE inner，進(jìn)行3’端inner PCR擴(kuò)增: 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 3’端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測(cè)序，得到3’端完整序列。
(4)5’端的克隆: E、合成5’端的cDNA第一鏈: 以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，對(duì)RNA進(jìn)行預(yù)處理，加入含有接頭的5’ RACE Adapter引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄: 合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端的cDNA第一鏈。
F、5，-outerPCR 擴(kuò)增 根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性下游引物GSP3-5’-outer，以前述步驟E所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP3-5’-outer和5，端上游引物5，-RACE outer，進(jìn)行5，端outer PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 5’端。
G、5，-1nner PCR 擴(kuò)增 根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段序列，設(shè)計(jì)并合成特異性下游引物GSP3-5’ -1nner,以前述步驟F所得5’端的outer PCR產(chǎn)物為模板，利用特異性下游引物GSP3-5’ -1nner和5’端上游引物5’ -RACE inner，進(jìn)行5’端inner PCR擴(kuò)增: 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為cDNA 5’端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測(cè)序，得到5’端完整序列。
(5)cDNA全長(zhǎng)序列拼接和克隆 將上述步驟(2)所得中間片段、步驟(3)所得3’端inner PCR擴(kuò)增序列和步驟(4)所得5’端inner PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行完整序列的拼接，得到完整的基因序列。
(6)I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆: 將上述步驟(4)合成5’端的cDNA第一鏈作為模板，根據(jù)上述步驟(5)的基因分析設(shè)計(jì)上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為完整的矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測(cè)序，即得其基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(I)中，采用的RNA提取方法為試劑盒法；純化方法為DNA酶消化法。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(2)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)， 擴(kuò)增體系為: TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L , cDNA 模板2 μ L , 2X 引物:jf3/jx3I UL , ddH2016 μ L o I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴(kuò)增程序分別可優(yōu)選為:95°C,3min ；95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min ;35 個(gè)循環(huán)； 72°C，8 min ;4°C保溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(3)中進(jìn)行3’-outerPCR擴(kuò)增時(shí)， 擴(kuò)增體系可優(yōu)選為: IXcDNA Dilution Buffer II8 yL , cDNA 模板2 μ L , 2X 引物:GSP3-3，-outer/3，-RACE-outerI yL , 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L ， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L , ddH2028.75 μ L。
擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s ;35 個(gè)循環(huán);72°C，8 min ;4°C保溫。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(3)中進(jìn)行3’-1nnerPCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L , 3，-outer PCR 產(chǎn)物2 μ L， 2X 引物:GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nnerI yL , IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 yL , ddH2028.75 μ L。
擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s ;35 個(gè)循環(huán);72°C，8 min ;4°C保溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(4)中進(jìn)行5’-outerPCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:cDNA 模板IyL,IOX PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , 2X 引物:GSP3-5，-outer/5，-RACE outer2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L ,ddH2034.75 μ L。
擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 個(gè)循環(huán);72°C，8 min ;12°C保溫。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(4)中進(jìn)行5’-1nnerPCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為: .5，-outer PCR 產(chǎn)物I μ L， .10Χ PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , .2X 引物:GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L , ddH2034.7 5 μ L。
擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:.95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 個(gè)循環(huán);72。。，8 min，12°C保溫。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步驟(6)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系可優(yōu)選為:dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,2X 引物:ORF3-S/ORF3-AI yL ,cDNA 模板I μ L ,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,ddH2032.5 μ L。I型液泡膜焦磷酸酶基因擴(kuò)增程序可優(yōu)選為:98°C, 30 s ；62° C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來(lái)源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該基因具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。上述基因編碼的I型液泡膜焦磷酸酶具有如SEQIDNO.2所述的氨基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本發(fā)明還公開了一種上述來(lái)源于矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法。
文檔編號(hào)C12N15/55GK103146722SQ20131010023
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者李晚忱, 雍太明, 付鳳玲, 劉艷萍, 于好強(qiáng), 鄧龍群, 佘躍輝, 周樹峰 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)